NF-κB在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展①

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NF-κB在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的研究進(jìn)展①

姜申易魯靜

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，沈陽110001)

①本文為國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81172867)。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，損害關(guān)節(jié)軟骨、骨、關(guān)節(jié)囊，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，目前病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。血管翳是引起關(guān)節(jié)破壞的病理基礎(chǔ)，主要由新生血管、增生的滑膜細(xì)胞、炎性細(xì)胞及機(jī)化的纖維素構(gòu)成，抑制血管生成的藥物被證實(shí)可有效緩解RA的病情[1]。在RA患者滑膜組織可檢測(cè)出高表達(dá)的活化的核因子(Nuclear factor，NF)

-κB[2]，NF-κB可被多種炎癥因子激活，進(jìn)而上調(diào)多種炎癥因子，促進(jìn)滑膜炎、骨和軟骨破壞，抑制骨和軟骨修復(fù)，促進(jìn)血管翳生成。RA患者NF-κB基因表達(dá)過高，其負(fù)向調(diào)節(jié)因子基因表達(dá)過低，甲氨蝶呤可以通過影響lincRNA-p21基因降低NF-κB活性，而小干擾RNA可以進(jìn)一步使NF-κB治療更具有特異性。本文就NF-κB在RA領(lǐng)域的研究做一綜述。

1NF-κB的分子結(jié)構(gòu)

NF-κB因與B細(xì)胞中免疫球蛋白κ輕鏈增強(qiáng)子中的一個(gè)11堿基對(duì)序列(κB序列)的相互作用而被發(fā)現(xiàn)，隨后在各種類型細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[3]。它由高度保守的Rel蛋白質(zhì)家族成員兩兩結(jié)合構(gòu)成同源或異源二聚體結(jié)構(gòu)。Rel蛋白質(zhì)家族氨基端均有一個(gè)300個(gè)氨基酸組成的序列，名為Rel同源結(jié)構(gòu)域(Rel Homology Domain，RHD)[4]。RHD中含有二聚體的核定位序列(Nuclear localization sequences ，NLSs)，二聚體在此處形成，此外DNA或NF-κB抑制劑(Inhibitors of NF-κB，IκB)也在此處與NF-κB結(jié)合。哺乳動(dòng)物中，Rel蛋白家族包含5個(gè)亞基：RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p50；p105)、NF-κB2(p52;p100)。RelA(p65)、RelB、c-Rel含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，所形成的的二聚體可以激活轉(zhuǎn)錄，p65/p50異源二聚體為最常見的存在形式。NF-κB1和NF-κB2被作為一個(gè)大前體合成，命名為p105和p100，分別參與NF-κB亞基的第二亞家族p50和p52的產(chǎn)生過程。這個(gè)過程由泛素/蛋白酶復(fù)合體通路介導(dǎo)，并涉及到包含錨蛋白重復(fù)序列的C端區(qū)域的選擇性降解[5]。NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)不含轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，所形成的二聚體可以抑制轉(zhuǎn)錄。盡管p50和p52的同源二聚體是NF-κB的轉(zhuǎn)錄阻滯劑，但它們通過與RelA、RelB或c-Rel形成同源二聚體參與靶基因反式激活[6]。

2NF-κB的信號(hào)通路

靜止?fàn)顟B(tài)下，NF-κB與一種調(diào)節(jié)性蛋白家族，即NF-κB抑制劑IκB結(jié)合，形成NF-κB-IκB復(fù)合體，以無活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。IκB家族成員包括IκBα、IκBβ、IκBγ和Bcl-3。IκB對(duì)NF-κB活性的抑制作用的機(jī)制最初被認(rèn)為是通過掩蓋了NF-κB二聚體的核定位序列(Nuclear localization sequences ，NLSs)，使之不能發(fā)生核移位。近期有研究指出NF-κB-IκB復(fù)合體能夠取代NF-κB的靶向DNA位點(diǎn)并將其轉(zhuǎn)移回細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[3]。細(xì)胞質(zhì)中無活性的NF-κB需要在一些炎性細(xì)胞因子等刺激作用下才能被激活，發(fā)生核移位，主要通過以下兩種途徑。

2.1經(jīng)典激活途徑抑制性NF-κB激酶(Inhibitors of NF-κB kinase,IKK)復(fù)合體是一種多聚體蛋白，它的激活可以導(dǎo)致IκB的磷酸化。一旦磷酸化，IκB就被一種多聚體泛素連接酶泛素化，被蛋白酶體降解，p65/p50的核定位序列暴露，這時(shí)p65/p50發(fā)生核移位，連接到一系列啟動(dòng)子的同源DNA序列上，并募集誘導(dǎo)基因表達(dá)所需要的轉(zhuǎn)錄零件。

2.2非經(jīng)典激活途徑與經(jīng)典激活途徑不同，非經(jīng)典激活途徑主要由TNF超家族的B細(xì)胞活化因子(B cell activating factor，BAFF)、CD40L、淋巴毒素(Lymphotoxin，LT)

-β和病毒蛋白Tax，激活NF-κB誘導(dǎo)激酶(Nuclear factor-κB inducing kinase，NIK)和IKKα，使p100發(fā)生磷酸化，繼而泛素化并被降解成p52。p52再與RelB 形成二聚體，最終RelB/p52發(fā)生核移位，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能[7]。

2.3激活的終止轉(zhuǎn)錄發(fā)生后，NF-κB活性的終止也是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)步驟。最初的研究認(rèn)為NF-κB活性的終止主要受IκB蛋白重復(fù)合成來調(diào)節(jié)，IκB與NF-κB重新結(jié)合促進(jìn)了細(xì)胞核輸出NF-κB[8]。但有研究發(fā)現(xiàn)在IκBα缺失的細(xì)胞株中，p65的轉(zhuǎn)錄活性仍能在后期降低，且能被蛋白酶體抑制劑抑制[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，由組蛋白去乙?；?Histone deacetylase-1，HDAC)取代組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(Histone acetyltranferase,HAT)減弱了NF-κB與DNA結(jié)合的能力。轉(zhuǎn)錄共激活因子p300/CBP是NF-κB的主要乙?；?，具有HAT活性，可以乙酰化組蛋白的N末端，使啟動(dòng)子區(qū)域的DNA機(jī)構(gòu)松散，促進(jìn)下游基因表達(dá)，相反HDAC起抑制作用。此外，在NF-κB激活的后期,p65通過泛素化而被降解[10]。

3NF-κB的生物學(xué)功能

NF-κB是一種廣泛存在于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，活化的NF-κB發(fā)生核移位，與DNA增強(qiáng)子或啟動(dòng)子結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的功能。NF-κB對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)具有雙重作用，因能反式激活細(xì)胞周期蛋白D1和c-myc表達(dá)，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，但又因?yàn)橐种圃鲋骋蜃覬NK的表達(dá)，也可抑制細(xì)胞增殖。NF-κB對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)也具有雙重作用：NF-κB的cIAP-1和cIAP-2靶點(diǎn)可直接纏繞和抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，但又因?yàn)镹F-κB能夠促進(jìn)壞死受體DR5、FAS配體、Bax的表達(dá)，也可促進(jìn)凋亡[11]。

4NF-κB與RA

在RA患者滑膜組織可檢測(cè)出高表達(dá)的活化的NF-κB。國內(nèi)學(xué)者韓飛等[12]用RT-PCR法檢測(cè)46例關(guān)節(jié)滑膜組織中p65、p50、NF-κB抑制因子等的mRNA表達(dá)，46例中RA患者17例，骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)患者24例，正常5例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA組NF-κB 的表達(dá)及活化水平顯著高于OA組和正常組。用原位免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)p65的核表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA組p65活性系數(shù)顯著高于OA組和正常組。這些結(jié)果表明在RA患者滑膜組織中，NF-κB及其調(diào)控基因的表達(dá)和活化水平顯著增高。

在RA的病程中，眾多炎癥細(xì)胞因子參與了關(guān)節(jié)炎癥反映、軟骨破壞和滑膜血管翳的生成。NF-κB可以通過與這些炎癥細(xì)胞因子靶基因啟動(dòng)子的κB位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)其轉(zhuǎn)錄水平影響RA的病程?；罨腘F-κB上調(diào)TNF-α、白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)

-1β、IL-6、IL-8、黏附分子、環(huán)氧化酶2等的轉(zhuǎn)錄水平，反過來TNF-α、IL-1β等炎癥因子又可以激活NF-κB，進(jìn)一步產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等炎癥因子加重RA進(jìn)展。這些細(xì)胞因子中TNF-α和IL-1β在RA中發(fā)揮主要作用。TNF-α對(duì)RA的致病機(jī)制表現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生黏附分子，導(dǎo)致局部炎癥；刺激滑膜成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2、膠原酶、金屬蛋白酶等，促進(jìn)滑膜炎、骨和軟骨破壞，抑制骨和軟骨修復(fù)；促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞生長因子釋放，促進(jìn)血管翳形成；促使滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-8及TNF-α本身而加重組織損傷[13]。IL-1β與TNF-α相似，也能促進(jìn)滑膜炎、骨破壞，抑制骨修復(fù)，與TNF-α發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進(jìn)RA的進(jìn)展。

NF-κB促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化。CD4+T細(xì)胞在被特異性抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cell，APC)提呈致敏后分化為Tho細(xì)胞，Tho細(xì)胞又在IL-4調(diào)節(jié)作用下分化為Th1和Th2細(xì)胞，IL-4在Th分化調(diào)解中起重要作用。Th1細(xì)胞通過分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β和IL-17介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，引起前炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，RA正是以Th1介導(dǎo)為核心的免疫系統(tǒng)功能紊亂性疾病。有研究用染色質(zhì)免疫沉淀法檢測(cè)體內(nèi)NF-κB對(duì)IL-4基因激活的關(guān)聯(lián)性，證明了在T細(xì)胞激活作用中，NF-κB連接到IL-4的啟動(dòng)子上，直接影響IL-4轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)向Th1細(xì)胞分化[14]。NF-κB促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖抑制其凋亡。有研究分離RA患者的滑膜成纖維細(xì)胞，用IκBα轉(zhuǎn)染，腺病毒轉(zhuǎn)染做對(duì)照，再用TNF-α刺激，用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)和免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)是否TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB控制了 FLIP在RA滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果證明了TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB控制了 FLIP在RA滑膜成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，NF-κB促進(jìn)了RA患者滑膜細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致滑膜增生，加重關(guān)節(jié)破壞[15]。

近期多項(xiàng)研究針對(duì)NF-κB尋求RA治療的新靶點(diǎn)。為觀察RA患者NF-κB及其相關(guān)基因表達(dá)水平與正常人的差異，Wang等[16]用RT-PCR檢測(cè)RA患者和正常人NF-κB負(fù)向調(diào)節(jié)因子A20黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤易位基因 (Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene，MALT)

-1、MALT-V1、A20、NF-κB 基因的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照相比，RA患者A20表達(dá)更低，NF-κB過表達(dá)，MALT1 和 MALT1-V表達(dá)下降。RA患者M(jìn)ALT1 和A20、MALT1-V1 和A20正相關(guān)，MALT1和NF-κB、MALT1-V1和NF-κB、A20 和NF-κB具有負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。而MALT1、A20、NF-κB可能與異常T細(xì)胞活性相關(guān)。A20缺乏和MALT1紊亂在中國RA患者中廣泛存在，這是RA治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

為研究RA常用藥甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)對(duì)NF-κB活性的影響，及其可能的作用機(jī)制，Spurlock等[17]對(duì)RA中長基因間RNA-p21 (lincRNA-p21)的表達(dá)、NF-κB活性，以及對(duì)MTX的應(yīng)答進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)RA患者lincRNA-p21基礎(chǔ)表達(dá)下降，NF-κB活性標(biāo)志物磷酸化p65 (RelA)基礎(chǔ)表達(dá)升高。與小劑量MTX組對(duì)比，未經(jīng)MTX治療組的lincRNA-p21表達(dá)水平更低，磷酸化p65表達(dá)水平更高。低水平lincRNA-p21有利于RA患者NF-κB活性。MTX通過一種DNA依賴性蛋白激酶催化亞基(DNA PKcs)依賴性機(jī)制增加了lincRNA-p21水平，從而降低了NF-κB活性的基礎(chǔ)水平。

為探索NF-κB的針對(duì)性治療，減少對(duì)非靶器官的影響，Zhou等[18]用6~8周雄性DBA1/J小鼠制備抗CⅡ抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型(CⅡ antibody-induced arthritis，CAIA)，用蜂毒肽來源的一種陽離子親水親脂性肽p5RHH與以NF-κB的p65亞基作為目標(biāo)的小干擾RNA(small interfer RNA，si-RNA)結(jié)合，以非共價(jià)的自我裝配成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，使si-RNA免于失活。在CAIA模型建立第4天，給予小鼠平衡鹽溶液、游離Cy5.5標(biāo)記的零亂siRNA(scrambled siRNA)或p5RHH-Cy5.5標(biāo)記的零亂siRNA的納米粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)p5RHH-p65 siRNA抑制了炎癥細(xì)胞因子表達(dá)和炎癥細(xì)胞進(jìn)入關(guān)節(jié)，防御了骨侵蝕，保存了軟骨的完整性，它有效的抑制了早期炎癥性關(guān)節(jié)炎，而不影響非靶器官p65表達(dá)，也不會(huì)在連續(xù)注射后引發(fā)體液應(yīng)答。

5新的研究方向

IL-35作為IL-12家族的新成員，與多個(gè)免疫調(diào)控環(huán)節(jié)密切相關(guān)，在小鼠膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced arthritis，CIA)模型中可以減輕關(guān)節(jié)炎癥狀已被多次證實(shí)[19]。目前IL-35對(duì)RA非T細(xì)胞的影響尚未明確，國內(nèi)學(xué)者黃斯斯等[20]對(duì)40例擴(kuò)張心肌病患者進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些患者IL-35及EBI3mRNA表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，且與紐約心臟病學(xué)會(huì)(NYHA)提出的心功能分級(jí)負(fù)相關(guān)，說明IL-35與血管生成可能相關(guān)。然而IL-35對(duì)血管生成影響的機(jī)制、信號(hào)通路尚未明確，是否可以用NF-κB信號(hào)通路解釋其對(duì)血管生成的作用機(jī)制，是否可以從抑制血管翳形成這一新的角度來解釋IL-35減輕CIA關(guān)節(jié)炎癥狀的原理，可以作為NF-κB在RA領(lǐng)域的一個(gè)新的研究方向。

6小結(jié)

NF-κB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子、黏附因子、趨化因子、生長因子、氧化應(yīng)激相關(guān)酶等的表達(dá)，在細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附、炎癥及免疫應(yīng)答等方面影響RA的發(fā)生、發(fā)展。目前NF-κB在RA領(lǐng)域的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，然而針對(duì)NF-κB的靶向治療還有諸多問題有待探討。

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[收稿2014-12-01修回2015-01-12]

(編輯倪鵬)

通訊作者及指導(dǎo)教師：魯靜(1963年-)，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制方面的研究，E-mail:lujingtan@163.com。

作者簡介：姜申易(1989年-)，女，在讀博士，主要從事類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制方面的研究，E-mail:jaddison@163.com。

中圖分類號(hào)R593.32

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)01-0119-04

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.028