芻議大鼠線栓法MCAO模型尚待完善之處*

曹澤標(biāo)，周小青，余望貽，陳娉婷，劉旺華

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410208)

芻議大鼠線栓法MCAO模型尚待完善之處*

曹澤標(biāo)，周小青△，余望貽，陳娉婷，劉旺華

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410208)

結(jié)合文獻(xiàn)及實踐認(rèn)識，發(fā)現(xiàn)大鼠線栓法大腦中動脈栓塞(MCAO)模型存在一些尚待完善之處。通過加強(qiáng)相關(guān)生理參數(shù)的研究，改良或引進(jìn)即時、客觀和可重復(fù)的模型評價手段，深化模型的病證及論治探討，重視造模后的營養(yǎng)支持及護(hù)理，必將極大地促進(jìn)模型的規(guī)范化，提高造模的成功率，降低大鼠死亡率，凸顯中醫(yī)辨證論治的特色，為缺血性中風(fēng)病的實驗研究奠定堅實的基礎(chǔ)。

大腦中動脈栓塞模型;生理參數(shù);模型評價;辨證論治;營養(yǎng)支持;護(hù)理

腦卒中以其高發(fā)病率、病死率和致殘率，已成為當(dāng)前實驗研究的熱點(diǎn)。大鼠線栓法大腦中動脈栓塞(MCAO)模型由Koizumi等［1］于1986年首創(chuàng)，后經(jīng)Zea-Longa等［2］及大量研究者的不斷改進(jìn)，現(xiàn)已成為研究缺血性腦卒中的主要模型，也被認(rèn)為是最合適的誘發(fā)血瘀證生物表征的腦缺血模型［3］871。本研究團(tuán)隊10余年來關(guān)于丹龍醒腦方的系列研究大多采用該模型，因而對模型有較深了解，發(fā)現(xiàn)既往對模型的研究多集中在造模關(guān)鍵技術(shù)的改進(jìn)，關(guān)于模型生理參數(shù)、評價手段、病證論治、營養(yǎng)支持及護(hù)理等方面的探討涉及較少，而這些同樣與實驗的成敗密切相關(guān)，故尚待完善。筆者遂結(jié)合文獻(xiàn)及實踐認(rèn)識，試作如下芻議。

1 加強(qiáng)對MCAO模型大鼠相關(guān)生理參數(shù)的研究

MCAO造模的關(guān)鍵技術(shù)有線栓的插入方式、插入深度、頭端直徑、栓塞時間等。當(dāng)前，對這些關(guān)鍵技術(shù)的探討較多，但結(jié)果不統(tǒng)一，一個重要原因即忽視了關(guān)鍵技術(shù)的確定無不以大鼠的生理參數(shù)為基礎(chǔ)。因此，有必要加強(qiáng)對大鼠相關(guān)生理參數(shù)的研究，從源頭上規(guī)范造模。與關(guān)鍵技術(shù)相應(yīng)，本模型主要生理參數(shù)有大腦中動脈(MCA)起始部與頸總動脈(CCA)分叉處之間的距離、頸總或頸外動脈及大腦前動脈內(nèi)徑、CCA走形圖及沿途較大分支所在部位等。另外，還需就這些生理參數(shù)的品系、體質(zhì)量、雌雄、鼠齡等因素的差異性進(jìn)行研究。

基于此少數(shù)學(xué)者進(jìn)行了部分研究，如徐佳等［4］采用動脈灌注顯色鑄型法，測量8只體質(zhì)量247～340 g的SD雄性大鼠MCA起始部距頸內(nèi)動脈起始部的距離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其距離在1.55～1.65 cm之間，據(jù)此研究栓線插入深度，發(fā)現(xiàn)小于等于1.60 cm的造模成功率為28.57%，大于1.60 cm的造模成功率為83.33%。Aspey等［5］分別選用3種品系的大鼠(Wistar大鼠、SD大鼠、Fisher-344大鼠)采用相同的技術(shù)進(jìn)行 MCAO造模，發(fā)現(xiàn)3組在運(yùn)動功能改善、梗死程度和死亡率等方面存在差異，進(jìn)而認(rèn)為對不同品系的大鼠在造模技術(shù)上應(yīng)有所不同。可見，生理參數(shù)及其影響因素的研究對關(guān)鍵技術(shù)的確定具有重要意義。然而國內(nèi)外對相關(guān)生理參數(shù)的研究雖有所涉及，但報道不多，且都局限于小樣本，造成結(jié)果懸殊較大，從根本上導(dǎo)致造模關(guān)鍵技術(shù)和規(guī)范化難以實施，影響造模的成功率。因此，從加強(qiáng)對造模相關(guān)生理參數(shù)的研究為切入點(diǎn)和立足點(diǎn)，將從根本上規(guī)范當(dāng)前MCAO造模方法的不統(tǒng)一，有利于提高模型和實驗的可重復(fù)性。

2 改良引進(jìn)即時、客觀和可重復(fù)模型評價手段

當(dāng)前用線栓法制備MCAO模型仍屬盲插，實驗者全憑對上述關(guān)鍵技術(shù)的控制、手下的感覺及個人經(jīng)驗等主觀即時地認(rèn)為MCA已經(jīng)被完全栓塞。從文獻(xiàn)報道造模的成功率可知，仍有相當(dāng)比例存在判斷錯誤。同時，目前對造模成功與否的評價多依賴神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積測定。前者需大鼠清醒后才能初步評價，由于麻醉、遲發(fā)性神經(jīng)元死亡、個體差異等存在，常影響超急性期的行為學(xué)判斷，雖以大鼠體征為依據(jù)，仍不能避免個人的主觀偏向，不過該法具有無創(chuàng)、能重復(fù)觀察的優(yōu)勢。腦梗死體積的測定普遍采用TTC染色，被認(rèn)為是造模成功的金標(biāo)準(zhǔn)，具有客觀、精確的特點(diǎn)。但由于再灌注24～48 h后處死取腦觀察無法重復(fù)進(jìn)行，染色后標(biāo)本很難再行其他檢測。二者各有優(yōu)劣，但都無法做到邊插線邊判斷的即時評價，因此亟需改良或引進(jìn)兼具即時、客觀和可重復(fù)等特點(diǎn)的模型評價手段。

有研究者［6］采用激光多普勒分別測量造模前后局部腦血流量并進(jìn)行評價。用牙科鉆將顱骨磨薄，作為多普勒激光探頭測量位點(diǎn)，測量并記錄造模前雙側(cè)局部腦血流量基值，并于MCAO術(shù)后即刻再次進(jìn)行測量，若局部腦血流量下降至同側(cè)梗死前測定值的35%以下，即為造模成功。經(jīng)解剖和TTC染色驗證發(fā)現(xiàn)，準(zhǔn)確率為100%，明顯高于神經(jīng)行為學(xué)評分法(86.21%)，具有良好的敏感性和準(zhǔn)確性。雖然文獻(xiàn)中未提及對局部腦血流量高于同側(cè)梗死前測定值的35%時是否可在造模過程中通過及時更換線栓，調(diào)節(jié)插入深度和角度使造模成功，但顯然是可行的。該法使盲插變?yōu)榘胍龑?dǎo)插，極大地提高了造模的成功率，減少了動物的浪費(fèi)和實驗的時間，不失為對模型即時、客觀和可重復(fù)評價手段的一種有益探索。

3 深化模型的病證及論治研究

MCAO模型作為腦缺血再灌注模型，是目前研究缺血性腦卒中的主要選擇，也常作為中醫(yī)缺血性中風(fēng)病血瘀證模型。然而筆者認(rèn)為，該模型與臨床的擬合度還有一定差距，最主要的原因在于模型造成的是一側(cè)MCA完全栓塞的大面積腦梗死，而臨床常見小動脈栓塞形成的小面積腦梗死，MCA完全栓塞的病例極少，顯然不能全面反映臨床缺血性腦卒中的實際情況。相關(guān)實驗研究也發(fā)現(xiàn)，大鼠大腦中動脈遠(yuǎn)端阻塞較近端阻塞的腦梗死體積較小，以皮質(zhì)區(qū)損傷為主，對運(yùn)動功能影響較小，存活時間較長［7］。臨床研究也顯示，缺血性中風(fēng)急性期大小動脈病變表現(xiàn)出不同的證候演變規(guī)律，大動脈病變組火證、痰證、血瘀證均較小動脈病變組發(fā)生率高，大動脈病變組證候發(fā)生率多為發(fā)病后先升高后下降;而小動脈病變組多表現(xiàn)為先下降后升高再下降［8］。可見，MCAO模型在反映臨床缺血性中風(fēng)病病證的普遍性和代表性方面有待完善。

另外，在查閱文獻(xiàn)時發(fā)現(xiàn)，對于該模型的論治，除對證的活血化瘀通絡(luò)法外，也有用逐瘀化痰開竅法、益氣活血法、化瘀補(bǔ)腎法甚至單純采用補(bǔ)腎法、健脾法等進(jìn)行治療，相應(yīng)方藥也差別較大，但都報道取得了較好的療效或能起到一定的干預(yù)作用。根據(jù)“以方測證”和“有是證用是方”的理論，有理由推測模型演變過程中還可能存在痰證、腎虛證、脾氣虛證等。在實驗中我們也發(fā)現(xiàn)，模型組多有精神萎靡、表情淡漠、活動減少、身體蜷縮、食欲減退、納差、大便稀溏、體質(zhì)量明顯減輕等癥狀和體征，提示與以上推測基本相符。當(dāng)然，具體模型主要包含哪些證，各證的發(fā)生、演變及時間窗如何將有待進(jìn)一步研究。相信通過對相關(guān)問題的探討和明晰，將極大地糾正當(dāng)前把中醫(yī)方藥當(dāng)成西藥一樣采取現(xiàn)代藥理式針對西醫(yī)病治療的局面，進(jìn)一步彰顯中醫(yī)辨證論治的特色。

4 重視造模后的營養(yǎng)支持及護(hù)理研究

如上所述，在實驗中發(fā)現(xiàn)大鼠造模后常有明顯的進(jìn)食減少、便溏、體質(zhì)量下降，不少因此而死亡，與文獻(xiàn)報道［9］基本相符。其原因可能與大面積腦梗死后味覺、咀嚼吞咽、肢體運(yùn)動功能障礙及應(yīng)激性胃潰瘍等有關(guān)。然而，大鼠日常的生命維持、組織修復(fù)、細(xì)胞增殖都需要充足的營養(yǎng)作為物質(zhì)基礎(chǔ)。如果連基本的生命都無法維持，實驗指標(biāo)的檢測也必定深受影響，極有可能無法檢出。因此，有必要對造模后大鼠進(jìn)行適時適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)支持。這與臨床發(fā)生大面積腦梗死后對患者采取腸外或腸內(nèi)營養(yǎng)支持，并根據(jù)恢復(fù)情況逐漸給予流質(zhì)、半流質(zhì)及普食等處理相符。臨床研究表明，對腦卒中患者的早期營養(yǎng)支持，在提高營養(yǎng)狀態(tài)及減少并發(fā)癥方面效果顯著，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對有營養(yǎng)風(fēng)險患者的臨床營養(yǎng)支持管理［10］。但是，目前MCAO模型大鼠仍然普遍采用與造模前一樣的顆粒狀硬質(zhì)飼料喂養(yǎng)，明顯不合乎臨床實際，反而增加了死亡率，不利于實驗的順利進(jìn)行。另外，當(dāng)前對于造模蘇醒后的護(hù)理，基本與造模前無異，并未在保暖、衛(wèi)生清潔、預(yù)防并發(fā)癥及動物福利等方面予以特殊的調(diào)護(hù)，這也是造成模型高死亡率的一個被忽視卻很重要的原因，因此有必要引起重視。

雖然造模后營養(yǎng)支持和護(hù)理如此重要，但極少有相關(guān)專題研究報道，只在個別文獻(xiàn)中有所流露，但并未引起關(guān)注。有鑒于此，筆者再次呼吁應(yīng)重視對造模后的營養(yǎng)支持及護(hù)理研究。對于營養(yǎng)支持的研究，可以采用體質(zhì)量、存活時間、死亡率等作為指標(biāo)觀察其有效性，同時還需注意營養(yǎng)支持的安全性。研究表明，腦卒中后常并發(fā)應(yīng)激性高血糖，嚴(yán)重高血糖會顯著增大腦梗死面積，加重神經(jīng)功能損傷［11］。而嚴(yán)重高血糖的發(fā)生又常與營養(yǎng)支持方式、介入的時間窗、給予營養(yǎng)的品種、劑量、頻率等密切相關(guān)。因此，必須逐一進(jìn)行探討，摸索出合理的營養(yǎng)支持方案。對于護(hù)理的探討，可用并發(fā)癥發(fā)生率、各時間段大鼠死亡率及重要微觀參數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行對比觀察。通過相關(guān)研究，將為實驗的順利開展尤其是造模后較長時間的觀察檢測提供良好的前提。

5 結(jié)語

大鼠MCAO模型問世近30年來，為缺血性中風(fēng)病的實驗研究做出了突出貢獻(xiàn)，研究者對該模型的改進(jìn)也方興未艾。相信通過加強(qiáng)對相關(guān)生理參數(shù)的研究，改良或引進(jìn)即時、客觀和可重復(fù)的評價手段，深化模型的病證及論治探討，重視造模后的營養(yǎng)支持及護(hù)理研究，必將極大地促進(jìn)模型的規(guī)范化，提高造模的成功率，降低大鼠死亡率，凸顯中醫(yī)辨證論治的特色，為缺血性中風(fēng)病的實驗研究奠定堅實的基礎(chǔ)。至于這些尚待完善之處涉及的具體實驗方案，還有待進(jìn)一步的探討。

［1］Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T，et al．Experimental studies of is-chemia brain edema．A new experimental model of cerebral embolism infarcts in the ischemia area［J］．Jpn J Stroke，1986，8: 1-8．

［2］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．stroke，1989，20(1):84-91．

［3］李樂軍，田金洲，尹軍祥，等．不同腦缺血誘發(fā)血瘀證表征模型的研究［J］．北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，30(12):816-818．

［4］徐佳，葛林寶，徐鳴曙，等．大鼠栓線法MCAO模型中栓線插入深度的研究［J］．上海實驗動物科學(xué)，2002，22(4):209-212．

［5］Aspey BS，Taylor FL，Terruli M，et al．Temporary middle cerebral artery occlusion in the rat:consistent protocol for a model of stroke and reperfusion［J］．Neuropathol Appl Neurobiol，2000，26 (3):232-242．

［6］崔景軍，何嬌君，李晶，等．大鼠大腦中動脈梗死模型的評價標(biāo)準(zhǔn)探討［J］．天津中醫(yī)藥，2013，30(1):33-35．

［7］王柳清，邵蓓，林真珍，等．大鼠大腦中動脈近端及遠(yuǎn)端阻塞腦缺血模型的腦梗死體積和行為學(xué)差異比較［J］．中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2013，21(3):259-263．

［8］高芳，扎娃，劉強(qiáng)，等．缺血性中風(fēng)急性期大小動脈病變的證候演變規(guī)律研究［J］．北京中醫(yī)藥，2013，32(7):490-493．

［9］張小沖，趙浩，馬建華，等．線栓法大鼠MCAO模型的實驗研究［J］．醫(yī)學(xué)研究雜志，2013，42(6):55-58．

［10］李改梅．腦卒中營養(yǎng)風(fēng)險患者早期營養(yǎng)支持治療的臨床價值探討［J］．臨床合理用藥雜志，2014，7(3B):106-108．

［11］石見，譚盛，吳培華，等．不同水平高血糖對大鼠局灶腦缺血損傷的影響［J］．中國神經(jīng)精神疾病雜志，2014，40(5):309-313．

Discussion on the MCAO model of rat line bolt method is still to be perfected

CAO Ze-biao，ZHOU Xiao-qing△，YU Wang-yi，CHEN Ping-ting，LIU Wang-hua
(1．Subject of Diagnostics in Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China)

combining with the literature and practice，found middle cerebral artery occlusion model(MCAO)with intraluminal thread method in rats remains to be perfect in some ways．Through the research to strengthen the related physiological parameters，modify or introduce instant，objective and repeatable model evaluation means，deepen to explore the diseases，syndrome and treatment of the model，pay attention to nutritional support，it will greatly promote the standardization of the model，improve the success rate of the model，reduce the mortality of rats，highlight the characteristics of the therapy with syndrome differentiation of TCM，and lay a solid foundation for the experimental study of ischemic stroke．

Middle cerebral artery occlusion model;Physiological parameters;Model evaluation;Syndrome differentiation;Nutritional support;Nurse

R285．5

A

1006-3250(2016)01-0044-03

2015-04-21

國家自然科學(xué)基金面上項目(81373702)-基于Wnt/βcatenin通路探討腦缺血后神經(jīng)再生及丹龍醒腦方的促進(jìn)機(jī)理研究;國家自然科學(xué)基金面上項目(81473567)-基于“土主承載”的腦缺血神經(jīng)細(xì)胞失巢凋亡及健脾補(bǔ)土法干預(yù)機(jī)理研究;國家自然科學(xué)基金青年基金項目(81202632)-從穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)探討健脾補(bǔ)土法抗腦缺血損傷機(jī)制;教育部博士點(diǎn)基金(20124323120003);湖南省自然科學(xué)基金資助項目(13JJ3097);湖南省教育廳科研項目(14B134)

曹澤標(biāo)(1990-)，男，湖南郴州人，在讀碩士，從事中醫(yī)心腦血管疾病的臨床與研究。

△通訊作者:周小青，男，教授，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:zxq5381@sohu．com。