中醫(yī)藥治療缺血性腦血管病動物實驗研究與評價方法思考*

祝日榮，任小巧△，毛 萌，王明強(qiáng)，郭慧娟，仁青加

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)研究所，北京 100029;2.西藏藏醫(yī)學(xué)院藏醫(yī)系，拉薩 850000

中醫(yī)藥治療缺血性腦血管病動物實驗研究與評價方法思考*

祝日榮1，任小巧1△，毛 萌1，王明強(qiáng)1，郭慧娟1，仁青加2

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)研究所，北京 100029;2.西藏藏醫(yī)學(xué)院藏醫(yī)系，拉薩 850000

目的:探討基于中醫(yī)藥治療缺血性腦血管病動物實驗研究和評價方法。方法:采用傳統(tǒng)文獻(xiàn)分析方法，對當(dāng)前缺血性腦血管病動物實驗進(jìn)行分析、評價。結(jié)果:目前尚缺乏缺血性腦血管病中醫(yī)證型動物模型制備的評價研究，動物模型與中醫(yī)證型相關(guān)性研究資料較少，動物模型的制備與中醫(yī)藥治療研究的關(guān)聯(lián)性考慮不周。結(jié)論:中醫(yī)藥治療缺血性腦血管病的動物實驗應(yīng)充分結(jié)合中醫(yī)臨床實際、動物解剖特點、實驗研究目的、藥物作用特點、疾病所處階段來選擇動物模型和評價指標(biāo)，要建立基于中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中動物實驗的研究與評價方法。

中醫(yī)藥;缺血性腦卒中;動物實驗;評價方法

近年來，中醫(yī)藥治療缺血性卒中的療效得到世界范圍內(nèi)專家的認(rèn)可。中醫(yī)藥治療缺血性腦血管病的療效及療效機(jī)理動物實驗研究也一直是研究者不斷探索的課題。本文采用傳統(tǒng)文獻(xiàn)分析方法，對當(dāng)前缺血腦血管病動物實驗研究進(jìn)行了分析，提出中醫(yī)藥治療缺血性腦血管病動物實驗研究療效評價存在的問題，并提出應(yīng)建立適宜中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中動物實驗研究療效及機(jī)理研究和評價方法，供研究者參考。

1 中醫(yī)藥治療缺血性卒中動物實驗研究評價

腦缺血是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有復(fù)雜的病理生理機(jī)制，主要涉及興奮性神經(jīng)毒性、酸中毒、炎癥反應(yīng)、氧化和硝化應(yīng)激、圍梗死去極化、細(xì)胞凋亡等方面。從現(xiàn)有文獻(xiàn)看，中醫(yī)藥治療缺血性卒中動物實驗研究主要用于中成藥或中藥新藥療效評價，如［1］補(bǔ)陽還五湯、丹紅注射液、清開靈、安宮牛黃丸、醒腦靜、七十味珍珠丸、二十五味珊瑚丸等;中藥材或中藥制劑治療缺血性卒中的作用機(jī)理研究，如［2］銀杏葉、川芎、紅花、丹參、紅景天、葛根、燈盞花、黃芪、三七、地龍、全蝎、水蛭等;非藥物療法治療缺血性卒中的作用機(jī)理研究，如針灸、推拿按摩、電針及中醫(yī)治療手段的作用機(jī)理研究，如外治法等。多數(shù)報道認(rèn)為，上述治療方法對缺血性腦血管病的保護(hù)作用是通過降低興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的毒性、抑制脂質(zhì)過氧化和硝化反應(yīng)、減輕炎癥反應(yīng)和抑制細(xì)胞凋亡等實現(xiàn)的，并具有多靶點、多層次、多環(huán)節(jié)的共同特點，這是中醫(yī)藥研究有別于西醫(yī)藥的最具特色的地方，這些研究結(jié)果無疑為中醫(yī)藥治療缺血性腦血管病提供了依據(jù)。但值得注意的是，上述治療缺血性腦血管病的動物實驗研究有效的藥物或治療手段方法，在臨床實際應(yīng)用中很少單獨應(yīng)用，這種現(xiàn)象可以間接說明臨床單獨應(yīng)用中醫(yī)藥療法治療缺血性腦血管病(尤其是急性缺血性腦血管病)的臨床療效尚需更多的臨床研究證明，這就需要我們針對中醫(yī)藥治療缺血性腦血管病的實驗研究進(jìn)行反思。

2 缺血性腦血管病動物實驗研究存在的問題

2.1 缺乏中醫(yī)證型動物模型制備的評價研究

動物模型的成功與否關(guān)系到對治療手段及作用機(jī)理研究的醫(yī)學(xué)價值。目前繁多的缺血性卒中動物模型尚未見統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)。從缺血性腦卒中造模方法看，局灶性梗死的模型制備可采用近端大腦中動脈直接外科阻斷，如Tamura法、Longa法、光化學(xué)誘導(dǎo)法、微栓子法等均可造成腦梗塞灶，除此之外還要評價有關(guān)測定行為障礙及恢復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)，常用的評定標(biāo)準(zhǔn)有Bederson［9］4點評分法、Longa［10］6點評分法、Zhang［11］8點評分法等;評估肢體感覺運動恢復(fù)的方法有放爪動作(paw-placing tasks:以動物的爪放在桌面上，評估動物對視覺、觸覺、胡須和本體感受刺激等作出反應(yīng)的能力)、足踏誤差試驗(foot fault test)、平行行走(beamwalking)與平行平衡(beam-balance)試驗等［12-13］;評估認(rèn)知障礙的方法，如Morris水迷宮試驗等，尤其是在以認(rèn)知功能障礙評價時，動物是否已經(jīng)發(fā)展為卒中后抑郁癥等，上述種種模型均無統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)。尤其是復(fù)合中醫(yī)病證結(jié)合缺血性腦卒中動物模型的評價問題。如通過持續(xù)力竭性游泳復(fù)合線栓法(大腦中動脈阻塞)及饑餓、疲勞、寒濕、高脂飲食等多因素復(fù)合方法復(fù)制氣虛血瘀證動物模型，然后采用線栓法阻斷大腦中動脈復(fù)制腦缺血動物模型，均可建立缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠模型，2種方法建立的模型哪種更接近臨床，沒有人進(jìn)行對比研究，將此兩種模型用于中醫(yī)藥治療缺血性腦血管病的作用機(jī)理評價時可能會產(chǎn)生不同的結(jié)果，因此對其實驗結(jié)果的評定是值得考慮的。

2.2 缺血性腦血管病動物模型與中醫(yī)證型相關(guān)性研究資料較少

腦缺血疾病動物模型的建立必須具備以下幾點:模型與原型之間有相似關(guān)系，能代替原型;通過對模型的研究應(yīng)能得出原型的信息;就中醫(yī)證候動物模型而言，所謂原型就是指中醫(yī)證候以及具有中醫(yī)特色病證結(jié)合的病理反映。判斷中醫(yī)證候動物模型成功與否的依據(jù)或標(biāo)準(zhǔn)是否符合中醫(yī)理論及現(xiàn)代研究成熟的新理論［14］。目前建立的病與證結(jié)合的腦缺血性卒中動物模型的方法很多，歸納起來可分為兩類:一是利用致病因素造成病理模型，再通過改變生理狀況使之產(chǎn)生證候表現(xiàn)，如［4-5］通過持續(xù)力竭性游泳復(fù)合線栓法(大腦中動脈阻塞)建立缺血性腦卒中氣虛血瘀證大鼠模型;二是利用致病因素造成病理模型，再注射致病物質(zhì)造成相應(yīng)證型［7］，如通過腹腔注射角叉菜膠復(fù)合線栓大腦中動脈阻塞法(MCAO)建立缺血性腦卒中火毒證大鼠模型等［6］，通過注射內(nèi)毒素制備瘀熱證腦缺血動物模型等。這些研究充分說明中醫(yī)缺血性腦血管病動物實驗取得了一定的進(jìn)展，但其研究工作還比較粗淺，表現(xiàn)在以下2個方面:一是缺乏在癥狀、體征(包括一般體征、脈象和舌象)、實驗室與特殊檢查、病因與治療反應(yīng)等5方面與人的臨床證候相符的動物模型研究的相關(guān)資料;二是缺乏上述動物模型與臨床病人相似性的比較研究。

2.3 動物模型制備與中醫(yī)藥研究的關(guān)聯(lián)性考慮不周

臨床上，缺血性卒中時血流永久停止的情況是十分罕見的，人體卒中時可能伴有相當(dāng)?shù)脑俟嘧?，且腦卒中患者自發(fā)性或藥物溶栓后的再灌注均較為滯后。如有［8］報道認(rèn)為，僅對暫時性大腦中動脈結(jié)扎(MCAO)有效的藥物或僅在再灌注模型中有效劑量下才有效的藥物，在臨床上也有效的可能性不大［3］。再如自由基清除劑替拉扎特(tirilazad)僅對暫時性MCAO模型有效，而臨床試驗中對再灌注和非再灌注患者均無效。因此，1999年腦卒中圓桌會議建議，應(yīng)首先在大鼠中完成永久性和短暫性結(jié)扎模型研究，在大規(guī)模人體試驗開始前可能還需要在貓或靈長類動物中進(jìn)一步研究。而目前中醫(yī)藥的動物實驗研究，在觀察藥物療效時不少是以短暫缺血再灌注模型來觀察藥物療效，其進(jìn)一步的療效評價仍然需要以永久性缺血模型及在貓或靈長類動物模型中進(jìn)行療效觀察的證實。而現(xiàn)有文獻(xiàn)報道中，在多個實驗?zāi)Ｐ蛣游镏虚_展同種治療藥物或治療手段研究的報道較少，因此判定其治療缺血性腦血管病有效的結(jié)論還需更多的實驗來證實。

3 基于中醫(yī)藥研究的缺血性腦血管病動物實驗研究的研究、評價方法

3.1 動物的選擇

一個好的腦缺血動物模型必須具備以下幾點［15］:一是能夠控制缺血的時間、部位和程度;二是與腦缺血相關(guān)因素如血壓、血氣、體溫、血糖等可被密切監(jiān)視或控制;三是避免其他疾病和腦血管解剖差異性影響。目前，常用的缺血性腦血管病模型可分為全腦缺血模型、局灶性缺血模型或多灶性缺血模型。在這些動物模型中采用多種不同的動物，主要有非人靈長類、犬、貓、家兔、大鼠、小鼠、沙土鼠、豚鼠等，由于動物腦血管及腦回的結(jié)構(gòu)與人類的差異，實驗中采用動物及模擬的臨床表現(xiàn)、腦組織的病理損傷程度等可能有一定的差異，如用雙血管結(jié)扎制備前腦缺血模型進(jìn)行研究時應(yīng)用沙土鼠，因沙土鼠Willis環(huán)缺損不易形成側(cè)枝循環(huán)，而用Wistar或SD大鼠進(jìn)行研究則成功率較低;而用線栓法制備局灶腦缺血模型時應(yīng)使用SD大鼠，因SD大鼠的血管變異較小，模型成功率較Wistar大鼠高［16］;再如通過大鼠MCA遠(yuǎn)端阻斷永久性MCAO模型研究不同品系大鼠的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自發(fā)高血壓大鼠(SHR)與易卒中SHR(SHRSP)大鼠的梗死面積約為Wistar大鼠的1.5倍，而SD大鼠梗死面積更大、一致性更高。在正常血壓大鼠中，F(xiàn)ischer-344的梗死面積大于Wistar與SD大鼠［17］。又如許多藥物在沙土鼠中有保護(hù)作用，而在其他種屬中可能無效。但從現(xiàn)有的研究狀況看，沙土鼠由于其特殊的結(jié)構(gòu)特點，又是雙側(cè)結(jié)扎制作全腦缺血的優(yōu)良模型。鑒于上述情況，在進(jìn)行動物實驗時要充分考慮動物的種屬對實驗結(jié)果的影響，尤其注意在不同種屬動物中進(jìn)行動物實驗不具備可比性。另外現(xiàn)有的模型均不能良好地模擬臨床實際情況，通常還與使用年輕、健康的動物有關(guān)，因患者多數(shù)年齡較大并可能伴有1種或多種疾病，如糖尿病、高血壓、心律失常等。其次，中風(fēng)時的病理生理狀態(tài)、藥物作用靶點等，如給藥時間、缺血時間、藥物劑量等。因此，在開展動物實驗研究前需根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的實驗動物。

3.2 制備符合中醫(yī)臨床實際的動物模型

就中醫(yī)缺血性腦血管病證候動物模型而言，動物模型應(yīng)具有中醫(yī)特色病證結(jié)合的病理反應(yīng)，并符合中醫(yī)理論;要在癥狀、體征(包括一般體征、脈象和舌象)、實驗室與特殊檢查、病因與治療反應(yīng)等方面都與人的臨床證候相符，才能適宜于中醫(yī)病證結(jié)合療效及機(jī)理研究。目前，用于中藥新藥療效評價及中醫(yī)藥療效機(jī)理研究的動物模型，大多是借鑒或利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的腦缺血疾病方面的實驗動物模型，包括全腦缺血模型和局部腦缺血動物模型，這些動物模型都是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“病”的模型。但由于中醫(yī)與西醫(yī)理論體系的差異，中醫(yī)臨床治病更強(qiáng)調(diào)“證型”，且“證型”也并非幾個癥狀的簡單相加，是由于氣血逆亂產(chǎn)生風(fēng)、火、痰、瘀導(dǎo)致腦脈痹阻或血溢腦脈外而致，中醫(yī)以“證型”對病因病性、邪正盛衰進(jìn)行概括，因此“證型”蘊(yùn)含著豐富的疾病信息。中醫(yī)科研工作者也早已認(rèn)識到中醫(yī)缺血性腦血管病的動物模型所蘊(yùn)含的中醫(yī)藥信息，并進(jìn)行了大量的適宜于中醫(yī)藥療效評價及機(jī)理研究的動物模型制備。綜合各家觀點認(rèn)為，在制備中醫(yī)缺血性腦血管病動物模型中，應(yīng)充分考慮導(dǎo)致模型發(fā)生的因素更貼近臨床實際，如氣虛血瘀證腦缺血動物模型的制備，首先要考慮臨床氣虛血瘀型腦缺血患者多為老年人，血管彈性較差，往往伴發(fā)高血壓、高血脂、糖尿病等，因此在動物選擇上最好用老年高血壓動物或高血糖動物，氣虛的成因多為勞累過度、失眠、脾胃功能失調(diào)，因此造模時應(yīng)適當(dāng)加入這些因素再結(jié)合病的動物模型，才更符合氣虛血瘀證腦缺血患者的臨床實際。

3.3 根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇動物模型

制備中醫(yī)缺血性腦血管病動物模型的目的主要有三，一是用于新藥研究開發(fā)的療效評價;二是用于中醫(yī)治療手段的療效及治療機(jī)理的評價，如針灸、推拿按摩、外治療法;三是用于中藥制劑上市后的作用機(jī)理研究。上述研究目的不同，在選擇動物模型時應(yīng)有所考慮。如用于新藥臨床前療效評價的動物模型，如果新藥研究的主要目的是用于缺血性腦血管病急性期的治療，治療主要目的是針對急性缺血性腦血管病，而并不是以“證”為主要治療目標(biāo)時，可以考慮以缺血性腦血管病的動物模型作為評價依據(jù)，在進(jìn)行臨床研究時也不應(yīng)該再分證型，而是對缺血性腦血管病治療效果的觀察;如果針對的是缺血性腦血管病的某種證型，就應(yīng)以“病證結(jié)合”動物模型來評價其療效，在進(jìn)入臨床研究時應(yīng)觀察其對缺血性腦血管病證型的療效;如果藥物的治療作用主要是缺血性腦血管病恢復(fù)期肢體功能的康復(fù)，動物模型應(yīng)選擇以缺血后肢體功能障礙為主要表現(xiàn)的實驗動物模型，并根據(jù)藥物的功能主治考慮制備復(fù)合動物模型。再如用于中醫(yī)治療手段的療效評價時，體現(xiàn)該治療手段療效的指標(biāo)能以臨床研究體現(xiàn)者盡量進(jìn)行臨床研究，無法在臨床研究中獲得的指標(biāo)再在動物實驗研究中探討，一是可避免由動物推演到人而產(chǎn)生的誤差，二是避免不必要的浪費。

3.4 根據(jù)藥物作用特點選擇動物模型

缺血性腦血管病的發(fā)生往往有一個動態(tài)變化過程，因此腦缺血治療應(yīng)考慮在缺血發(fā)生后何時開始用藥可能有效，即時機(jī)窗或治療時間窗(therapeutic time window)。動物模型的治療時機(jī)窗不一定能預(yù)測人的時機(jī)窗，但確定相應(yīng)的時間窗非常重要。此外［18］在一些動物模型中，藥物只在缺血發(fā)作前或再灌注時給予，而很少在再灌注后的不同時間點給藥，因此制備動物模型時最好能控制病變的程度，以便對缺血性腦血管病的病理演變過程進(jìn)行動態(tài)研究，并可動態(tài)觀察藥物治療的作用。然而，對腦缺血病人常在發(fā)病數(shù)小時后才常規(guī)給予藥物治療。如藥物是預(yù)防缺血損傷的應(yīng)在缺血前即給予藥物，藥物是保護(hù)缺血損傷的可在缺血發(fā)生時給藥，如果藥物是預(yù)防再灌注損傷的應(yīng)在再灌注前即給藥，因此研究時確定時間窗對評估方案是否有效至關(guān)重要。而腦缺血恢復(fù)藥物的給藥時間窗很可能比急性腦缺血治療的時機(jī)窗要寬。

3.5 根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇評價指標(biāo)

對于藥物療效的評價，一般應(yīng)用大小2種動物模型，至少應(yīng)測定2項結(jié)局，即梗死體積和功能反應(yīng)。要了解這些方法的遠(yuǎn)期效果就必須在急性期(1～3 d)和慢性期(7～20 d)對這些方法進(jìn)行監(jiān)測。在永久性或短暫性閉塞模型中，對急性結(jié)局(梗死體積明顯縮小)必須通過藥物治療來評估和改善，因為只有在急性期治療中(長達(dá)6 h的密切監(jiān)控)，研究所有影響結(jié)局的生理變量(血壓、體溫、葡萄糖)和臨床體征(感染體征或血管炎癥)，才能使這些變化從缺血發(fā)作一開始就得到全面評估。目前的實驗研究多在缺血發(fā)生后幾小時至24 h內(nèi)對結(jié)局進(jìn)行評估，這種評估方法與臨床腦缺血恢復(fù)治療的療效觀察有一定的距離。因此，建議對腦缺血動物恢復(fù)情況的觀察時間有必要再長些，理由是如果藥物開始有效而存活時間短，那么這種初期效果可能會隨時間的延長而延長。

總之，缺血性腦血管病的中醫(yī)藥動物實驗研究在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)充分結(jié)合中醫(yī)臨床實際，結(jié)合動物解剖特點、實驗研究目的、藥物作用特點、疾病所處階段等選擇動物模型，才能正確評價中醫(yī)藥治療缺血性腦血管病的療效及作用機(jī)理。

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Thinking of Experimental Research，Evaluation Method in the Treatment of Ischemic Cerebrovascular Diseases Based on Traditional Chinese Medicine in Animal

ZHU Ri-rong1，REN Xiao-qiao1△，MAO Meng1，WANG Ming-qiang1，GUO Hui-juan2，REN Qing-jia2
(1.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China;2.Tibetan Medical College，Lhasa 850000，China)

Objective:To investigate the idea of cerebral ischemia animal model for the traditional Chinese medicine (TCM).Methods:In this paper，using the methods of literature analysis，analyze and evaluate the cerebral ischemia animal model to discover problems of the current animal experiments research with TCM treatment，then put forward the idea of animal model for TCM treatment of stroke.Result:we lack a correct estimate of study of cerebral ischemia animal model for TCM syndromes，animal model of correlation between TCM research data is less，lack to consider in relevance to animal experiment between treatment TCM research.Conclusion:TCM treatment of ischemic stroke in animal studies should be paid more attention to the preparation of experimental animal models，and should be fully combined with clinical practice of TCM，animal anatomy characteristics，experimental purposes，to choose animal models and select evaluation index based on the characteristics of drug action.

Traditional Chinese medicine;Ischemic stroke;Animal experiments;Evalnatron method

R-332

:A

:1006-3250(2016)08-1044-04

2016-01-13

國家自然科學(xué)基金資助項目(81360575)-藏醫(yī)白脈療法對缺血性腦血管病大鼠神經(jīng)血管單元的調(diào)節(jié)作用機(jī)制究;二十味沉香丸“調(diào)隆”對卒中后PTSD大鼠腦內(nèi)GLU/GABA-Gln代謝環(huán)路的作用機(jī)制研究(81403498)

祝日榮(1989-)，女，山西人，醫(yī)學(xué)碩士，從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病證治規(guī)律及民族醫(yī)藥對其防治的研究。

△通訊作者:任小巧(1965-)，女，教授，從事中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的證治規(guī)律研究，Tel:010-64286121，E-mail:13910634157@163.com。