ELISA與RT-PCR技術(shù)在豬瘟診斷上的應(yīng)用

李 花　毛愛(ài)民　韓奇宏　陸宇超

（無(wú)錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇無(wú)錫　214021）

ELISA與RT-PCR技術(shù)在豬瘟診斷上的應(yīng)用

李 花毛愛(ài)民韓奇宏陸宇超

（無(wú)錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇無(wú)錫214021）

豬瘟是一種常見(jiàn)的疫病，危害嚴(yán)重，因此如何合理應(yīng)用相關(guān)技術(shù)做好豬瘟診斷尤為重要?；谶@樣的現(xiàn)實(shí)背景，文章以“ELISA與RT-PCR技術(shù)在豬瘟診斷上的應(yīng)用”為主要研究對(duì)象，展開深入、細(xì)致的探討與分析，希望能為今后更好應(yīng)用ELLSA技術(shù)與RT-PCR技術(shù)做好豬瘟的診斷提供一定的依據(jù)和參考。

ELLSA技術(shù)PT-PCR技術(shù)豬瘟診斷

豬瘟又稱為爛腸瘟，是一種常見(jiàn)的、急性的、接觸性的傳染性疾病，是由豬瘟病毒引起的，該疫病的顯著特點(diǎn)就是傳染性強(qiáng)，致死率高。因此，做好疫病診斷尤為關(guān)鍵。大量的養(yǎng)殖實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，ELLSA技術(shù)與RT-PCR技術(shù)對(duì)于豬瘟的診斷具有良好的效果。

1　ELLSA技術(shù)在豬瘟診斷中的應(yīng)用

1.1ELLSA技術(shù)簡(jiǎn)介

ELLSA技術(shù)主要是用來(lái)檢測(cè)豬的血清或者是血漿中是否存有豬瘟病毒抗體的一種阻斷方法，其原理是通過(guò)待測(cè)抗體和單克隆抗體與豬瘟病毒抗原的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，根據(jù)辣根過(guò)氧化物酶與底物的顯色程度來(lái)進(jìn)行判定。

1.2操作步驟

ELLSA操作主要是需要用到專用試劑盒，需要注意的是，在正式使用之前，務(wù)必要保證將其恢復(fù)到18℃～25℃的室溫，另外，在使用之前還要提前至于室溫條件下，至少1h，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性。

關(guān)于實(shí)際操作步驟，建議首先將50μl的樣品稀釋液分別滴入檢測(cè)孔和對(duì)照孔中，然后將50μl的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照分別滴入到相應(yīng)的對(duì)照孔中，需要注意的是，要及時(shí)更換不同對(duì)照孔的吸頭，防治造成感染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在上述步驟完成之后，滴入50μl的被檢測(cè)樣品于剩下的檢測(cè)空中，同樣要注意更換吸頭，避免污染。之后要注意輕輕彈動(dòng)微量反應(yīng)板，或者是輕晃振蕩器，保證反應(yīng)板中的溶液混合均勻。

之后，封條封閉微量反應(yīng)板后，置于溫度在18℃～25℃的濕箱中，孵育2h后，將反應(yīng)空中的液體洗出，用稀釋好的洗滌液洗滌3次后，于反應(yīng)孔中加入100μl的抗CSFV酶標(biāo)二抗，封條封閉反應(yīng)板之后，置于室溫條件或者是濕箱中，孵育30min后進(jìn)行洗板處理，之后于反應(yīng)孔中加入100μl的底物溶液，在室溫條件下放置10min，注意避光的同時(shí)，要注意計(jì)時(shí)是從第一孔注入完成開始的。

10min后，將終止液100μl滴入到每個(gè)反應(yīng)空中，終止反應(yīng)，需要注意的是，務(wù)必要按加酶標(biāo)二抗的順序加終止液。

在450nm處測(cè)定樣本以及對(duì)照的吸光值，也可用雙波長(zhǎng)（450nm和620nm）測(cè)定樣本以及對(duì)照的吸光度值，空氣調(diào)零。然后，按照公司計(jì)算樣本和對(duì)照的平均吸光度值，如果平均吸光度值大于0.5的話，就表明試驗(yàn)呈有效性的陰性，而陽(yáng)性對(duì)照的阻斷率應(yīng)大于50%。

1.3關(guān)于結(jié)果的判定

如果被檢樣本的阻斷率大于或等于40%，該樣本被判定為陽(yáng)性，也就可以說(shuō)明有CSFV抗體的存在；如果被檢樣本的阻斷率小于或等于30%，該樣本被判定為陰性，即可說(shuō)明沒(méi)有CSFV抗體的存在。如果被檢樣本阻斷率在30～40%之間，應(yīng)在數(shù)日后再對(duì)該動(dòng)物進(jìn)行重測(cè)。

2　RT-PCR技術(shù)在豬瘟診斷上的應(yīng)用

2.1RT-PCR技術(shù)簡(jiǎn)介

RT-PCR技術(shù)可以說(shuō)是一種分子生物技術(shù)，這種技術(shù)的簡(jiǎn)歷同時(shí)也帶動(dòng)了分子生物學(xué)的迅速發(fā)展。豬瘟病毒（CSFV）反轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)（RT-PCR），主要用于檢測(cè)疑似感染動(dòng)物的血清或組織中的CSFV的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。但是，需要注意的是，該試劑盒不能用于區(qū)分強(qiáng)弱毒。

關(guān)于該技術(shù)的原理，主要是利用異硫氰酸胍提取RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板，以引物為起點(diǎn)合成與RNA 模板互補(bǔ)的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大一倍。結(jié)果35個(gè)循環(huán)，最終使擴(kuò)增DNA 片段放達(dá)了數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增DNA片段進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見(jiàn)到DNA片段的擴(kuò)增帶。

2.2操作步驟

應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)豬瘟，主要就是要首先選定一個(gè)相對(duì)保守的基因區(qū)域，用以特異引物的合成，而后再通過(guò)這種特異引物，完成由CSFV RNA到cDNA的反轉(zhuǎn)錄。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程主要用到的試劑有：陽(yáng)性對(duì)照700μl；A液：變性液7ml；B液：醋酸鈉溶液350μl；C液：酚/氯仿/異戊醇混合液3.5ml；D液：異丙醇3.5ml；E液：70%乙醇12ml；F液：DEPC處理的滅菌去離子水900μl；G液：RNA酶抑制劑15μl；H液：RTPCR反應(yīng)液250μl；I液：反轉(zhuǎn)錄酶3μl；K液：TaqDNA聚合酶12μl；L液：礦物油300μl；M液：50倍TAE電泳緩沖液20ml；N液：溴化乙錠溶液200μl；O液：上樣緩沖液50μl。

需要注意的是，要做好試劑的保存工作，建議將試劑A、B、C、D、F、L、M、N、O液置于4℃～8℃的條件下保存，其他試劑置于-20℃的條件下保存。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中主要用到的器材有試劑盒內(nèi)配備0.2ml薄壁PCR管15個(gè)。其他需要自備的儀器設(shè)備有天平、臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、真空干燥器、制冰機(jī)、PCR儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、液氮或-70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器（2μl、20μl、200μl、1000μl）。

所有接觸CSFV病料的物品均應(yīng)合理處理，以免污染試驗(yàn)室。

實(shí)驗(yàn)主要包括以下幾個(gè)步驟：

步驟一：提取樣本

病死或撲殺的豬，取扁桃體、淋巴結(jié)等組織病變部位與健康部交界組織；待檢活豬，用注射器取血5ml，4℃保存，送試驗(yàn)室檢測(cè)。（要求病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融病料）。之后做好樣本的處理工作：

組織樣品的處理主要是稱取待檢病料0.05g置研磨器中剪碎并研磨，加入600μlA液繼續(xù)研磨。取已研磨好的待檢病料上清200μl和200μlA液，置1.5ml滅菌離心管中。

全血樣品的處理主要是待血凝后取上清200μl，置1.5ml滅菌離心管中，加入200μlA液，混勻。

陽(yáng)性對(duì)照處理主要是取200μl，置1.5ml滅菌離心管中，加入200μlA液，混勻。

陰性對(duì)照處理主要是取F液200μl，置1.5ml滅菌離心管中，加入200μlA液，混勻。

步驟二：病毒RNA的提取

取已處理的待檢樣品，每管依次加入B液30μl、C液300μl（用C液之前不要晃動(dòng)，不要吸到C液上層保護(hù)液），顛倒10次，混勻，冰浴15min，4℃10000rpm離心15min。

之后取300μl上清置于新的DEPC水處理過(guò)（進(jìn)口離心管已用DEPC水處理過(guò)）1.5ml滅菌離心管中，進(jìn)入300μl D液，混勻，置液氮3min或-70℃冰箱中30min。室溫融化，臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)中4℃15000rpm離心20min。

棄上清后沿管壁緩緩滴入1ml E液，輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉，將離心管倒扣于吸水紙上1min，真空抽干15min（以無(wú)乙醇味為準(zhǔn)）。

用9ul F液和1μl G液溶解沉淀。-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

每份總體積25μl。取21.5ul H液（用前混勻）、0.3μl G液、0.2μl I液、1μl K液、2μl樣品RNA?；靹虿⒆龊脴?biāo)記，加入L 液20μl覆蓋，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下循環(huán)：42℃ 45min，94℃3min，擴(kuò)增條件為94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s；35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7min。

稱4g瓊脂糖放于500ml錐形瓶中，加入50倍稀釋的M液200ml（取4ml M液，用雙蒸水稀釋至200ml），于微波爐中溶解，在加入20μl N液混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物15μl混合3μl O液，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于50倍稀釋的M液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

在陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)272bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無(wú)帶出現(xiàn)（引物帶除外）時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)272bp擴(kuò)增帶為豬瘟病毒陽(yáng)性，否則為陰性。

2.3注意事項(xiàng)

PCR整個(gè)試驗(yàn)分PCR反應(yīng)液配制區(qū)—配液區(qū)、模板提取區(qū)、基因擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)、模板提取區(qū)、基因擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑導(dǎo)流。

尤其需要注意的是，所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度貯存，使用時(shí)拿到室溫下，使用后立即放回。

[1]羅廷榮，莫揚(yáng)，吳文德，等. RT-PCR技術(shù)診斷豬瘟的應(yīng)用研究[J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，（3）：21-22.

[2]周靂.豬瘟的實(shí)驗(yàn)室診斷方法[J］.養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn)，2013，（15）：33-34.

[3]彭曉玲，張繼紅.豬瘟診斷方法及疫苗研究進(jìn)展[J］.新疆畜牧業(yè)，2011，（7）：55-56.