p300 RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及其在CNE-2細(xì)胞中的表達(dá)

廖志偉，羅鍵雄，喻　芳，余宏偉，莊雅靖，周同沖，劉孟忠

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095；

2.中山大學(xué)腫瘤防治中心放療科，廣東 廣州 510060；3.廣州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院，廣東 廣州 510180)

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p300 RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及其在CNE-2細(xì)胞中的表達(dá)

廖志偉1,2，羅鍵雄3，喻芳1，余宏偉1，莊雅靖1，周同沖1，劉孟忠2

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510095；

2.中山大學(xué)腫瘤防治中心放療科，廣東 廣州 510060；3.廣州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院，廣東 廣州 510180)

[摘要]目的構(gòu)建p300基因RNA干擾慢病毒載體獲得穩(wěn)定感染的人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株，以觀察CNE-2細(xì)胞中p300的表達(dá)及其功能。方法設(shè)計(jì)p300基因特異性RNA干擾靶序列，與經(jīng)HpaI和XhoI酶切后的載體連接，產(chǎn)生重組慢病毒質(zhì)粒pLL-GFP-Puro-shp300，篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定，與慢病毒包裝載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒，對(duì)病毒滴度和感染效率進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果pLL-GFP-Puro-shp300慢病毒RNA干擾載體經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)準(zhǔn)確連接測(cè)序正確，且包裝出來(lái)的病毒純化后滴度達(dá)107TU·mL-1。RT-qPCR、Western blot結(jié)果顯示感染后p300 mRNA及蛋白水平顯著下降，證明重組慢病毒對(duì)CNE-2細(xì)胞p300基因表達(dá)有明顯沉默作用。結(jié)論成功構(gòu)建靶向p300基因RNA干擾慢病毒載體，為進(jìn)一步研究p300在鼻咽癌發(fā)生過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]p300；鼻咽癌；慢病毒載體

p300是人體重要的乙?；D(zhuǎn)移酶，在食管癌[1]、肝癌[2]、乳腺癌[3]、結(jié)直腸癌[4]等惡性腫瘤組織中表達(dá)明顯增高，提示p300在腫瘤的形成、增殖、轉(zhuǎn)移中起重要作用。為進(jìn)一步明確p300在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用，本研究嘗試構(gòu)建針對(duì)p300的RNA干擾慢病毒載體并檢測(cè)其感染效率，為進(jìn)一步研究p300在鼻咽癌發(fā)生過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)，旨在探討其作為靶向治療的可能性。

1材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料及試劑人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2購(gòu)自中山大學(xué)細(xì)胞庫(kù)，293T細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)及保存于廣州永諾生物科技有限公司。慢病毒載體及包裝系統(tǒng)pLL3.7-GFP-Puro質(zhì)粒、pMD2.G(VSVG)質(zhì)粒、pMDLg/pRRE質(zhì)粒、pRSV-Rev質(zhì)粒均購(gòu)自廣州永諾生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶HpaI及XhoI購(gòu)自美國(guó)NEB公司。質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。高純質(zhì)粒小量提取試劑盒和Tran5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。Opti-MEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清及Lipofectamine 2000均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2方法

1.2.1慢病毒載體構(gòu)建根據(jù)GenBank注冊(cè)的p300(NM_001429.3)序列，利用Promega、Dharmaco和Invitrogen公司提供的RNA靶序列分析設(shè)計(jì)軟件，結(jié)合siRNA靶序列設(shè)計(jì)原則，依據(jù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，分別合成2對(duì)shRNA單鏈，兩端加上HpaI和XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。設(shè)計(jì)好的序列送至上海捷瑞生物工程有限公司合成。合成相應(yīng)的DNA單鏈，退火形成具有黏性末端的DNA雙鏈，與經(jīng)過(guò)HpaI和XhoI雙酶切的線性化pLL3.7-GFP-Puro載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Tran5α感受態(tài)細(xì)胞中，菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。選取陽(yáng)性克隆，質(zhì)粒小提，用HpaI和XhoI雙酶切電泳鑒定提取的質(zhì)粒，酶切鑒定正確的質(zhì)粒送測(cè)序。經(jīng)QIAGEN試劑盒大提測(cè)序正確的質(zhì)粒后低溫保存。針對(duì)p300的編碼序列設(shè)計(jì)的干擾序列如下：Sip300-1：5’-AACTGCACAAATGTCTAGTTCTTTTCAAGAGAAAGAACTAGACATTTGT-GCTTTTTTC-3’；3’-TTGACTCTTCTCCCTCAGATATAAAGTTCTCTTTCTTGATCTGTAAACACGAAAAAAGAG-CT-5’。Sip300-2：5’-AACTCCCCTCCTCTTCAGCACCATT-CAAGAGATGGTGCTGAAGAGGAGGGGTTTTTTC-3’；3’-TTGAGGGGAGGAGAAGTCGTGGTAAGTTCTCTACCACGA-CTTCTCCTCCCCAAAAAAGAGCT-5’。

1.2.2慢病毒包裝轉(zhuǎn)染前以無(wú)抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%~80%時(shí)，將pLL3.7-GFP-Puro-shp300載體，pMDLg/pRRE載體、pRSV-ReV載體、pMD2.G(VSVG)載體包裝混合液與相應(yīng)體積的Opti-MEM培養(yǎng)基混合，然后加入Lipofectamine 2000，室溫下溫育20 min形成DNA與Lipofectamine 2000的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入含293T細(xì)胞的培養(yǎng)基中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基10 mL，再繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集293T細(xì)胞上清液，離心、過(guò)濾取病毒濃縮液。分裝后將病毒濃縮液-80 ℃保存于病毒管中。

1.2.3慢病毒滴度測(cè)定將293T細(xì)胞以4×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，慢病毒液按10倍濃度稀釋5個(gè)濃度，將梯度稀釋的含病毒培養(yǎng)基加入各孔中，病毒感染的同時(shí)加入polybrene以增加感染效率。經(jīng)逐孔稀釋及熒光共聚焦檢測(cè)病毒滴度。病毒滴度(TU·mL-1)=GFP陽(yáng)性細(xì)胞率×細(xì)胞總數(shù)/(慢病毒液體積×慢病毒稀釋倍數(shù))

1.2.4低表達(dá)p300 CNE-2細(xì)胞株的建立復(fù)蘇CNE-2細(xì)胞接種于6孔板，采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照MOI=10，用慢病毒液轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞，感染后第2天，吸去含病毒的培養(yǎng)基，換上新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)情況。感染后，換上含適當(dāng)濃度的Puromycin的新鮮完全培養(yǎng)基，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞株。

1.2.5RT-qPCR收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用Trizol法一步提取總RNA。用M-MLV Reverse Transcriptase (美國(guó)Promega公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。注：反應(yīng)體積包括：引物、GoTaq?qPCR Master Mix、DNA模板加至總體積20 μL。將反應(yīng)管置于MiniOpticonTMRT-qPCR反應(yīng)儀。PCR反應(yīng)程序參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)p300的表達(dá)。選取GAPDH做內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算p300相對(duì)表達(dá)量。以GAPDH為內(nèi)參的目的基因引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　以GAPDH為內(nèi)參的目的基因引物設(shè)計(jì)情況

1.2.6Western Blot檢測(cè)p300蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞后提取總蛋白。Bradford方法定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜。放置質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉2 h。一抗(p300，美國(guó)Santa Cruz公司，sc-584)4 ℃過(guò)夜，TBS沖洗。用相應(yīng)的稀釋好的二抗(HRP標(biāo)記二抗，廣州永諾生物科技有限公司)37 ℃封閉1 h。ECL法顯色，曝光成像。以GAPDH(cst2118,11 000)作為內(nèi)參照。通過(guò)觀察電泳條帶的深淺強(qiáng)度判斷p300蛋白的表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1p300慢病毒干擾表達(dá)載體的酶切鑒定和測(cè)序體外合成的寡核苷酸上游單鏈和下游單鏈在體外退火后形成雙鏈DNA，與pLL3.7載體鏈接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Tran5α感受態(tài)細(xì)胞中。 用含氨芐青霉素(100 μg·mL-1)的LB平板篩選陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，分別挑取4個(gè)菌落加入含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，用高純質(zhì)粒小量提取試劑盒小提質(zhì)粒。經(jīng)HpaI和XhoI酶切電泳鑒定所提取質(zhì)粒。shp300-1質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果顯示：泳道1、2、4是連接成功的shp300-1，而泳道3表示連接未成功。shp300-2質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果顯示：泳道1、2、3、4是連接成功的shp300-2(圖1)。shp300-1和shp300-2分別挑1個(gè)(取1號(hào))送中美泰和公司進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。

圖1　shp300-1和shp300-2酶切鑒定圖

DNA測(cè)序結(jié)果中顯示shRNA片段已成功插入到pLL3.7-GFP-Puro載體，說(shuō)明成功構(gòu)建針對(duì)p300基因的RNA干擾重組質(zhì)粒pLL-GFP-Puro-shp300-1和pLL-GFP-Puro-shp300-2，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)一步擴(kuò)增菌液提質(zhì)粒用于病毒包裝。

2.2慢病毒載體感染293T細(xì)胞株以及慢病毒的包裝和滴度測(cè)定當(dāng)293T細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)達(dá)到產(chǎn)生慢病毒實(shí)驗(yàn)的要求時(shí)，將p300干擾質(zhì)粒、慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后可見(jiàn)較強(qiáng)亮度的片狀綠色熒光，同時(shí)可見(jiàn)部分293T細(xì)胞從培養(yǎng)皿壁上脫落下來(lái)，漂浮在細(xì)胞培養(yǎng)基中，說(shuō)明有部分293T細(xì)胞開(kāi)始裂解并釋放病毒到細(xì)胞培養(yǎng)基中。

本研究采用孔稀釋法檢測(cè)慢病毒滴度，第1個(gè)管中加入待測(cè)定的病毒原液10 μL，記為1E+1 μL；混勻后，取10 μL加入到第2個(gè)管中，記為1E+0 μL。重復(fù)以上操作直到最后1管。通過(guò)熒光顯微鏡觀察GFP熒光表達(dá)，1E+1組幾乎所有細(xì)胞表達(dá)GFP熒光，熒光細(xì)胞比例隨病毒稀釋而減少。在最后一個(gè)濃度1E-4 μL組的孔中可觀察到4個(gè)帶有熒光的細(xì)胞，說(shuō)明該孔至少有4個(gè)病毒顆粒感染細(xì)胞，經(jīng)過(guò)計(jì)算LV-shp300-1生產(chǎn)的病毒液滴度達(dá)到4.0×107TU·mL-1，同樣的方法測(cè)得LV-shp300-2生產(chǎn)的病毒液滴度達(dá)到5.0×107TU·mL-1(圖2)。收集病毒原液備用。進(jìn)行下一步RT-qPCR和Western Blot驗(yàn)證干擾效果。

圖2　不同濃度的慢病毒感染

2.3重組慢病毒對(duì)CNE-2細(xì)胞p300基因表達(dá)及蛋白表達(dá)的影響利用合成的shp300-1和shp300-2病毒液分別感染CNE-2細(xì)胞，感染3 d后可在熒光顯微鏡下觀察到GFP的表達(dá)，進(jìn)一步用Puromycin篩選1周后，鏡下可見(jiàn)NC組和2個(gè)shp300組出現(xiàn)密集熒光細(xì)胞，提示慢病毒載體系統(tǒng)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入CNE-2細(xì)胞，并且感染率高于95%。

為了明確CNE-2細(xì)胞感染pLL3.7-GFP-shp300后p300蛋白的變化，我們首先利用Western blot研究了pLL3.7-GFP-shP300-1、pLL3.7-GFP-shP300-2對(duì)CNE-2中p300蛋白水平抑制作用。各組中GAPDH的表達(dá)量基本相同，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。pLL3.7-GFP-shP300-1和pLL3.7-GFP-shP300 -2組p300蛋白的表達(dá)量都有所降低。見(jiàn)圖3。

圖3　Western Blot檢測(cè)p300蛋白的表達(dá)情況

由于pLL3.7-GFP-shp300-1組干擾效果較好，所以進(jìn)一步選用pLL3.7-GFP-shp300-1組進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)p300的mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，pLL3.7-GFP-shp300 -1慢病毒感染細(xì)胞后p300的mRNA明顯下降(1.2±0.2vs0.3±0.1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

組蛋白乙?；且环N重要的表觀遺傳修飾方式，p300是一種能與腺病毒癌蛋白E1A相互作用的有多結(jié)構(gòu)域的大分子蛋白質(zhì),其相對(duì)分子質(zhì)量為300 000。p300作為組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，能乙?；?種核心組蛋白，削弱DNA與組蛋白之間以及2個(gè)核小體之間的相互作用，從而破壞高度有序的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，使轉(zhuǎn)錄因子易于與DNA結(jié)合，使RNA聚合酶Ⅱ能順利通過(guò)核小體陣列，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。p300與惡性腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系,在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等多種生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5-6]。p300被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中高表達(dá)，如黑色素瘤[7]、乳腺癌[3]、肺癌[8]、肝癌[2]和食管癌[1]等。我們前期的研究[9]發(fā)現(xiàn)，p300的mRNA及蛋白水平在鼻咽癌組織中較正常鼻咽黏膜組織明顯升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)p300過(guò)表達(dá)與鼻咽癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)，p300上調(diào)患者 5 a 生存率及無(wú)進(jìn)展生存率明顯下調(diào)[9]。盡管今年來(lái)調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)聯(lián)合化療提高了鼻咽癌的腫瘤控制率并改善患者的生存狀況[10]，但局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是其治療失敗主要原因。進(jìn)一步明確p300在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的功能及其分子機(jī)制將有助于發(fā)展鼻咽癌新的治療措施，從而進(jìn)一步提高患者生存率。

目前基因功能的鑒定，通常使用gain-of-function和loss-of-function，即分別在細(xì)胞和個(gè)體水平,做該基因的超表達(dá)和基因敲除,從表型分析該基因的功能。上調(diào)或下調(diào)p300基因的表達(dá)，必須首先獲得p300過(guò)表達(dá)和p300穩(wěn)定干擾的細(xì)胞表型。RNA干擾技術(shù)是基因沉默有力工具，已成為分子生物學(xué)研究主要技術(shù)手段之一。通過(guò)RNA干擾技術(shù)導(dǎo)致同源mRNA降解，從而選擇性抑制相關(guān)基因的表達(dá)。質(zhì)粒介導(dǎo)RNA干擾有局限性，由于基因抑制表達(dá)作用弱、持續(xù)時(shí)間短，無(wú)法保證基因的轉(zhuǎn)染效率，不適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。慢病毒載體是當(dāng)今基因治療載體的熱點(diǎn)，能夠提供高效的基因轉(zhuǎn)移，表達(dá)穩(wěn)定，可操控性強(qiáng)[11-12]。本研究采用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)確保慢病毒載體系統(tǒng)安全性，該系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒。病毒感染目的細(xì)胞不會(huì)再感染其他細(xì)胞，不會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。慢病毒介導(dǎo)RNA干擾能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)siRNA，可以長(zhǎng)期抑制基因表達(dá)。

利用慢病毒載體抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的p300表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道，本研究針對(duì)p300基因設(shè)計(jì)2個(gè)特異性siRNA靶序列，成功構(gòu)建以GFP為報(bào)告基因的p300 shRNA慢病毒載體，經(jīng)酶切和測(cè)序顯示載體構(gòu)建成功。利用慢病毒載體pLL3.7-GFP-Puro介導(dǎo)shp300感染鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，結(jié)果顯示，慢病毒可高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)入鼻咽癌CNE-2細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高于95%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)shp300-1的干擾效率最高，其明顯下調(diào)CNE-2細(xì)胞p300 mRNA和蛋白的表達(dá)。病毒滴度可以反映病毒感染靶細(xì)胞的能力及效率，是評(píng)價(jià)包裝細(xì)胞分泌感染性病毒顆粒的主要指標(biāo)。本研究包裝的慢病毒滴度達(dá)107TU·mL-1，進(jìn)一步濃縮純化后可以滿足體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的要求，為下一步動(dòng)物活體RNA干擾實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of a Lentivirus Interfering Vector Carrying p300

Gene with RNA Interfering and Its Expression in the CNE-2 Cells

Liao Zhiwei1,2,Luo Jianxiong3，Yu Fang1，Yu Hongwei1,Zhuang Yajing1，Zhou Tongchong1，Liu Mengzhong2

(1.DepartmentofRadiationOncology,theTumourHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalUniversity,

Guangzhou510095,China;2.DepartmentofRadiationOncology,CancerCenter,SunYat-senUniversity,

Guangzhou510060,China;3.TheThirdClinicalCollegeofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China)

[Abstract]ObjectiveTo construct a lentiviral vector carrying p300 gene with RNA interfering,and to establish human nasopharyngeal carcinoma cells with stably inhibited p300.MethodsTwo pairs of small hairpin RNA specific for p300 were designed,synthesized and cloned into the pLL3.7-GFP-Puro vector.Then,the lentivirual plasmid was transfected with the other two packaging plasmids into 293T cells to product and amplify lentivirus.After the infection of lentivirus mediated siRNA-p300,the mRNA and protein expression of p300 were observed.ResultsThe lentivirus vector of siRNA-p300 was constructed successfully.The virus titres were above 107TU·mL-1.pLL-GFP-Puro-shp300 was effective to inhibit p300 expression in mRNA and protein levels of CNE-2 cells.ConclusionA lentiviral vector carrying p300 gene with RNA interfering is successfully constructed.This study lays a foundation for further study of mechanisms of p300 in the nasopharyngeal carcinoma.

[Key words]p300; nasopharyngeal carcinoma; lentiviral vector

收稿日期：(2015-03-30)

[中圖分類號(hào)]R739.63；R730.23

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-5412(2015)06-0464-05

作者簡(jiǎn)介：廖志偉(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤放療研究。E-mail:liaozhiwei1110@163.com

基金項(xiàng)目：廣州醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(編號(hào)：2013A002)；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(編號(hào)：20141A011092)

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.06.002