胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)預(yù)測(cè)胚胎毒性替代方法進(jìn)展

程樹(shù)軍，秦　瑤，喻　歡，陳　彧,

(1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣州　510623; 2. 廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州　510623;3. 廣州市華代生物科技有限公司，廣州　510623; 4.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,廣州　510080)

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胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)預(yù)測(cè)胚胎毒性替代方法進(jìn)展

程樹(shù)軍1,2，秦瑤3，喻歡4，陳彧1,3

(1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣州510623; 2. 廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510623;3. 廣州市華代生物科技有限公司，廣州510623; 4.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,廣州510080)

【摘要】小鼠胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(EST)是通過(guò)ECVAM正式驗(yàn)證的胚胎和發(fā)育毒性的動(dòng)物試驗(yàn)替代方法。在新技術(shù)的推動(dòng)下，多項(xiàng)優(yōu)化的EST方法通過(guò)基因轉(zhuǎn)染、利用人來(lái)源的干細(xì)胞、增加檢測(cè)通量、組合檢測(cè)終點(diǎn)、量化檢測(cè)指標(biāo)等方式，提高了EST方法預(yù)測(cè)胚胎毒性的科學(xué)相關(guān)性和檢測(cè)效率。在整合測(cè)試策略的原則之下，經(jīng)過(guò)大規(guī)模化學(xué)物質(zhì)的前驗(yàn)證和標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)，新的EST方法可單獨(dú)或作為組合試驗(yàn)的一部分可以應(yīng)用于先導(dǎo)藥物的研發(fā)和化學(xué)品的胚胎毒性預(yù)測(cè)及機(jī)制研究。

【關(guān)鍵詞】胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)；胚胎和發(fā)育毒性；替代方法；預(yù)測(cè)

胚胎干細(xì)胞是毒性預(yù)測(cè)的有用工具，2003年，歐洲替代方法驗(yàn)證中心(european centre for validation of alternative methods, ECVAM)發(fā)布了通過(guò)驗(yàn)證的胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)方法(embryonic stem cell test，EST)，成為胚胎和發(fā)育毒性動(dòng)物試驗(yàn)的三個(gè)替代方法之一[1]。經(jīng)典的EST方法周期偏長(zhǎng)、通量低，形態(tài)觀察的檢測(cè)終點(diǎn)量化程度低。10多年來(lái)，傳統(tǒng)的EST方法已取得了重要進(jìn)展，例如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS)技術(shù)的革命性突破，解決了測(cè)試系統(tǒng)來(lái)源困難的問(wèn)題[2]；基于微孔培養(yǎng)技術(shù)與流式標(biāo)志物分析的高通量測(cè)試提高了定量檢測(cè)毒性終點(diǎn)的效率[3-4]；“組”學(xué)技術(shù)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)的運(yùn)用優(yōu)化了檢測(cè)終點(diǎn)的特異性[5-6]。技術(shù)上的進(jìn)步提高了EST方法的適用范圍，為胚胎干細(xì)胞應(yīng)用于毒性機(jī)制研究和預(yù)測(cè)研究提供了快速發(fā)展的機(jī)遇，同時(shí)也對(duì)這些優(yōu)化方法的驗(yàn)證提出了挑戰(zhàn)。

1驗(yàn)證的EST方法

德國(guó)動(dòng)物試驗(yàn)替代方法評(píng)價(jià)中心(Centre for Documentation and Evaluation of Alternative Methods to Animal Experiments, ZEBET)于1997年建立了利用兩種小鼠細(xì)胞系(成纖維細(xì)胞3T3和胚胎干細(xì)胞D3)進(jìn)行胚胎毒性測(cè)試的替代方法，2003年，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的EST方法通過(guò)了ECVAM的驗(yàn)證[1]。2009年，采用E14Tg2A小鼠胚胎干細(xì)胞系的EST 方法發(fā)布成為SN標(biāo)準(zhǔn)[7]。EST方法采用了兩種細(xì)胞，其中mES(胚胎干細(xì)胞)代表胚胎組織，3T3成纖維細(xì)胞代表成體組織。試驗(yàn)由三個(gè)程序組成，分別是檢測(cè)受試物的mES細(xì)胞毒性、3T3細(xì)胞毒性和檢測(cè)抑制胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的能力。ES細(xì)胞分化抑制實(shí)驗(yàn)為EST方法的關(guān)鍵，實(shí)驗(yàn)時(shí)mES細(xì)胞先進(jìn)行懸滴培養(yǎng)，3 d后將形成的胚胎體(embryoid bodies，EB)轉(zhuǎn)移至含有不同濃度化學(xué)物培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后再將其接種在含相應(yīng)化學(xué)物濃度的24孔組織培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后在相差顯微鏡下進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)含搏動(dòng)心肌細(xì)胞的孔數(shù)，與對(duì)照組相比，得出不同濃度化學(xué)物抑制ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的百分比。根據(jù)濃度-反應(yīng)曲線計(jì)算ES細(xì)胞分化抑制50%的化學(xué)物濃度(ID50)。

實(shí)驗(yàn)得到3個(gè)毒理學(xué)反應(yīng)終點(diǎn)的參數(shù)，分別是① ES細(xì)胞半數(shù)分化抑制濃度(ID50)；② 3T3細(xì)胞半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(IC503T3)；③ ES細(xì)胞半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度(IC50ES)。ECVAM驗(yàn)證的預(yù)測(cè)模型把試驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)化為線性判別函數(shù)，通過(guò)公式分別計(jì)算判別值Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。Ⅰ=5.916 Ig(IC503T3) + 3.500 Ig (IC50ES) - 5.307 [(IC503T3-ID50) / IC503T3] -15.27，Ⅱ=3.651 Ig (IC503T3) + 2.394 Ig (IC50ES) - 2.033 [(IC503T3-ID50) / IC503T3] - 6.85，Ⅲ=-0.125 Ig (IC503T3) - 1.917 Ig (IC50ES) +1.500 [(IC503T3-ID50) / IC503T3] - 2.67。最后根據(jù)判別值預(yù)測(cè)胚胎毒性并分類。無(wú)胚胎毒性：Ⅰ>Ⅱ且Ⅰ>Ⅲ；弱胚胎毒性：Ⅱ>Ⅰ且Ⅱ >Ⅲ；強(qiáng)胚胎毒性：Ⅲ>Ⅰ且Ⅲ>Ⅱ。驗(yàn)證研究表明EST試驗(yàn)的總預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度可達(dá)78%。

EST方法是快速篩查環(huán)境污染物胚胎毒性的可靠方法，如用于環(huán)境雌激素、三唑類殺菌劑、酚、酞酸酯、農(nóng)藥等的評(píng)估。也可以用于工程納米材料胚胎毒性的研究，如研究表明用金或硅烷包被的鈷鐵氧體納米顆粒分類為非胚胎毒性，而其它納米顆粒如金鹽、鈷鐵氧鹽等分類為弱胚胎毒性。EST試驗(yàn)很少發(fā)現(xiàn)假陰性結(jié)果，但值得注意的是有些特異性抑制其它組織發(fā)育，如腭區(qū)、四肢或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的致畸物，可能在標(biāo)準(zhǔn)EST中檢測(cè)不出。

2試驗(yàn)系統(tǒng)的優(yōu)化

2.1人ES源多能干細(xì)胞

有研究采用兩種人的胚胎干細(xì)胞系H9和LSJ-1，誘導(dǎo)分化3 d后形成單層多能干細(xì)胞，受試物作用后檢測(cè)內(nèi)胚層細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SOX17核轉(zhuǎn)錄的減少情況。對(duì)已知體內(nèi)效應(yīng)的71種藥物相關(guān)化合物的致畸作用研究表明，當(dāng)閾值設(shè)為5 μm時(shí)，精確性為94%(97%敏感性和92%特異性)。進(jìn)一步研究15種理化特性不同于小分子藥物的環(huán)境毒物，發(fā)現(xiàn)與體內(nèi)致畸作用高度一致[3]。胚胎毒性預(yù)測(cè)的體外方法最好選擇人來(lái)源的細(xì)胞，這也是“基于胚胎干細(xì)胞的新的替代試驗(yàn)”歐洲研究聯(lián)盟(Embryonic Stem cell-based Novel Alternative Testing Strategies，ESNATS)達(dá)成的共識(shí)，在聯(lián)盟合作框架下，已開(kāi)發(fā)了多個(gè)基于人胚胎干細(xì)胞(hESC)的方法，覆蓋發(fā)育過(guò)程的不同方面。如NKK系統(tǒng)模擬早期多胚層的分化，UKNI系統(tǒng)模擬特定的神經(jīng)內(nèi)胚層的分化，UKN2系統(tǒng)，也稱為“神經(jīng)嵴遷移抑制試驗(yàn)(migration of neural crest cell， MINC)，用于評(píng)估對(duì)神經(jīng)分化有影響的胚胎毒性?？梢?jiàn)把胚胎發(fā)育不同階段進(jìn)行細(xì)分類，在ES細(xì)胞定向分化過(guò)程中給予毒性干預(yù)是建立特異性EST替代方法的有效途徑。

1.2誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)具有與人ES細(xì)胞相同的分化能力，在毒理學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛，而且不涉及生物學(xué)倫理問(wèn)題。例如反應(yīng)停的毒性測(cè)試，已證明利用嚙齒類動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與人存在極大的差異性，同樣mEST 方法的預(yù)測(cè)分類為弱胚胎毒性。因?yàn)榉磻?yīng)停的作用機(jī)制在于抑制對(duì)四肢發(fā)育的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用的泛素連接酶的活性，采用檢測(cè)心肌分化為終點(diǎn)的傳統(tǒng)EST方法顯示其特異性不足。如果采用來(lái)源于人骨髓單核細(xì)胞的iPS檢測(cè)反應(yīng)停的胚胎毒性則結(jié)果為強(qiáng)胚胎毒性。類似的情況也出現(xiàn)在抗癲癇藥丙戊酸鈉的檢測(cè)中，因此來(lái)源于人的iPS建立的試驗(yàn)系統(tǒng)比mEST 方法預(yù)測(cè)性更好[2]

1.3轉(zhuǎn)染熒光素酶

EST試驗(yàn)周期長(zhǎng)達(dá)10 d，如果把心肌分化的檢測(cè)指標(biāo)提前可以縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。早期嘗試將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)GFP熒光直觀判斷反應(yīng)終點(diǎn)，GFP的表達(dá)在第7天達(dá)到高峰[4]。Suzuki等[8]用心臟和神經(jīng)冠衍生物表達(dá)轉(zhuǎn)錄蛋白1(Hand 1)或心肌病相關(guān)蛋白1(Cmya 1)基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ESC細(xì)胞為測(cè)試系統(tǒng)，建立了96孔板檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的方法，稱為“Hand 1-Cmya 1-ESTs”。Hand 1和Cmya 1在心臟的早期發(fā)育過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，可以代替心肌跳動(dòng)作為毒性效應(yīng)的終點(diǎn)，檢測(cè)時(shí)間可縮短到6 d。由于只轉(zhuǎn)染Hand 1基因的細(xì)胞較轉(zhuǎn)染兩個(gè)基因的細(xì)胞熒光素酶的信號(hào)強(qiáng)，最新優(yōu)化的方案稱為“Hand 1-Luc ESTs”方法，進(jìn)一步縮短檢測(cè)時(shí)間至5 d[9]。

3檢測(cè)終點(diǎn)及組合

3.1場(chǎng)電位

傳統(tǒng)EST方法以顯微鏡觀察跳動(dòng)的心肌細(xì)胞為檢測(cè)終點(diǎn)，通量低，以心肌場(chǎng)電位作為終點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)高通量。采用含有多電極陣列的培養(yǎng)室培養(yǎng)小鼠D3胚胎干細(xì)胞，檢測(cè)胚胎毒性物質(zhì)作用引起的分化細(xì)胞的場(chǎng)電位、心肌跳動(dòng)和抗心肌鈣蛋白的免疫組化，結(jié)果三者具有一致性[6]。

3.2神經(jīng)胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)

心肌分化主要與中胚層相關(guān)，因而經(jīng)典EST方法不能檢測(cè)可能對(duì)其它胚層發(fā)育產(chǎn)生影響的毒物。隨著EST細(xì)胞向不同胚層細(xì)胞分化技術(shù)的日漸成熟，目前已開(kāi)發(fā)出促進(jìn)ES細(xì)胞向神經(jīng)外胚層優(yōu)勢(shì)分化的培養(yǎng)基和方法，ES細(xì)胞分化培養(yǎng)13 d，可基于形態(tài)學(xué)分析(如樹(shù)突生長(zhǎng)評(píng)價(jià))和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析(以致癌基因的生物學(xué)發(fā)生過(guò)程為主)，篩查和預(yù)測(cè)神經(jīng)發(fā)育胚胎毒性的化合物[10]。這類方法稱為神經(jīng)胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)(nEST)。如用于卡馬西平、鄰苯二甲酸單乙基己基酯、氟硅唑苯妥英、環(huán)唑醇、己唑醇、丙戊酸等藥物的篩查。單個(gè)化合物體外檢測(cè)中組合EST和nEST的終點(diǎn)，可明顯提高檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性。

3.3非心肌細(xì)胞分化

以心肌細(xì)胞分化為終點(diǎn)的EST方法的總準(zhǔn)確度可達(dá)78%，如果同時(shí)檢測(cè)化合物對(duì)ES細(xì)胞向心肌分化、成骨分化、軟骨分化和神經(jīng)分化的抑制作用可提高其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和特異性。成骨細(xì)胞來(lái)源于中胚層，對(duì)于骨基質(zhì)產(chǎn)生及其礦化起到特殊的作用。將小鼠D3胚胎干細(xì)胞以單細(xì)胞懸液直接鋪板，培養(yǎng)過(guò)程中添加抗壞血酸、地塞米松和β-甘油磷酸鹽。誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，通過(guò)檢測(cè)成骨細(xì)胞特異性的標(biāo)志物，如茜紅S染色、堿性磷酸酶活性分析和Bglap、Runx2基因表達(dá)作為檢測(cè)終點(diǎn)。經(jīng)8種胚胎毒性化合物和4種已知誘發(fā)骨骼損傷的化合物的驗(yàn)證研究表明，以成骨細(xì)胞分化為終點(diǎn)的方法與經(jīng)典的EST方法相關(guān)性較好[11]。

3.4基因表達(dá)譜

把分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于EST檢測(cè)，可提高效率和預(yù)測(cè)能力。最開(kāi)始嘗試把某個(gè)分子作為檢測(cè)終點(diǎn)，后來(lái)嘗試把多基因和通路調(diào)節(jié)作為鑒別發(fā)育毒性的方法。例如，基因組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)化合物暴露的ESC分化培養(yǎng)物中38個(gè)基因上調(diào)，而經(jīng)發(fā)育毒物暴露24 h發(fā)現(xiàn)特定基因表達(dá)的下調(diào)。采用連續(xù)的基因分析技術(shù)，實(shí)時(shí)檢測(cè)ESC的分化基因，鑒別出26個(gè)與發(fā)育毒性相關(guān)的分化基因，稱為EST生物標(biāo)志物。用基因指紋方法預(yù)測(cè)單一劑量發(fā)育毒性，與體內(nèi)一致性達(dá)67%[12]。在檢測(cè)時(shí)間方面，如果以經(jīng)過(guò)篩選出的16個(gè)分化基因標(biāo)志物的表達(dá)為檢測(cè)指標(biāo)代替形態(tài)學(xué)觀察，可縮短檢測(cè)時(shí)間為5 d[5]。這些基因涉及外胚層形成(Nrcam,Nes,Shh和Pnpla6)、內(nèi)胚層形成(Flk1和Afp)、中胚層形成(Mesp1,Vegfa,Myo1e和Hdac7)和一般的細(xì)胞發(fā)生(Cdk1,Myc,Jun,Mixl,Cer和Wnt3)。采用的指標(biāo)為使目的基因表達(dá)下降50%的化合物濃度。

3.5信號(hào)通路

2009年，Uibel等人開(kāi)發(fā)了ReProGlo方法，利用基于干細(xì)胞建立的體外系統(tǒng)預(yù)測(cè)藥物和化學(xué)品的胚胎毒性。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)藥物引起的Wnt/β-catenin信號(hào)通路改變，后者是生物早期胚胎發(fā)育過(guò)程中極為保守的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。經(jīng)改良后的方法可以高通量的同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞活性和熒光素酶報(bào)告基因活性，試驗(yàn)過(guò)程僅需3 d。該方法在歐盟ChemScreen計(jì)劃項(xiàng)目?jī)?nèi)經(jīng)過(guò)了擴(kuò)大范圍的測(cè)試研究[13]，經(jīng)檢測(cè)的化學(xué)物質(zhì)從17種擴(kuò)大到了80種，并結(jié)合了化合物的結(jié)構(gòu)分析，其預(yù)測(cè)模型為：① 陽(yáng)性：化學(xué)物對(duì)Wnt信號(hào)有特異性影響，無(wú)細(xì)胞毒性或只在更高一級(jí)濃度才有細(xì)胞毒性；② 陰性：不管化合物有無(wú)細(xì)胞毒性，都對(duì)Wnt信號(hào)通路無(wú)影響；③ 非特異性陽(yáng)性：化學(xué)物對(duì)Wnt信號(hào)有特異性影響，同時(shí)也具有細(xì)胞毒性。優(yōu)化后的ReProGlo方法預(yù)測(cè)胚胎毒性的假陽(yáng)性率比較低，適用于藥物開(kāi)發(fā)早期的先導(dǎo)物設(shè)計(jì)和化合物胚胎毒性大規(guī)模篩查，對(duì)于其相對(duì)較高的假陰性率，不適合單獨(dú)用于監(jiān)管目的。3.6蛋白組學(xué)方法

蛋白組學(xué)方法可用于監(jiān)測(cè)D3細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，記錄心肌分化過(guò)程中心肌蛋白的表達(dá)，其中最主要的是肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白。采用類似技術(shù)發(fā)現(xiàn)已知的早期神經(jīng)發(fā)育標(biāo)志 β3微管蛋白(β3 Tubulin Tuj-1)的表達(dá)可作為EST方法的檢測(cè)終點(diǎn)，適用于甲基汞類物質(zhì)的測(cè)試。D3細(xì)胞分化過(guò)程中暴露于胚胎毒物，經(jīng)全蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其中57種蛋白上調(diào)和42種蛋白下調(diào)，大多數(shù)上調(diào)蛋白與心肌細(xì)胞的功能相關(guān)，而下調(diào)蛋白主要為多能性標(biāo)志蛋白、伴侶蛋白和核糖體蛋白。表明在轉(zhuǎn)錄組水平，相關(guān)基因的表達(dá)與蛋白質(zhì)水平呈正相關(guān)，這也說(shuō)明蛋白質(zhì)組可作為EST的檢測(cè)終點(diǎn)[14]。

4檢測(cè)方法的量化和高通量

ECVAM驗(yàn)證的EST試驗(yàn)過(guò)程長(zhǎng)，操作較為復(fù)雜，通常采用24孔板觀察反應(yīng)終點(diǎn)，由于每種化合物需要設(shè)置幾種不同的濃度，工作量非常大。而且用跳動(dòng)的胚胎體為定量檢測(cè)參數(shù)，精確度不高。如果采用低粘附性96孔版代替?zhèn)鹘y(tǒng)懸滴實(shí)驗(yàn)進(jìn)行ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化抑制實(shí)驗(yàn)，并采用自動(dòng)測(cè)試心肌細(xì)胞跳動(dòng)的儀器簡(jiǎn)化步驟，可建立高通量的EST實(shí)驗(yàn)方法以提高檢測(cè)效率。再如用流式細(xì)胞檢測(cè)心肌細(xì)胞分化早期的特異蛋白質(zhì)(肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白)，代替分化后期出現(xiàn)的心肌纖維跳動(dòng)，可縮短檢測(cè)時(shí)間到7 d。如果以血管生成紊亂作為EST的終點(diǎn)，采用基因技術(shù)可建立檢測(cè)心肌細(xì)胞血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule 1，PECAM-1)和血管內(nèi)皮鈣粘素基因(VE-Cadherin)表達(dá)變化的方法，這兩個(gè)基因與心肌跳動(dòng)呈線性相關(guān)。另外兩個(gè)心肌的標(biāo)志物，如NK2同源框和肌球蛋白重鏈基因表達(dá)分析也可作為D3細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的檢測(cè)終點(diǎn)。此外，采用轉(zhuǎn)染Hand1和Cmyal基因的D3細(xì)胞進(jìn)行EST檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高通量，但其缺點(diǎn)是只能檢測(cè)心肌方向的分化[8-9]。這些高通量方法中，基于流式技術(shù)的EST方法正處于驗(yàn)證過(guò)程中[1]。修訂后的SN標(biāo)準(zhǔn)也補(bǔ)充了這一相對(duì)成熟的技術(shù)。

5組合策略的應(yīng)用

EST試驗(yàn)、全胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)和斑馬魚(yú)模式動(dòng)物試驗(yàn)是目前體外預(yù)測(cè)發(fā)育毒性的主要方法，這些方法都有其適用范圍和局限性。Sogorb等建立了分層的發(fā)育毒性測(cè)試策略，可以利用這些體外方法評(píng)價(jià)發(fā)育毒性，并根據(jù)測(cè)試需要逐漸增加模型的復(fù)雜性、技術(shù)復(fù)雜性和費(fèi)用。第一步為短期的細(xì)胞水平測(cè)試，以測(cè)定胚胎早期分化階段的作用；第二步為較長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞水平的胚胎毒性測(cè)試，以研究對(duì)胚胎后期發(fā)育產(chǎn)生作用的毒物；如果前兩步的試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，則可以考慮受試物為胚胎毒物，如果為陰性，則需要進(jìn)行第三步的試驗(yàn)，即考慮使用胚胎體的測(cè)試，如全胚胎試驗(yàn)和斑馬魚(yú)模型，根據(jù)整個(gè)胚胎的分子和形態(tài)學(xué)的改變進(jìn)行危害識(shí)別，而不只是以細(xì)胞的分化為指標(biāo)[15]。短期的細(xì)胞水平的胚胎毒性預(yù)測(cè)主要為試驗(yàn)周期小于5 d的改良EST試驗(yàn)，如基于區(qū)分EST功能的基因組學(xué)方法[5]，EST早期化學(xué)物暴露中基因的下調(diào)和活性測(cè)試，ES D3細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)試[12]，神經(jīng)性EST的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法等[14]。長(zhǎng)期的細(xì)胞水平胚胎毒性試驗(yàn)以試驗(yàn)周期超過(guò)6的EST方法為主，如經(jīng)典的EST試驗(yàn)、血管生成分化作用和基因鑒別試驗(yàn)[5]、化學(xué)發(fā)光EST試驗(yàn)[8]、EST結(jié)合蛋白組學(xué)的方法、人胚胎干細(xì)胞的試驗(yàn)[2]等。但這樣的組合模式，應(yīng)建立在每個(gè)方法標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)上，而且需要大規(guī)模的數(shù)據(jù)解讀，目前尚處于開(kāi)發(fā)階段，也缺少必要的決策判定步驟。

Panzica-Kelly等開(kāi)發(fā)了僅用D3細(xì)胞和兩個(gè)終點(diǎn)評(píng)估化合物胚胎毒性的決策樹(shù)模型，分別是細(xì)胞活性改變50%(<22 μm,22 μm～200 μm或>200 μm 3個(gè)濃度)，且在此濃度下能引起一組12個(gè)發(fā)育調(diào)控的目的基因至少8個(gè)基因下調(diào)10%以上，該決策樹(shù)能正確預(yù)測(cè)65個(gè)化學(xué)物中45個(gè)化合物為致畸物，其優(yōu)點(diǎn)是縮短檢測(cè)時(shí)間為4 d，且只需一種細(xì)胞的測(cè)試，缺點(diǎn)是只能提供有或無(wú)胚胎毒性的分類，而不是傳統(tǒng)EST方法的三分類。

組合測(cè)試策略的目的是使用較少的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)人發(fā)育/胚胎毒性最大程度的預(yù)測(cè)。目前的組合策略研究，不但組合了不同種屬來(lái)源的細(xì)胞水平測(cè)試(如Mes、hESC和iPS)，組合了不同水平的測(cè)試(形態(tài)學(xué)觀察、基因組和蛋白組水平)，還組合了不同適用范圍化合物的測(cè)試(神經(jīng)發(fā)育、心肌發(fā)育和骨骼發(fā)育等)。對(duì)組合中的單個(gè)方法的預(yù)測(cè)能力、適用范圍還缺少明確的驗(yàn)證，不同方法間的分層次序、互補(bǔ)性、權(quán)重分析、決策程序也缺少足夠的數(shù)據(jù)支持。目前的整合策略研究更多的是一種探索，但其代表了利用ES細(xì)胞替代發(fā)育毒性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究方向。

6討論

替代實(shí)驗(yàn)方法通常由試驗(yàn)系統(tǒng)、檢測(cè)終點(diǎn)、檢測(cè)方法和預(yù)測(cè)模型4個(gè)基本要素組成，多數(shù)對(duì)于EST方法的改進(jìn)都集中于這幾個(gè)要素。首先對(duì)于試驗(yàn)系統(tǒng)，采用更復(fù)雜的或更接近人類胚胎發(fā)育過(guò)程的系統(tǒng)，能夠更好地反應(yīng)人體發(fā)育的生物學(xué)過(guò)程的復(fù)雜性，從而提高檢測(cè)方法的預(yù)測(cè)性，如使用人來(lái)源的干細(xì)胞(如hESC、iPS或轉(zhuǎn)染人基因的測(cè)試系統(tǒng))代替小鼠ES細(xì)胞的研究。其次，對(duì)于檢測(cè)終點(diǎn)的選擇仍以心肌分化為主，因?yàn)橐种菩募》只梢愿采w約80%的胚胎毒性；因而大多數(shù)研究集中于心肌終點(diǎn)的前移，不管是分子水平、基因水平還是蛋白水平，但值得注意的是一旦檢測(cè)點(diǎn)前移，雖然有可能檢測(cè)周期有所縮短，但也可能會(huì)帶來(lái)準(zhǔn)確性的下降，因?yàn)榧词故切募〉姆只彩嵌嗷驈?fù)雜調(diào)控的結(jié)果，對(duì)于檢測(cè)指標(biāo)的組合需要大量的化合物測(cè)試才能達(dá)到傳統(tǒng)EST的預(yù)測(cè)水平。心肌以外的終點(diǎn)在胚胎發(fā)育過(guò)程中的權(quán)重還未完全了解，因而對(duì)于神經(jīng)分化和骨分化終點(diǎn)的檢測(cè)仍是心肌分化終點(diǎn)的有益補(bǔ)充。第三，檢測(cè)方法的改進(jìn)緊跟材料學(xué)、儀器和生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，例如借助培養(yǎng)板材料的發(fā)展可開(kāi)發(fā)檢測(cè)場(chǎng)電位的方法、用低粘度96孔板培養(yǎng)可建立中通量的EST方法，應(yīng)用高內(nèi)涵成像技術(shù)可定量神經(jīng)細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)、使用熒光素酶技術(shù)可將檢測(cè)終點(diǎn)進(jìn)一步量化和自動(dòng)化。其優(yōu)點(diǎn)是及時(shí)運(yùn)用現(xiàn)階段技術(shù)的發(fā)展成果，缺點(diǎn)是標(biāo)準(zhǔn)化程度有待提高。第四，對(duì)于預(yù)測(cè)模型的改進(jìn)并沒(méi)有太多的進(jìn)展，多數(shù)仍沿用EST方法的線性判別函數(shù)。需要關(guān)注的是如何把基于基因和蛋白水平的檢測(cè)終點(diǎn)(例如目的基因表達(dá)下降、熒光信號(hào)通路等)建立預(yù)測(cè)模型，并驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型的可靠性和科學(xué)性。最后，需要把這些測(cè)試方法與其它體外技術(shù)(如QSAR模型、專家系統(tǒng))和其它方法(如全胚胎試驗(yàn)、斑馬魚(yú)試驗(yàn))進(jìn)行組合，嘗試建立整合策略和決策模型，以期實(shí)現(xiàn)更好地預(yù)測(cè)胚胎和發(fā)育毒性。

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〔修回日期〕2015-12-25

[基金項(xiàng)目]檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)修訂計(jì)劃(2013B381r)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A030402005)。

[作者簡(jiǎn)介]程樹(shù)軍(1971-)，男，研究員，研究方向：動(dòng)物替代實(shí)驗(yàn)方法開(kāi)發(fā)與標(biāo)準(zhǔn)化。E-mail: chengsj@126.com。

【中圖分類號(hào)】R-332【

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 01-0081-04

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.016

Progress for alternatives methods predict the embrytoxicity by embryonic stem cell test

CHENGShu-jun1,2, QIN Yao3，YU Huan4，CHEN Yu1，3

(1. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center，Guangzhou 510623，China；2. Guangdong Key Laboratory of Import and Export Technical Measures of Animal，Plant and Food，Guangzhou 510623，China；3.Guangzhou Calt Biotech.Ltd，Guangzhou 510623，China；4. School of Public Healty，Sun Yat-sin University，Guangzhou 510080，China)

【Abstract】Embryonic Stem cell Test(EST) is an alternative testing method for testing embryotoxicity and developmental toxicity which have been validated by the European Centre for Validation of Alternative Methods(ECVAM).Under the promote of new technology, EST method has been refined by many ways including gene transfection, utilizing human-derived stem cell, increase the assay throughput, integrating test endpoints and quantifying the test indexs,which enhanced scientific relevance and testing efficiency.Within the principle of integration testing strategy(ITS),conducting pre-validation tests and standardized experiments on a large scale of chemicals, the new EST method as a individual test or a part of integrated test systerm is promising to apply on the research of lead drugs and the embryotoxicity prediction and mechanism study of chemicals.

【Key words】Embryonic stem cell test；Embryotoxicity and developmental toxicity；Alternative method；Predictive