紅豆杉枝葉提取物及紫杉烷類成分對4種腫瘤細胞的毒性作用研究

茍曉莉，金　晶，畢惠嫦， 鐘國平， 李志良，黃　民

(1. 中山大學藥學院，廣東 廣州　510006; 2. 中大南藥發(fā)展有限公司，廣東 梅州　514000)

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紅豆杉枝葉提取物及紫杉烷類成分對4種腫瘤細胞的毒性作用研究

茍曉莉1，金晶1，畢惠嫦1， 鐘國平1， 李志良2，黃民1

(1. 中山大學藥學院，廣東 廣州510006; 2. 中大南藥發(fā)展有限公司，廣東 梅州514000)

關鍵詞：紅豆杉；紫杉烷類；紫杉醇；三尖杉寧堿；10-DAB；抗腫瘤

紫杉醇抗腫瘤活性強，使用歷史悠久，但口服生物利用度低。臨床上現(xiàn)有使用紫杉醇注射液，但因其處方含有聚氧乙烯基蓖麻油(cremophor EL)和乙醇，使用時容易發(fā)生嚴重的過敏反應，需要比較嚴密的監(jiān)護，不便于患者使用。目前對于紫杉醇的研究多針對于口服制劑，開發(fā)新劑型如紫杉醇脂質(zhì)體、納米紫杉醇、聚合物膠束劑型、環(huán)糊精(CD)包合物等以提高其生物利用度[1-3]。

紫杉醇主要來源于紅豆杉樹皮、枝葉等。紅豆杉枝葉提取物包含大量的紫杉烷類單體，如紫杉醇、三尖杉寧堿、10-脫乙?；涂ǘ、?10-DAB)、10-去乙?；仙即?10-DAT)等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，口服紅豆杉枝葉提取物后，其抗腫瘤活性遠高于口服紫杉醇單體[4]?；诖?，對紅豆杉枝葉提取物以及其中主要的紫杉烷類成分(紫杉醇、三尖杉寧堿與10-DAB)的抗腫瘤活性進行研究，考察其對四株腫瘤細胞(非小細胞肺癌A549細胞、乳腺癌MDA-MB-231與MCF-7細胞、卵巢癌A2780細胞)的毒性，以指導新型口服含紫杉醇抗腫瘤藥物的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑A549、MDA-MB-231、MCF-7、A2780四株細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源庫。培養(yǎng)基DMEM (Dulbecco modified Eagle medium)與RPMI 1640購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清(FBS)、雙抗(青霉素-鏈霉素混合溶液)購自美國Gibco 公司；MTT、DMSO (Dimethyl Sulphoxide)購自美國 MP 公司；紫杉醇(PTX)、三尖杉寧堿(CEP)、10-脫乙?；涂ǘ、?10-DAB)購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；紅豆杉枝葉提取物由中山大學藥學院天然藥物化學研究所提供，提取方法詳見本課題組已發(fā)表文章[5]。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與接種A549、A2780細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、0.1%雙抗(100 μmol·L-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素)DMEM/高糖培養(yǎng)基中，MDA-MB-231、MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、0.1%雙抗(100 μmol·L-1青霉素及100 mg·L-1鏈霉素)RPMI 1640培養(yǎng)基中，所有細胞于5% CO2、37°C條件下培養(yǎng)。細胞復蘇，傳代3次后開始接種細胞于96孔板。

1.2.2藥物處理[6-7]細胞接種24h后給予藥物處理。紅豆杉提取物藥物孵育濃度為0、0.1×103、0.25×103、0.5×103、1.0×103、5.0×103、1.0×104、5.0×104μg·L-1；紫杉醇藥物孵育濃度為0、0.9、2.7、8.4、25.6、76.9、0.3×103、0.9×103μg·L-1；三尖杉寧堿藥物孵育濃度為0、0.4×103、0.8×103、4.1×103、8.3×103、4.2×104、8.3×104、1.7×105μg·L-1，10-DAB藥物孵育濃度為0、0.3×103、0.5×103、2.7×103、5.4×103、2.7×104、5.4×104、1.1×105μg·L-1。給藥時間均為72h。所有被試物均溶于DMSO中，每個濃度點設5個復孔。

1.2.3MTT檢測藥物處理結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1，溶于PBS)，在細胞孵育箱中繼續(xù)孵育4h，吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，室溫下于振蕩器上振蕩10 min，除去氣泡，用多功能酶標儀在570 nm處測定吸光度值(A)，按下式計算細胞存活率(cell survival rate)。

細胞存活率/%=(實驗孔吸光度-空白對照孔吸光度)/(溶劑對照孔吸光度-空白對照孔吸光度)×100%

2結(jié)果

2.1紅豆杉提取物對四種腫瘤細胞的毒性MTT結(jié)果顯示，紅豆杉提取物在四株細胞上均表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性。對于4株腫瘤細胞，在低劑量范圍內(nèi)紅豆杉提取物的抗腫瘤活性表現(xiàn)出明顯的量效關系。在一定的劑量范圍內(nèi)(低劑量)增大給藥濃度，可明顯的提高紅豆杉提取物的抗腫瘤活性。

2.2紫杉醇對4種腫瘤細胞的毒性濃度為0～8.5×102μg·L-1的紫杉醇孵育，明顯地抑制了4株細胞的增殖，細胞存活率下降。對MCF-7細胞，在所設濃度范圍內(nèi)具有明顯的劑量依賴性。其余細胞上的結(jié)果顯示，在低濃度區(qū)域內(nèi)紫杉醇對腫瘤細胞增殖的抑制作用具有劑量依賴性，在高于25.6 μg·L-1濃度時，繼續(xù)增大給藥濃度并不能明顯的增強紫杉醇對細胞的增殖抑制作用。

2.3三尖杉寧堿對4種腫瘤細胞的毒性在4株細胞上，三尖杉寧堿均表現(xiàn)出明顯的細胞毒性。用濃度為41.6 μg·L-1的三尖杉寧堿孵育細胞，細胞的存活率已下降50%左右。其中MDA-MB-231與A2780兩株細胞對三尖杉寧堿的敏感性更為明顯。在濃度為0.8×103～4.2×104μg·L-1范圍內(nèi)，三尖杉寧堿對4株腫瘤細胞增殖活性的抑制出現(xiàn)一不同程度的平臺期，即在此濃度范圍內(nèi)，隨著三尖杉寧堿濃度的增大，對腫瘤細胞增殖抑制率幾乎不變。而當三尖杉寧堿的給藥濃度高于4.2×104μg·L-1時，其細胞毒性又呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.410-DAB對4種腫瘤細胞的毒性10-DAB對4株腫瘤細胞增殖抑制作用表現(xiàn)不盡相同。其中，10-DAB對A549、MDA-MB-231與A2780三株細胞的細胞毒性趨勢較為接近。低于2.7×104μg·L-1的10-DAB孵育細胞，其細胞毒性呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性；而當10-DAB濃度高于2.7×104μg·L-1時，其對腫瘤細胞增殖抑制作用幾乎不再隨濃度改變。較為特別的是MCF-7細胞，10-DAB對MCF-7細胞的毒性在0～1.1×105μg·L-1的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，隨著10-DAB濃度的增加，MCF-7細胞的存活率不斷下降。

3討論

紫杉醇是從紅豆杉中分離出來的一種高效的抗腫瘤藥物，在臨床上被廣泛用作治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤。目前臨床上現(xiàn)有使用紫杉醇注射液，使用時常產(chǎn)生急性過敏等不良反應。但紫杉醇口服吸收生物利用度很低，迄今尚無紫杉醇的口服制劑上市。因此，開發(fā)含紫杉醇口服抗腫瘤藥物備受關注。

本課題組對紅豆杉枝葉提取物進行研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，紅豆杉枝葉提取物具有明顯的抗腫瘤活性，對人非小細胞肺癌A549細胞增殖有明顯的抑制作用。在人非小細胞肺癌A549細胞裸鼠移植瘤抑制實驗中，紅豆杉提取物對腫瘤的抑制率是單用紫杉醇的2倍[4]?；诖?，本課題組擬將紅豆杉嫁接優(yōu)株提取物開發(fā)為口服含紫杉醇抗腫瘤制劑。紅豆杉枝葉提取物中含多種紫杉烷類成分，其中紫杉醇、三尖杉寧堿、10-DAB是其中主要的紫杉烷類成分。本研究考察紅豆杉提取物、紫杉醇、三尖杉寧堿、10-DAB在4株細胞上的細胞毒性，以期解釋紅豆杉提取物的強抗腫瘤活性，為后期開發(fā)口服含紫杉醇抗腫瘤藥物提供依據(jù)與指導。

前兩部分關于紅豆杉提取物與紫杉醇的細胞毒性研究顯示，在同樣紫杉醇劑量下，紅豆杉提取物(紫杉醇含量約為2%)的抗腫瘤細胞增殖活性遠遠高于紫杉醇。目前檢測的三種紫杉烷類成分，其抗腫瘤活性強度最高的是紫杉醇，最低的是10-DAB。紅豆杉提取物、紫杉醇、三尖杉寧堿、10-DAB對不同細胞的細胞毒性趨勢一致，4株細胞對其毒性敏感性依次為MDA-MB-231、A2780、A549、MCF-7。

本研究闡明了紅豆杉提取物及其三種主要的紫杉烷類成分對4株細胞的毒性，部分解釋了紅豆杉提取物具有強抗腫瘤活性的原因，指導紅豆杉提取物提取工藝的改進，為紅豆杉提取物開發(fā)新型含紫杉醇抗腫瘤藥物提供實驗依據(jù)。

(致謝：本實驗在中山大學藥學院臨床藥理研究所完成，感謝各位老師與同學的支持與幫助！)

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Study on antitumor activity of extracts of branches and leaves of Taxus Chinensis and taxoids on four cell lines

GOU Xiao-Li1，JIN Jing1，BI Hui-chang1, ZHONG Guo-ping1, LI Zhi-liang2, HUANG Min1

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510006，China；2.ZhongdaMedicalDevelopmentCo.ltd,MeizhouGuangdong514000,China)

Key words：Taxus Chinensis；taxoids；paclitaxel；cephalomannine；10-DAB；antitumor

收稿日期：2015-10-12，修回日期：2016-02-05

基金項目：廣東省重大科技專項(No 2012A080202013)；廣州市科技計劃(2060404，201300000165)

作者簡介：茍曉莉(1990-)，女，碩士生，研究方向：藥物代謝與藥物動力學，E-mail: gouxl@mail2. sysu.edn.cn； 黃民(1963-)，男，博士，教授，研究方向：藥物代謝與藥物動力學，通訊作者，Tel: 020-39943011，E-mail: huangmin@mail. sysu.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.031

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)04-0591-02

中國圖書分類號：R282.71；R284.1；R329.24；R979.1

網(wǎng)絡出版時間：2016-3-18 11:22網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.062.html