結(jié)核性腦膜炎患者中幾種病原診斷檢測技術(shù)的應(yīng)用

何紅彥， 殷智曄， 李　敬， 張　慶， 邵艷新， 鄭立恒

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結(jié)核性腦膜炎患者中幾種病原診斷檢測技術(shù)的應(yīng)用

何紅彥， 殷智曄， 李敬， 張慶， 邵艷新*， 鄭立恒**

摘要:目的 探討不同病原學檢測方法在結(jié)核性腦膜炎（結(jié)腦）臨床診斷中的應(yīng)用。方法 對臨床診斷為結(jié)腦患者60例（結(jié)腦組）和非結(jié)腦患者70例（非結(jié)腦組）的腦脊液標本，同時進行離心涂片抗酸染色、結(jié)核菌BACTEC MGIT 960快速培養(yǎng)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）、玻片離心改良抗酸染色檢測，并對其結(jié)果進行比較分析。結(jié)果 結(jié)腦組標本中，涂片抗酸染色、結(jié)核菌快速培養(yǎng)、FQ-PCR檢測、玻片離心改良抗酸染色法的檢出率分別為11.7%（7/60）、6.7%（4/60）、48.3%（29/60）、61.7%（37/60）。非結(jié)腦組中2例玻片離心改良抗酸染色陽性。玻片離心改良抗酸染色法檢出率高于其他3種檢測方法，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且能發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)抗酸桿菌，應(yīng)用該種方法檢測，4例結(jié)核菌培養(yǎng)陽性患者的8份腦脊液標本均為陽性。結(jié)論 玻片離心改良抗酸染色法操作簡便、快速，可明顯提高腦脊液中抗酸桿菌的檢出率，既能檢出細胞外抗酸桿菌，也可檢出細胞內(nèi)抗酸桿菌，此方法可能有助于提高病原檢測的陽性率，值得進一步探討其在結(jié)腦早期診斷中的臨床意義。

關(guān)鍵詞:結(jié)核性腦膜炎； 腦脊液； 結(jié)核分枝桿菌； 改良抗酸染色

結(jié)核性腦膜炎（結(jié)腦），是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的非化膿性炎性反應(yīng)，除累及腦膜和脊髓膜外，還可侵犯腦實質(zhì)、腦血管，甚至脊髓，有很高的致殘率及病死率，文獻報道病死率可達15%～30%，是最常見的致死性肺外結(jié)核之一，其預(yù)后與早期診斷及時治療密切相關(guān)［1］。從腦脊液中檢出結(jié)核分枝桿菌是結(jié)腦診斷的重要依據(jù)。本文對60例結(jié)腦患者和70例非結(jié)腦患者的腦脊液標本同時進行離心涂片抗酸染色、結(jié)核菌快速培養(yǎng)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）、玻片離心改良抗酸染色法檢測結(jié)核分枝桿菌，并對這4種方法的檢測結(jié)果進行比較分析，為臨床工作提供相關(guān)數(shù)據(jù)，以選擇恰當、實用的檢測方法，滿足臨床需求。

1　材料與方法

1.1研究對象

2012年 10月—2013年 7月河北省胸科醫(yī)院收治的結(jié)腦患者定為結(jié)腦組。2012年 10月—2014 年 1月收治的非結(jié)腦患者定為非結(jié)腦組。

結(jié)腦診斷參照中華醫(yī)學會編著的《臨床診療指南結(jié)核病分冊》標準［2］，根據(jù)臨床表現(xiàn)、實驗室檢查、影像學結(jié)果及治療效果等作出臨床診斷，且根據(jù)結(jié)腦診斷專家共識，納入臨床評分大于12分的很可能結(jié)腦患者及確診結(jié)腦患者［3］。非結(jié)腦的診斷標準參考人民衛(wèi)生出版社第六版《神經(jīng)病學》。

1.2方法

1.2.1 標本留取 所有患者入院24～48 h內(nèi)行腰椎穿刺術(shù)，留取腦脊液5～6 mL同時送檢傳統(tǒng)離心涂片抗酸染色、結(jié)核菌快速培養(yǎng)、FQ-PCR、玻片離心改良抗酸染色等檢測結(jié)核桿菌。

1.2.2 離心涂片抗酸染色檢測 留取腦脊液2 mL，加入一次性塑料試管中，3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，留取試管底部沉渣吹打后進行涂片，然后按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》［4］進行抗酸染色及鏡檢。

1.2.3 結(jié)核菌培養(yǎng) 留取腦脊液1～2 mL進行結(jié)核菌快速培養(yǎng)，采用BACTEC MGIT 960 全自動分枝桿菌培養(yǎng)/藥敏系統(tǒng)進行結(jié)核菌培養(yǎng)及藥敏試驗，該系統(tǒng)由美國 BD 公司生產(chǎn)。將腦脊液嚴格按照 MGITTMProcedure Manual 要求進行培養(yǎng)，若滿8 周仍無菌生長即報告培養(yǎng)陰性。

1.2.4 FQ-PCR檢測 留取腦脊液1 mL進行腦脊液結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測。FQ-PCR檢測儀器設(shè)備為中山大學達安基因有限公司生產(chǎn)的DA-7600分析儀；試劑盒購于中山大學達安基因診斷中心生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌核酸擴增熒光試劑盒；質(zhì)控品為試劑盒配套提供。具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書要求執(zhí)行。TB-DNA＞50 copy為陽性。

1.2.5 玻片離心改良抗酸染色檢測 留取腦脊液0.5～1.0 mL，置于Cytospin-4型細胞玻片離心沉淀儀中，離心速度500 r/min，離心時間5 min。收集細胞制片成功后，用4%多聚甲醛固定玻片15 min，0.3%的TritonX-100浸泡30 min后，按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》［4］進行抗酸染色及鏡檢。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 用 SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料表示以x±s記錄。率的比較用卡方檢驗，檢驗水準α=0.05。

2　結(jié)果

2.1一般資料

結(jié)腦組60例，男29例，女31例，年齡為16～78歲，平均（36.6 ± 10.3）歲。非結(jié)腦組70例，男33例，女37例，年齡14～70歲，平均（34.2 ± 11.6）歲，其中化膿性腦膜炎31例，病毒性腦膜炎30例，隱球菌性腦膜炎6例，腦囊蟲病3例。

2.2臨床資料

結(jié)腦組臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱（54例），頭痛（42例），惡心、嘔吐（36例）及腦膜刺激征（38例）等。腦脊液常規(guī)檢測主要表現(xiàn)為壓力升高（35例），細胞數(shù)輕中度升高（37例），蛋白升高（50例），葡萄糖（53例）及氯化物（54例）低于正常。55例合并顱外結(jié)核病灶。60例患者均行頭顱核磁共振檢查，異常者52例，其中腦膜及基底池明顯強化22例，腦內(nèi)有結(jié)核瘤19例，腦積水8例，顱內(nèi)有梗死病灶3例。從發(fā)病到開始接受抗結(jié)核治療的時間為7～40 d，平均（19.5 ± 12.4）d。

2.3結(jié)腦組誤診情況

結(jié)腦組17例（28.3%）院外被誤診，其中誤診為病毒性腦膜炎8例，化膿性腦膜炎2例，上呼吸道感染2例，腦梗死2例，狼瘡腦病1例，血管性頭痛1例，顱內(nèi)腫瘤1例。

2.4腦脊液傳統(tǒng)涂片抗酸染色及結(jié)核菌快速培養(yǎng)檢測

結(jié)腦組患者離心涂片抗酸染色陽性7例11.7%），且只能檢測到細胞外抗酸桿菌。結(jié)核菌培養(yǎng)陽性4例（6.7%），其腦脊液離心涂片抗酸染色均為陽性；非結(jié)腦組所有病例均為陰性。

2.5腦脊液FQ-PCR檢測

結(jié)腦組29例（48.3%）陽性，對照組均為陰性。FQ-PCR與傳統(tǒng)涂片抗酸染色及結(jié)核菌培養(yǎng)結(jié)果相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。4例結(jié)核菌培養(yǎng)陽性的患者腦脊液FQ-PCR均為陽性。

2.6腦脊液玻片離心改良抗酸染色檢測

結(jié)腦組患者改良抗酸染色陽性37例（61.7%），其中有34例（91.9%）發(fā)現(xiàn)了細胞內(nèi)抗酸桿菌；對照組2例陽性。改良抗酸染色法的檢出率高于其他3種方法的檢出率，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。4例結(jié)核菌培養(yǎng)陽性的患者腦脊液玻片離心改良抗酸染色檢測均為陽性。

3　討論

結(jié)腦的診斷分為臨床診斷和病原學診斷。長期以來，因結(jié)腦病原學檢測技術(shù)的相對滯后，結(jié)腦多是通過臨床表現(xiàn)、腦脊液常規(guī)檢測、頭顱影像學及是否合并顱外結(jié)核等綜合分析后作出的臨床診斷。但是在臨床工作中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，很多結(jié)腦患者的臨床表現(xiàn)非常不典型，尤其在疾病的初期，缺乏一定的特異性，而腦脊液及頭顱影像學等輔助檢查也呈現(xiàn)出非特異性表現(xiàn)，很容易誤診，從而延誤治療，有文獻報道誤診率可高達50.73%［5］，本組患者中有17例院外被誤診為其他疾病，誤診率為28.3%，因此病原學診斷方法的改進迫在眉睫。

2010年根據(jù)結(jié)腦診斷專家共識中，提出確診的結(jié)腦在符合臨床標準的同時，應(yīng)具備以下一項或多項，如腦脊液中查到抗酸桿菌，腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)陽性，腦脊液結(jié)核菌核酸檢測陽性；腦或脊髓中發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌或結(jié)核性病理改變［3］。腦組織及脊髓活檢在臨床工作中難以實現(xiàn)，因此，在結(jié)腦的病原學診斷中，目前多采用抗酸染色、結(jié)核菌培養(yǎng)和核酸檢測等。

涂片抗酸染色法是傳統(tǒng)的檢測抗酸桿菌的方法，因操作簡單，所需設(shè)備要求較低且價格低廉，目前在臨床上廣泛應(yīng)用，但陽性率較低，文獻報道陽性率只有10%左右［6-7］，本組病例中涂片抗酸染色檢測抗酸桿菌的檢出率為11.7%，與文獻報道基本相符。分析其原因主要為：①傳統(tǒng)涂片抗酸染色在細胞收集過程中應(yīng)用試管離心，但由于結(jié)核菌密度相對炎性腦脊液來說較低，且經(jīng)過離心后，使得結(jié)核菌極易貼附在管壁上，試管底部獲取的結(jié)核菌相對較少［8］；②在抗酸染色的過程中，玻片需要反復(fù)洗滌染色，結(jié)核菌很容易丟失，從而導致陽性率進一步降低；③結(jié)核菌屬胞內(nèi)寄生菌，進入機體后迅速被單核吞噬細胞等吞噬，抗酸染色時染料不易進入細胞內(nèi)，因此造成細胞內(nèi)結(jié)核菌不易被發(fā)現(xiàn)；④結(jié)核菌細胞壁內(nèi)因存在大量類脂質(zhì)，有明顯的疏水特性及對外界的抵抗能力，影響染料的滲入［9］；⑤涂片抗酸染色法對標本內(nèi)的菌量有一定的要求，每毫升標本中需含有104～ 105個抗酸桿菌時才能被檢測出，但由于腦脊液存在于蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)，有著特殊的解剖位置，結(jié)核菌量遠遠小于痰液中的菌量［9］。因此，傳統(tǒng)離心涂片抗酸染色的檢出率較低，且只能發(fā)現(xiàn)細胞外的抗酸桿菌，不能滿足診斷的需要。

腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)目前采用的是BACTEC MGIT 960 全自動快速培養(yǎng)系統(tǒng)，與傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法相比，陽性率有所提高，所需時間較短，但費用較高。有文獻報道在包括痰液、支氣管灌洗液、胸腹水等786份標本的檢測中，快速培養(yǎng)與羅氏培養(yǎng)法的陽性率分別為39.2%與34.8%，平均培養(yǎng)時間為11.8 d和20.6 d［10］。但是由于腦脊液中所含的結(jié)核菌量較少，且標本離心預(yù)處理過程中造成結(jié)核菌部分丟失，因此本組患者中腦脊液快速培養(yǎng)法檢出率不高，只有6.7%，明顯低于其他標本的檢出率，且仍需要4～8周的時間才可有培養(yǎng)結(jié)果，因此，很難滿足早期診斷的需要，但對于培養(yǎng)陽性的標本可進一步行快速藥敏試驗，其結(jié)果在指導后續(xù)治療及耐藥性監(jiān)測等方面具有非常重要的參考價值，臨床意義重大［11］。本組患者中有1例培養(yǎng)示耐藥結(jié)核菌感染，病初抗結(jié)核治療效果一直較差，后根據(jù)藥敏結(jié)果及時調(diào)整了治療方案，預(yù)后有了很大的改善。因此，有條件的醫(yī)療單位仍需積極送檢腦脊液快速結(jié)核菌培養(yǎng)及藥敏，指導治療。

近年來，隨著分子生物學的不斷發(fā)展，PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床的各種病原體檢測。 FQPCR是在常規(guī) PCR 的基礎(chǔ)上，加入熒光標記的探針，將光譜技術(shù)、核酸擴增、雜交等結(jié)合在一起，而且檢測是在封閉狀態(tài)下進行，不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且在一定程度上提高了檢測的靈敏度及特異度，并避免了擴增產(chǎn)物污染所致的假陽性［12］。理論上，只要樣本中有病原菌存在，F(xiàn)Q-PCR 就可以檢測到，因此有很高的靈敏度，而且，操作起來快速省時，僅需 2～3 h即可得出結(jié)果。本研究應(yīng)用該方法檢測結(jié)核菌的檢出率為48.3%，明顯高于傳統(tǒng)涂片抗酸染色、結(jié)核菌培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學意義，但該法需要一定的實驗室要求及設(shè)備，在基層醫(yī)院很難推廣使用。

鑒于結(jié)核菌以上的生物學特性及檢測方法的局限性，CHEN等［13］對傳統(tǒng)抗酸染色進行了改進，即玻片離心改良抗酸染色法，應(yīng)用這一方法對29例腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)陽性結(jié)腦患者的48份腦脊液標本進行檢測，陽性檢出率達100%，其中93.8%的患者檢測出細胞內(nèi)抗酸桿菌。其優(yōu)勢在于：①改良抗酸染色法在細胞收集環(huán)節(jié)上，采用玻片離心法，使腦脊液中的有形成分濃集在直徑約0.5 cm的范圍內(nèi)，利于尋找抗酸桿菌；②離心速度減慢，離心時間縮短，避免了抗酸桿菌結(jié)構(gòu)的破壞，并保證了免疫細胞的完整性，有利于發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)的抗酸桿菌；③采用多聚賴氨酸掛膠玻片，使細菌及細胞與玻片結(jié)合牢固，在抗酸染色反復(fù)洗滌操作過程中，不易被洗滌掉；④在進行抗酸染色之前標本經(jīng)過Triton破膜的預(yù)處理，增加了細胞壁及細胞膜的通透性，使得染料更易進入細胞內(nèi)，細胞內(nèi)外抗酸桿菌更易著色。因此，通過對傳統(tǒng)方法的改進，將涂片抗酸染色的檢出率由11.7%提高到61.7%，并能檢出細胞內(nèi)抗酸桿菌。其中傳統(tǒng)涂片抗酸染色陽性的7例患者、培養(yǎng)陽性的4例患者及 FQ-PCR陽性的29例患者的腦脊液標本應(yīng)用該種方法檢測均為陽性。對培養(yǎng)陽性的4例患者的8份腦脊液標本應(yīng)用此法檢測也均為陽性。此法快速、簡便易行，可作為早期結(jié)腦診斷的有效手段，值得臨床推廣使用［14-15］。

綜上所述，傳統(tǒng)涂片抗酸染色法及結(jié)核菌培養(yǎng)陽性率均不高，不利于結(jié)腦的早期診斷。玻片改良抗酸染色法在一定程度上提高了腦脊液中抗酸桿菌的檢出率，在檢測細胞外抗酸桿菌的同時也可檢測出細胞內(nèi)的抗酸桿菌，其臨床操作簡單，實驗室條件要求相對較低，可推廣使用。但此法在臨床上仍存在一些不足之處，抗酸桿菌陽性尚不能完全確定為致病性的結(jié)核分枝桿菌，仍需進一步研究證實，因此，在有條件的醫(yī)療機構(gòu)，應(yīng)進行腦脊液結(jié)核分枝桿菌基因檢測。其次，在非結(jié)腦組中有1例隱球菌性腦膜炎患者和1例化膿性腦膜炎患者的改良抗酸染色也為陽性，考慮患者機體免疫功能較差，增加了結(jié)核感染的機會，不除外同時合并了結(jié)核桿菌的感染。而且，本組腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)陽性的病例數(shù)較少，在判斷新方法的陽性率及特異性上存在局限性，應(yīng)進一步擴大檢測腦脊液結(jié)核菌培養(yǎng)陽性的樣本數(shù)，從而確定玻片離心改良抗酸染色法的準確性。總之，多種方法聯(lián)合應(yīng)用，可提高結(jié)腦早期病原學診斷率，從而改善預(yù)后。

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*臨床藥學部；**檢驗科。

中圖分類號：R529.3

文獻標識碼：A

文章編號：1009-7708（2016）03-0336-04

DOI：10.16718/j.1009-7708.2016.03.015

收稿日期：2015-06-01 修回日期：2015-10-13

基金項目：河北省衛(wèi)生廳重點課題（20130130，ZD20140425）。

作者單位：河北省胸科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，石家莊 050041；

作者簡介：何紅彥（1980—），女，醫(yī)學碩士，主治醫(yī)師，主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診治研究。

通信作者：鄭立恒，E-mail：zhengliheng2006@163.com。

Utility of several methods for etiological diagnosis in patients with tuberculous meningitis

HE Hongyan， YIN Zhiye， LI Jing， ZHANG Qing， SHAO Yanxin， ZHENG Liheng. （Department of Neurology， Chest Hospital of Hebei Province， Shijiazhuang 050041， China）

Abstract:Objective To examine the clinical utility of four methods in diagnosis of tuberculous meningitis. Methods A total of 60 patients with tuberculous meningitis were included as study group and another 70 patients with non-tuberculous intracranial infection as control group. Four methods， including conventional acid fast stain， Myobacterium tuberculous culture in BACTEC MGIT 960， real-time fuorescent quantitative polymerase chain reaction （FQ-PCR） and modifed acid fast stain， were used to assay the cerebrospinal fuid specimens for diagnosis of tuberculous meningitis. Results The positive rate was 11.7% （7/60）， 6.7% （4/60），48.3% （29/60）， and 61.7% （37/60）， respectively in the study group as tested by the four methods. There was signifcant difference between the four methods in the positive rate （P ＜ 0.05）. Modifed acid fast stain was more sensitive than the other 3 methods in identifying tuberculous meningitis （P ＜ 0.05）. This method also could identify the intracellular M. tuberculosis. All the 8 samples from the 4 patients who were positive for culture of M. tuberculosis were positive in the modifed acid fast stain. Conclusions The modifed acid fast staining method is simple， fast， signifcantly more senstive in detection of the acid fast M. tuberculosis in CSF，either extracellular or intracellular. It is worthwhile to further investigate its usefulness in early diagnosis of tuberculosis meningitis. Key words: tuberculosis meningitis； cerebrospinal fuid； Mycobacterium tuberculosis； modifed acid-fast stain