液體活檢及其在非小細(xì)胞肺癌診治中的研究進(jìn)展

鄭迪凡 陳海泉

隨著近幾年科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是細(xì)胞分離技術(shù)和測序技術(shù)的發(fā)展，液體活檢，在腫瘤的精準(zhǔn)治療中日益重要。惡性腫瘤的精確診斷與治療離不開腫瘤組織的獲取及后續(xù)的病理學(xué)、分子生物學(xué)檢測。腫瘤早期患者的手術(shù)切除及腫瘤中晚期患者或不適宜手術(shù)患者的診斷性組織活檢是獲取腫瘤組織的主要手段。近年來，腫瘤患者的生存時間日益延長，生存質(zhì)量不斷提高也得益于各類最新的篩查活檢技術(shù)。這些技術(shù)的廣泛普及使得更多的早期患者能更早地進(jìn)行根治性手術(shù)治療。然而，組織活檢限于腫瘤生長部位、取材大小等因素，并不能百分之百發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞[1,2]；同時，腫瘤異質(zhì)性使得單次組織活檢、基因檢測并不能完整描述腫瘤整體在基因?qū)用嫔系母淖僛3]。任何肉眼可見的腫瘤均提示患者并非在疾病的最早期。對于惡性腫瘤精確診治的要求不斷提高，液體活檢正逐漸展露其優(yōu)勢。液體活檢是一種從血液等非實(shí)性生物組織中取樣并分析，主要用于診斷或監(jiān)測腫瘤疾病的方法[4]。血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells, CTC）和循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）和腫瘤直接相關(guān)，最大限度覆蓋了患者疾病的特點(diǎn)。本文著重介紹CTC和循環(huán)腫瘤DNA及其在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）診治中的應(yīng)用。

1 CTC和ctDNA

CTC是指由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[5]。1869年，澳大利亞醫(yī)生在一位死去的癌癥患者的血液中發(fā)現(xiàn)了和腫瘤細(xì)胞形態(tài)一致的細(xì)胞，并提出了"血液中的腫瘤細(xì)胞可能揭示出患者原發(fā)腫瘤的生物特征"這一論斷[6]。人體1 mL血液中含有大約5×109個紅細(xì)胞，7×106個白細(xì)胞，而即使在晚期腫瘤患者的血液中也只有1個-10個CTC[7]。CTC含量極微，臨床現(xiàn)有的技術(shù)手段無法進(jìn)行有效的篩選和分析。組織中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)的機(jī)制并不十分明確。在乳腺癌患者行根治性手術(shù)多年后血液中依然能夠檢測到CTC，提示CTC不僅來源于腫瘤原發(fā)灶，還可來源于腫瘤轉(zhuǎn)移灶或微轉(zhuǎn)移灶[8]。CTC在血液中的半衰期很短，只有幾個小時[8]，若無及時補(bǔ)充，在24小時之后，血液中的CTC在現(xiàn)有技術(shù)條件下將無法檢測到[9]。CTC在血液中既有單個存在，也有多個聚集成簇存在，極少部分在發(fā)現(xiàn)時處于有絲分裂狀態(tài)。鏡下CTC的形態(tài)也各有差異，部分細(xì)胞形態(tài)和原發(fā)部位腫瘤細(xì)胞的形態(tài)相似，部分細(xì)胞表現(xiàn)為凋亡的狀態(tài)，還有部分細(xì)胞殘缺不全[10]。CTC在基因突變，拷貝數(shù)變異，及不同信號通路傳遞的強(qiáng)度上與原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞既有相似之處，又有自身獨(dú)立的特征[10]。

循環(huán)游離DNA（circulating free DNA, cfDNA）是釋放入血液中的被降解的DNA片段[11]，最早在1948年被發(fā)現(xiàn)[12]。血液中的游離DNA片段一部分的來自正常細(xì)胞，另一部分來自腫瘤細(xì)胞，被稱為ctDNA。根據(jù)腫瘤患者的分期，腫瘤負(fù)荷的不同，ctDNA占所有循環(huán)游離DNA的比例在1%到93%之間波動[13,14]。ctDNA大部分來自凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞[14,15]。之前有猜測ctDNA可能大部分來源于CTC，然而對比血液中ctDNA的含量和CTC的濃度可以發(fā)現(xiàn)，在中晚期腫瘤患者的每毫升血液中平均含15 ng ctDNA，而一個細(xì)胞含有約6 pg DNA，則推算出至少每毫升血液中存在上千個CTC，然而事實(shí)上，平均每毫升血液只含CTC 1個-10個。腫瘤患者的血液中循環(huán)DNA的含量要高于正常人。血液中游離DNA的片段長度集中在180 bp到200 bp之間，片段長度提示這些DNA主要由細(xì)胞凋亡產(chǎn)生[14]。在大多數(shù)的進(jìn)展期腫瘤如胰腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌等患者血液中都可以檢測到ctDNA，在局限期腫瘤患者中，也有將近一半比例的患者能夠檢測到CTC。對于那些無法檢測到CTC的患者，其中的大部分能夠檢測到ctDNA[15]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)推算，ctDNA的半衰期在2小時左右[13]。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞可以攝取血液中的ctDNA，并且ctDNA在體外實(shí)驗(yàn)中能夠成功誘導(dǎo)正常3T3細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化。如果這一結(jié)論能夠進(jìn)一步在人體中被驗(yàn)證，即可說明腫瘤細(xì)胞能夠主動向外界釋放腫瘤DNA，并通過腫瘤DNA將正常細(xì)胞"腫瘤化"。那么，ctDNA，將不僅僅只是一種被動監(jiān)測的標(biāo)志物，而是一種特殊形式的必須要主動消滅的腫瘤。

2 液體活檢檢測手段

由于CTC在人體血液中數(shù)量極少，絕大部分的腫瘤患者，即使在晚期，每毫升血液也只有1個-10個CTC。檢測的第一步即是要分離CTC。來源于上皮的CTC由于體積大于正常的血細(xì)胞，并且不易變形[17,18]，可以用物理的手段來過濾掉較小的正常細(xì)胞，篩選出腫瘤細(xì)胞。通過設(shè)計適合孔徑的篩板，能夠獲取到盡可能多的CTC。然而，并非所有的腫瘤細(xì)胞都在體積上大于正常血細(xì)胞，另有一部分腫瘤細(xì)胞具有向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力，同時也有變形能力，這些不確定因素都會降低物理篩選的效果。其他基于物理的篩選方法，如密度梯度離心法[19]、介電泳法[20]等也被用于篩選CTC。

最常用的CTC分離技術(shù)是抗體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞捕獲技術(shù)。用結(jié)合了磁珠的抗體蛋白去靶向腫瘤細(xì)胞，抗體多是上皮細(xì)胞表面所具有的蛋白標(biāo)志物，再通過磁場導(dǎo)向，篩選出被抗體識別的細(xì)胞[21,22]。還有一種反向選擇的方法，即靶向紅細(xì)胞和白細(xì)胞表面的蛋白標(biāo)志物，篩選并分離去除，那剩下的大部分就是CTC[23,24]。篩選出的疑似CTC還需進(jìn)一步驗(yàn)證，如通過一些腫瘤相關(guān)標(biāo)志物的抗體，腫瘤相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增，對獲取的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并功能驗(yàn)證，還可以將細(xì)胞注入裸鼠體內(nèi)檢驗(yàn)成瘤性等[25,26]。

獲取到的CTC，在細(xì)胞和分子層面上，可以做和手術(shù)切除或活檢得到的腫瘤組織一樣的研究，如基因測序、基因表達(dá)分析、FISH、細(xì)胞免疫染色、細(xì)胞培養(yǎng)等[27]。

ctDNA與循環(huán)游離DNA的本質(zhì)區(qū)別在于，ctDNA和腫瘤細(xì)胞中的DNA一樣，存在基因突變，基因拷貝數(shù)變異等正常細(xì)胞不具有的基因?qū)用娓淖?，這也是區(qū)分并檢測ctDNA的基礎(chǔ)。由于ctDNA在血液中的含量極低，并且ctDNA占循環(huán)游離DNA的比例往往不高，傳統(tǒng)的一代測序技術(shù)幾乎不能檢測到ctDNA，只有在極少數(shù)腫瘤晚期，且腫瘤負(fù)荷較大的患者身上，才會有陽性發(fā)現(xiàn)。

近幾年技術(shù)手段的突飛猛進(jìn)，包括數(shù)字PRC技術(shù)[28,29]、BEAMing（beads, emulsion, amplification, and magnetics）法[30,31]、PAP法[32]等用于檢測ctDNA。其中BEAMing法能夠檢測比例在1：10,000以下的基因突變，具有足夠高的敏感性。并已經(jīng)用于臨床試驗(yàn)[33]。二代測序技術(shù)也越來越多地被用于檢測ctDNA，兼具極高的敏感性和特異性，還能夠獲得所有ctDNA的序列信息[34,35]。

3 液體活檢的優(yōu)勢與局限性

醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展使得腫瘤治療手段日益多元化。每一個腫瘤患者，想要獲得最佳的治療策略，不僅需要臨床資料，更重要的是腫瘤在組織層面，細(xì)胞層面及分子層面的全方位的信息。通過手術(shù)切除或診斷性組織活檢的方法獲得的腫瘤組織在一定程度上能夠提供上述信息。但是腫瘤的異質(zhì)性使得一次的檢測結(jié)果并不足以揭示出腫瘤基因圖譜的全貌，以偏概全的結(jié)論還有可能誤導(dǎo)治療方案[3,36]。對于晚期患者和不適宜手術(shù)患者，部分區(qū)域的腫瘤很難進(jìn)行取樣。隨著時間推移和治療的影響，腫瘤的基因圖譜也隨之改變，再次或多次對患者進(jìn)行活檢取樣在臨床上亦不現(xiàn)實(shí)。液體活檢技術(shù)僅通過抽取患者外周血液進(jìn)行檢測分析并獲得患者腫瘤相關(guān)信息。對患者不造成創(chuàng)傷，操作方便快捷，并能夠反復(fù)獲取，易于實(shí)時監(jiān)控。從血液中獲得CTC和ctDNA由其本身的生物學(xué)特性（半衰期都在24小時之內(nèi)）必定是最新鮮、實(shí)時的，并且CTC，ctDNA可來源于腫瘤組織的任何部分，其中包含了異質(zhì)性的各個方面，能夠反映腫瘤的全貌。CTCctDNA攜帶的信息各有側(cè)重。ctDNA相比CTC更實(shí)時，更能動態(tài)反映人體內(nèi)腫瘤的變化情況[37,38]，而CTC不僅包含DNA信息，還有RNA、蛋白質(zhì)信息等，更能全方位揭示腫瘤特征。兩者相互結(jié)合，意義更大。

液體活檢技術(shù)目前也存在局限性。無論CTC還是ctDNA在血液中都極其微量，需要技術(shù)的不斷革新來增加儀器檢測的靈敏度。新技術(shù)的使用成本較高，應(yīng)用范圍不廣，從實(shí)驗(yàn)室到臨床上大規(guī)模應(yīng)用還有很長一段路要走。每一項(xiàng)液體活檢檢測技術(shù)的敏感性與特異性如何？液體活檢在腫瘤的早期診斷中究竟能達(dá)到多早？液體活檢與金標(biāo)準(zhǔn)病理組織活檢的相關(guān)性有多高？液體活檢揭示腫瘤動態(tài)變化的反應(yīng)有多靈敏？這些都是液體活檢技術(shù)亟待解決的理論問題。最近有研究顯示，針對單個CTC進(jìn)行基因分析發(fā)現(xiàn)，同一個體中，不同的CTC在基因突變或是信號通路上也存在差異[39]。液體活檢是否能夠真正克服腫瘤異質(zhì)性問題還需進(jìn)一步探索。

4 液體活檢在非小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用

液體活檢是早期診斷非小細(xì)胞肺癌的有效手段。有研究以無臨床腫瘤證據(jù)的慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary disease, COPD）患者為目標(biāo)人群，檢測他們血液中是否存在CTC，結(jié)果顯示有3%的個體檢測到了CTC，并且在1到4年時間內(nèi)均出現(xiàn)了計算機(jī)斷層掃描（computed tomography, CT）可見的肺結(jié)節(jié)，并手術(shù)證實(shí)為早期肺癌[40]。液體活檢能夠檢測非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤中所有的基因異常。對血液中的ctDNA進(jìn)行深度測序能夠檢測出迄今為止報道的所有基因點(diǎn)突變，單核苷酸變異和融合基因，并具有極高的敏感度（85%）和特異度（96%）[41]。在ctDNA中檢測表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變情況與在切除的腫瘤組織中檢測間有較高的符合率[42]。對CTC采用過濾器相適應(yīng)的熒光原位雜交技術(shù)（FA-FISH）檢測出融合基因（如ALK），檢測結(jié)果和腫瘤活檢一致。這不僅能作為融合基因診斷工具，同時也還能作為融合基因靶向治療療效的監(jiān)測工具[43]。

液體活檢能動態(tài)監(jiān)測非小細(xì)胞肺癌患者對治療的反應(yīng)情況。ctDNA的水平和患者體內(nèi)腫瘤負(fù)荷顯著相關(guān)，且比影像學(xué)檢查更早提示患者對治療的反應(yīng)[41]。治療過程中，連續(xù)地監(jiān)測CTC的濃度變化和CTC中DNA的基因突變情況，當(dāng)患者對治療反應(yīng)良好時，CTC濃度呈下降趨勢；相反，腫瘤進(jìn)展時，CTC濃度不斷上升，并且CTC中新的基因突變形式也不斷出現(xiàn)。CTC這一系列變化情況和隨后的影像學(xué)檢查結(jié)果相符[44,45]。

液體活檢可以及時反映非小細(xì)胞肺癌患者對靶向治療的耐藥情況。具有EGFR基因突變的非小細(xì)胞肺癌患者，可以使用EGFR抑制劑進(jìn)行治療。然而治療一段時間后部分患者會產(chǎn)生耐藥性，繼發(fā)的EGFR-T790M突變是最常見的耐藥原因[46]。通過檢測靶向治療患者的ctDNA可以發(fā)現(xiàn)，一半以上的出現(xiàn)耐藥患者的ctDNA中可以檢測到EGFR-T790M突變，而未經(jīng)靶向治療患者的ctDNA中沒有EGFR-T790M突變。這說明ctDNA能比較準(zhǔn)確的反映非小細(xì)胞肺癌患者對靶向治療的耐藥情況。同時，ctDNA中EGFR-T790M突變的濃度變化還可以用于判斷患者耐藥強(qiáng)度的變化情況[47,48]。此外，運(yùn)用液體活檢技術(shù)，檢測CTC的動態(tài)變化情況短期內(nèi)可以評估根治性手術(shù)后患者體內(nèi)腫瘤的殘余情況。長期可以更早的發(fā)現(xiàn)患者腫瘤的復(fù)發(fā)情況[8]。

5 展望

液體活檢具有獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢和廣泛的應(yīng)用前景，有著廣闊的發(fā)展空間。然而，現(xiàn)階段液體活檢還不能夠取代組織活檢的金標(biāo)準(zhǔn)地位。液體活檢所提供的信息也還需要更先進(jìn)的技術(shù)來做出更深層次的解讀。

液體活檢是一個不斷發(fā)展的概念，隨時間推移，其外延也在不斷擴(kuò)展。從廣為人知的蛋白類腫瘤標(biāo)志物，到如今的CTC、ctDNA，再到最近幾年興起的外泌體[49]，液體活檢始終是一個試驗(yàn)性、探索性的課題。相信在不久的將來，液體活檢將能夠更有效地促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌患者的早期診斷及后期治療，為廣大患者帶來福音。