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    綿羊綠膿桿菌分離鑒定及藥物敏感性試驗

    2016-01-30 01:58:46王鳳璐山東省臨沂市河東區(qū)畜牧獸醫(yī)局276000
    中國畜禽種業(yè) 2016年9期
    關鍵詞:綠膿桿菌肉湯瓊脂

    王鳳璐(山東省臨沂市河東區(qū)畜牧獸醫(yī)局 276000)

    綿羊綠膿桿菌分離鑒定及藥物敏感性試驗

    王鳳璐(山東省臨沂市河東區(qū)畜牧獸醫(yī)局 276000)

    1 試驗材料與儀器

    1.1 試驗材料

    1.1.1 病料來源

    臨沂市河東區(qū)某綿羊飼養(yǎng)場,飼養(yǎng)500余只兩月齡左右的綿山羊突然發(fā)病死亡。病羊以咳嗽,呼吸困難,流膿性鼻液,部分羊腹瀉。以急性死亡為主,2d之內(nèi)死亡12只。發(fā)病率高達20%,死亡率在16%以上。病死羊腹部膨大,剖檢可見肝臟腫大質脆,有局灶性灰白色纖維素性膜,肺水腫,內(nèi)有泡沫,尖葉、心葉肉變,間質增寬;脾腫大,包膜增厚;膽囊腫大,膽汁稀??;腎包膜增厚,有的發(fā)黃,有出血點;腸系膜渾濁,腸系膜淋巴結腫脹呈索狀,切面灰白色,小腸內(nèi)有稀薄的黃綠色內(nèi)容物;氣管喉頭充血,內(nèi)有泡沫樣黏液;有的皮下有膠凍樣滲出物;膀胱內(nèi)有黃色尿液:腹股溝淋巴結水腫。

    1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

    普通營養(yǎng)瓊脂(購自青島高科園海博技術有限公司)、肉湯培養(yǎng)液(購自北京奧博星生物技術有限公司)、SS瓊脂培養(yǎng)基(購自北京中海生物科技有限公司)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(購自北京陸橋生物科技有限公司)、三糖鐵培養(yǎng)基(購自購自北京陸橋生物科技有限公司)、細菌生化常規(guī)微量鑒定管(購自杭州天和微生物試劑有限公司)等。

    1.1.3 藥敏試驗紙片

    藥敏試紙片(杭州天和微生物試劑有限公司)。

    1.1.4 試驗動物

    20g左右的小白鼠10只,由獸醫(yī)預防醫(yī)學實驗室提供。

    1.2 試驗儀器

    SW-WJ-LCU潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術公司制造,編號A20100107)、FA2004N電子天平(上海精密科學儀器有限公司制造,出廠號55201,型號FA2004N)、生化培養(yǎng)箱(北京泰克儀器有限公司制造,型號LRH-250A)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠,型號YXQ-LS-SU)。

    2 試驗方法

    2.1 病原菌分離鑒定

    2.1.1 各種培養(yǎng)基的制備

    普通瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)液、SS瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基按常規(guī)進行配制,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    半固體培養(yǎng)基:在制備普通肉湯培養(yǎng)基的基礎上再加入0.3~0.5%的瓊脂粉混合加熱融化,分裝滅菌,趁熱豎立放置,待凝固后,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    血液培養(yǎng)基:將普通瓊脂培養(yǎng)基加熱融化高壓滅菌后,待冷至55℃左右加入無菌的脫纖家兔鮮血5%混合后,傾注于滅菌平皿。待凝固后放入37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h,無細菌生長的血液平板4℃保存?zhèn)溆肹1]。

    2.1.2 涂片及染色

    無菌操作取病死綿羊的肝臟、心血、腎臟和滲出物及分離培養(yǎng)物涂片,干燥,革蘭氏染色,鏡檢。

    2.1.3 分離培養(yǎng)與觀察

    無菌操作取病料肝臟、心血分別接種于普通肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂平板培養(yǎng)基、血液瓊脂平板培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基上,置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h,觀察其生長變化情況。

    2.1.4 運動性觀察

    用滅菌的接種針取液體肉湯培養(yǎng)物穿刺半固體培養(yǎng)基,置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h,觀察其生長情況。

    2.1.5 生化試驗

    用滅菌的接種針取液體肉湯培養(yǎng)物接種細菌生化常規(guī)微量鑒定管,置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h,觀察其生長發(fā)酵情況。

    2.2 動物致病性試驗

    將以分離菌接種于營養(yǎng)肉湯37℃培養(yǎng)24h,應用平板稀釋法計數(shù)含菌量,使其達到8×108cfu/ml。將小鼠分成2組,每組5只,試驗組腹腔注射0.5ml菌液,對照組腹腔注射0.5ml無菌生理鹽水。隔離飼養(yǎng)1周,記錄小鼠發(fā)病率和病死率,剖檢死亡小鼠,觀察病變并分離細菌。

    2.3 藥敏試驗

    采用紙片平板擴散法(K-B法),取純培養(yǎng)物,無菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,培養(yǎng)16~18h得到幼齡菌液。取幼齡菌液0.1ml于普通營養(yǎng)瓊脂平板表面,用“T”形涂布棒涂勻,待其稍干后,用無菌鑷子將藥敏試紙均勻等距貼在培養(yǎng)基表面,置37℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)18~24h,觀察并記錄抑菌圈的直徑,以抑菌圈直徑大小作為判定細菌對藥物敏感性的標準。

    判定標準:抑菌直徑<10mm為耐藥;抑菌直徑10~15 mm為中度敏感;抑菌直徑>15 mm為高敏[2]。

    3 試驗結果及分析

    3.1 涂片染色結果

    取培養(yǎng)物涂片固定,經(jīng)革蘭氏染色后觀察,可在顯微鏡下看到中等大小革蘭氏陰性的小桿菌,多單個存在、少部分成對存在,未發(fā)現(xiàn)芽胞和無莢膜。該形態(tài)特征與綠膿桿菌的形態(tài)特征相同。

    3.2 分離培養(yǎng)結果

    病料接種37℃培養(yǎng)24h觀察。結果該菌在普通培養(yǎng)基生長出光滑、濕潤、微隆起、邊緣整齊的中等大小的菌落,該培養(yǎng)均能產(chǎn)生水溶性的綠色素和熒光素,使培養(yǎng)基呈藍綠色;血液培養(yǎng)基上菌落周圍有透明的溶血環(huán),說明該分離菌具有溶血作用;分離菌在肉湯培養(yǎng)基中呈混濁生長。上部液面呈藍綠色,表面有白色菌膜形成;在SS瓊脂上也生長良好,培養(yǎng)72h后有的菌落中央呈綠棕色;在麥康凱培養(yǎng)基上生長良好,呈白色菌落,培養(yǎng)基呈暗色;三糖鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,試管底部不出現(xiàn)黃色,說明該分離菌不能產(chǎn)生硫化氫。以上培養(yǎng)特性與綠膿桿菌的培養(yǎng)特性相同。

    3.3 運動性觀察結果

    在穿刺的半固體培養(yǎng)基中呈放射狀生長,培養(yǎng)基上層呈綠色,說明該分離菌具有鞭毛,能運動,能產(chǎn)生水溶性的綠色素。

    3.4 生化試驗結果

    本菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,不分解乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇。尿素水解緩慢,不產(chǎn)生硫化氫和吲哚。能還原硝酸鹽,V-P試驗和M.R試驗均為陰性。以上結果與綠膿桿菌的生化試驗結果相同。

    3.5 動物致病性試驗結果

    小鼠后接種分離菌于10~20h內(nèi)全部死亡,接種小鼠死亡前均出現(xiàn)精神沉郁,身體抖動。對照組觀察7d未見異常。剖檢死亡小鼠可見肝、脾、肺、腎臟明顯腫大;脾臟嚴重充血,肝臟有出血點,腎臟出血;肺臟充血,皮下有膠凍樣淡綠色滲出液,并能從死亡的小鼠臟器中分離到接種菌。

    3.6 藥敏試驗結果

    分離菌株對鹽酸左旋氧氟沙星、乳酸環(huán)丙沙星高敏,對卡那霉素、丁胺卡那霉素、硫酸銨普霉素、頭孢噻呋鈉、多黏菌素、青霉素、鏈霉素等藥物產(chǎn)生了耐藥。

    4 討論

    (1)通過該病的流行病學、臨床癥狀、病理剖檢變化以及實驗室診斷結果綜合分析,該羊場本次疾病的發(fā)生和流行是由于綠膿桿菌感染引起。

    (2)根據(jù)藥敏試驗結果,對全場發(fā)病羊飲0.5%鹽酸左旋氧氟沙星,連飲3d。全場搞好衛(wèi)生,用百勝30消毒,每日1次。同時飼喂營養(yǎng)豐富的料,該病4d得到了有效的控制。

    (3)綠膿桿菌是一種條件性致病菌,對畜禽的致病力不強,未能引起人們的足夠重視。但是近年來,有關綠膿桿菌導致的畜禽疫病日漸增多,應引起重視[3]。

    (4)從藥敏試驗結果可以看出,綠膿桿菌對大多數(shù)藥物產(chǎn)生了耐藥性,因此在臨床治療該病時應盡量做藥敏試驗,根據(jù)藥敏試驗的結果選擇有效藥物,以免延誤治療時機。

    (5)該病預防主要是加強飼養(yǎng)管理。給予營養(yǎng)豐富的優(yōu)質飼料,禁止飼喂霉敗變質和被病原微生物污染的飼料,注重環(huán)境衛(wèi)生,定期消毒。

    [1]姚火春.獸醫(yī)微生物學實驗指導(第二版)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社,2011:19~21.

    [2]韓青松,簡永利,涂宜強,等.綠膿桿菌研究進展[J].畜牧與飼料科學,2012,33(1):122-124

    [3]周學章,田東林,鄧明旭.雛雞綠膿桿菌病病原菌的分離和鑒定[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2004(3):19-21.

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