抗白色念珠菌的海洋微生物的分離與鑒定

張靜楠+聶燦玉+趙勝楠+潘登+吳達+權(quán)春善+金黎明

摘 ? ?要：本文旨在從海洋沉積物樣品中分離篩選出具有抗白色念珠菌特性的細菌菌株。通過涂布平板法分離出112株菌株，通過初篩得到6株對白色念珠菌有拮抗作用的菌株，經(jīng)瓊脂擴散法培養(yǎng)復篩，最終得到1株拮抗效果最好的菌株，命名為NB04-N1，其抑菌圈直徑為（30.13±0.45） mm。16S rDNA測序鑒定結(jié)果證明該菌株為綠膿桿菌（Pseudomonas）。

關(guān)鍵詞：海洋微生物;白色念珠菌;16S rDNA鑒定

中圖分類號：Q938.8 ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.01.017

Isolation and Identification of Marine Microorganisms against Candida albicans

ZHANG Jingnan， NIE Canyu， ZHAO Shengnan， PAN Deng， WU Da， QUAN Chunshan， JIN Liming

（College of Life Science， Dalian Nationalities University， Dalian， Liaoning 116600， China）

Abstract： The objective of this study was to isolate marine microorganisms against Candida albicans from marine mud samples. 112 kinds of marine strains were separated by the method of coated plate method. A total of 6 strains were separated against Candida albicans by primary screening. 1 strain was screened after agar well diffusion method， named NB04-N1. The inhibition zone diameter was （30.13±0.45） mm. Finally， it was identified by 16S rDNA identification. The result showed that NB04-N1 belonged to Pseudomonas.

Key words： marine microorganisms; Candida albicans; 16S rDNA identification

白色念珠菌（Canidia albicans）又稱白假絲酵母菌，是一種真菌，廣泛存在于自然界，也存在于正常人體皮膚、口腔，上呼吸道，腸道及陰道中。它是條件致病性真菌，當機體免疫功能下降或正常菌群相互制約作用失調(diào)，白色念珠菌就會大量繁殖并改變生長形式（芽生菌絲相）侵入細胞，引起淺表性或深部的念珠菌感染，甚至引起系統(tǒng)性感染危及生命[1-2]。近年來，隨著臨床廣譜抗生素、免疫抑制劑、皮質(zhì)類固醇激素及抗癌藥物的使用，導致醫(yī)院內(nèi)條件致病性白色念珠菌感染日漸增多。與此同時，隨著抗真菌藥物的廣泛和長期應用，導致耐藥菌株大量出現(xiàn)，給臨床治療帶來更大的困難[2-3]。

目前篩選白色念珠菌拮抗菌株的來源主要有土壤、海洋兩個途徑。隨著人們對于陸生生物的長期研究，發(fā)現(xiàn)從陸生生物代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新菌種、新抗生素的幾率越來越小。而海洋微生物由于生活環(huán)境與陸生微生物相比較為特殊，可能產(chǎn)生有別于陸生微生物的次生代謝產(chǎn)物，因此成為近年來研究的熱點[4-7]。

本試驗從中國第6次北極考察海洋沉積物樣品中篩選能夠較好地抑制白色念珠菌的海洋微生物，并對其進行鑒定，為下一步研究其抗菌物質(zhì)活性，尋找可能的新的抗菌藥物打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1. 材 料

1.1.1 試驗材料 泥樣為中國第6次北極考察沉積物樣品，具體信息見表1。

白色念珠菌，購自中國微生物菌種網(wǎng)。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 ?PCR試劑，購自大連寶生物公司。葡萄糖、瓊脂、胰化蛋白胨、酵母浸粉，購自奧博星生物技術(shù)公司。氯化鈉，乙醇，氫氧化鉀等均為分析純，購自科密歐化學試劑公司。

通用培養(yǎng)基：酵母膏1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖10 g，瓊脂15～20 g，60%海水1 000 mL，pH值 7～7.5。

GPA培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 值4～6。

1.1.3 儀器與設(shè)備 MT180B-生化恒溫培養(yǎng)箱（新苗醫(yī)療器械制造公司）;JA12002型-電子天平（精密科學儀器公司）;超純水裝置（法國MILLIPORE）;LX-100-手掌型離心機（其林貝爾儀器制造公司）;MLS-3020-濕熱高壓滅菌器（日本SANYO）;HWY111-恒溫培養(yǎng)振蕩器（智誠分析儀器制造公司）;SW-OJ-2FD-潔凈工作臺（安泰安氣技術(shù)公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物的分離 采用涂布平板法分離菌株[8]。取海泥樣品0.5 g于試管中，加入4.5 mL 60%的海水，混勻，靜置2 h，取0.5 mL加入4.5 mL海水中，按梯度依次稀釋，做成7個不同的稀釋濃度，10-7至10-4稀釋濃度各取樣50 μL滴在平板培養(yǎng)基中間位置，用玻璃棒涂布。將上述接種完的培養(yǎng)皿，放在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，用接種針挑取形態(tài)不同的細菌單菌落，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。endprint

1.2.2 微生物的純化 采用平板劃線法純化菌株。用記號筆將分離實驗平板中待劃線純化的菌落編號，并相應地在劃線純化的平板上標明菌株編號。挑取菌落接種到培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到純化的菌株。

1.2.3 初篩 用微波爐加熱融化滅過菌的50 mL GPA培養(yǎng)基，放置于50 ℃的電熱恒溫鼓風干燥箱中保溫，待溫度降到50 ℃左右時，將白色念珠菌發(fā)酵液用移液槍吸取100 μL，接入裝有50 mLGPA培養(yǎng)基的三角瓶中輕輕晃動搖勻，迅速倒入平皿中，開蓋放置待冷卻凝固。用挑菌針將上述分離出的菌株挑取一塊放到注有白色念珠菌的GPA培養(yǎng)基中，然后置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，觀察是否有抑菌圈。

1.2.4 復篩 將初篩獲得的具有拮抗作用的菌株接種到100 mL液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)（180 r·min-1） 3～4 d，發(fā)酵液8 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min，取上清蒸濃縮，將5 mL濃縮液經(jīng)0.22 μm無菌微孔濾膜過濾得到粗發(fā)酵液。

采用瓊脂擴散法測定發(fā)酵液對白色念珠菌的抑菌活性。將白色念珠菌以0.1%的接種量加入GPA培養(yǎng)基中，平板凝固后打孔，將400 μL粗發(fā)酵液加入孔中，37 °C培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈的直徑。重復3次[9]。

1.2.5 菌株的鑒定 （1）形態(tài)鑒定。參考《伯杰細菌鑒定手冊》，主要觀察菌落在其適合的培養(yǎng)基上的生長狀況：細菌在固體培養(yǎng)基上的生長形態(tài)、顏色是否均勻一致，菌落個體表面及邊緣的生長狀況;在液體培養(yǎng)基上的渾濁狀況、沉淀狀況、液面菌膜狀況;半固體上穿刺接種后，觀察細菌是否沿著接種線生長以及其生長狀態(tài)是呈毛刷樣生長還是均勻生長，上下生長是否一致[10]。（2）16S rDNA鑒定。將所得的菌株16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物送至大連寶生物公司測序，測得序列后，利用Blast軟件把所測的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中所有已測定的原核生物16S rDNA序列進行比較，確定菌株的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離結(jié)果

從3份樣品中共篩得112個菌落。

2.2 對峙培養(yǎng)初篩結(jié)果

經(jīng)對峙培養(yǎng)，篩選出6株對白色念珠菌有抑制性的菌株。

2.3 細菌發(fā)酵液的抗菌活性測定結(jié)果

對6株菌株發(fā)酵液進行復篩，得到1株抑菌圈最大，即抑制效果最佳的菌株，命名為NB04-N1，其抑菌圈的直徑為（30.13±0.45） mm，見表2和圖1。

2.4 菌株的鑒定結(jié)果

2.4.1 形態(tài)鑒定結(jié)果 菌株NB04-N1的菌體有長絲狀形態(tài)，有褶皺，顏色呈黃綠色。在平板上顯示的形態(tài)為微隆起，邊緣整齊波狀的中等大菌落。

2.4.2 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將序列同NCBI基因庫里面記載的所有已測定生物的Nucleotide collection比較，根據(jù)供試菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出（圖2），NB04-N1與標準菌株P(guān)seudomonas聚到一起，被鑒定為綠膿桿菌（Pseudomonas）。

3 結(jié)論與討論

本試驗采用平板涂布法和對峙培養(yǎng)法對中國第6次北極考察海洋沉積物樣品進行分離和純化，從中得到112株菌株。用白色念珠菌作為指示菌，依照對峙培養(yǎng)法進行初篩，先初步選出6株對白色念珠菌具有拮抗作用的菌株。用瓊脂擴散法對菌株發(fā)酵液進行篩選，篩選出對白色念珠菌抗性最強的拮抗菌，編號為NB04-N1。對其進行形態(tài)鑒定、16S rDNA測序結(jié)果，得到的序列測序同Gen Bank數(shù)據(jù)庫里所記載的已測定的生物序列進行比較，最后確定其為綠膿桿菌（Pseudomonas）。

下一步將分離純化該細菌發(fā)酵液中的抗菌活性物質(zhì)，并對其結(jié)構(gòu)進行確定，以期尋找可能的新型抗白色念珠菌的藥物。這對于開發(fā)海洋微生物新型抗菌藥物具有一定的意義[9-10]。

參考文獻：

[1] 廖璞，程海平.白色念珠菌致病性研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2005，15（4）：470-472.

[2] 李莉，蘇天璐，苗翠，等.白色念珠菌對臨床常用抗真菌藥物的耐藥性分析[J].中國實驗診斷學，2011，15（1）：126-128.

[3] JARVIS W R. Epidemiology of nosocomial fungal infection with emphasis on Candida species[J] .Clin Infect Dis，1995， 20（6）：1526-1530.

[4] TARMAN K， LINDEQUIST U， WENDE K， et al. Isolation of a new natural product and cytotoxic and antimicrobial activities of extracts from fungi of Indonesian marine habitats [J]. Marine Drugs， 2011， 9（3）： 294-306.

[5] GEBREYOHANNES G， MOGES F， SAHILE S， et al. Isolation and characterization of potential antibiotic producing actinomycetes from water and sediments of Lake Tana， Ethiopia[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine，2013，3（6）：426-435.

[6] 韓曉，崔承斌，韓小賢.海洋微生物的分離培養(yǎng)與抗腫瘤活性篩選[J].國際藥學研究雜志，2008，35（4）：241-246.

[7] 熊楓，鄭忠輝.從深海沉積物中篩選具有抗菌、抗腫瘤活性的海洋真菌[J].廈門大學學報，2006，45（3）：419-423.

[8] 朱義明，洪葵.海洋動物中微生物的分離與抗金黃色葡萄球菌活性篩選[J].安徽農(nóng)學通報，2007（8）：36-38.

[9] 王碩，孟慶麗，武天嬌，等.抗金葡菌深海真菌的分離鑒定及抑菌譜研究[J].生物技術(shù)，2015，25（2）：169-172.

[10] 布坎南.伯杰細菌鑒定手冊[M].北京：科學出版社，1984.endprint