厚樸復(fù)方制劑對抗生素相關(guān)性腹瀉大鼠的治療作用

李建軍，李建國，溫　超，王　震

厚樸復(fù)方制劑對抗生素相關(guān)性腹瀉大鼠的治療作用

李建軍1,2，李建國2，溫超1，王震3*

[摘要]目的觀察厚樸復(fù)方制劑治療抗生素相關(guān)性腹瀉(Antibiotic-associated diarrhea，AAD)的作用。方法采用慶大霉素和頭孢拉定聯(lián)合灌胃制備抗生素相關(guān)性腸炎模型，將30只大鼠隨機分為正常組、模型組、厚樸復(fù)方制劑組。厚樸復(fù)方制劑組灌胃給藥每日2次，每次1.5 mL，共14 d；正常組和模型組給予同體積的生理鹽水。觀察各組大鼠給藥前后腸道菌群變化、血清二胺氧化酶(Diamine oxidase，DAO)和D-乳酸含量以及腸粘膜分泌型免疫球蛋白(Secreted immunoglobulin,SIgA)水平。結(jié)果與模型組相比，厚樸復(fù)方制劑組治療14 d時，腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量均顯著增多(P<0.01)；血清DAO和D-乳酸的含量均顯著降低(P<0.01)；腸粘膜SIgA水平均顯著升高(P<0.01)。結(jié)論長期應(yīng)用抗菌藥物能引起菌群失調(diào)和腸粘膜屏障損害。厚樸復(fù)方制劑治療AAD，能夠調(diào)節(jié)腸道菌群、修復(fù)損傷的AAD大鼠的腸粘膜屏障，包括菌群屏障、機械屏障和免疫屏障。

[關(guān)鍵詞]厚樸；抗生素相關(guān)性腹瀉；二胺氧化酶；D-乳酸；SIgA

[Abstract]ObjectiveTo observe the therapeutical effect of traditional Chinese medicine prescription containing Magolia of ficinalis on antibiotic-associated diarrhea in rats.MethodsTotal of 30 male rats were randomly divided into three groups:normal group (N group),antibiotic-associated diarrhea group (AAD group),treatment group (AAD+H group).Rats in AAD+H group were intragastrically administered with traditional Chinese medicine prescription containing Magolia of ficinalis,and the other two groups were intragastrically administered with normal saline lavage.After making the models of cidomycin and cefradine induced antibiotic-associated diarrhea,the variety of bacteria in intestinal tract was determined;the content of diamine oxidase and D-lactic in serum were measured;the level of secreted immunoglobulin in intestinal mucous membrane was observed.ResultsCompared with AAD group,Enteric bacilli,Bacillus bifidus and Bacillus acidi lactic in AAD+H group significantly increased,the content of diamine oxidase and D-lactic in serum significantly decreased,the level of secreted immunoglobulin in intestinal mucous membrane significantly increased(P<0.01)at 14 d after treatment.ConclusionLong period application of antibiotics could induce disorder of microbial floras and injury of intestinal barrier,increase intestinal injury.The praeparatum (containing Magolia of ficinalis)could improve the disorder of intestinal floras and strengthen intestinal mucous membrane barrier including ecological barrier,mechanical barrier and immunologic barrier in AAD rats.

收稿日期：2015-05-09

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201512006

Therapeutical effect of traditional Chinese medicine prescription containingMagoliaofficinalison antibiotic-associated diarrhea in ratsLI Jian-jun1,2,LI Jian-guo2,WEN Chao1,WANG Zhen3*(1.Graduate School of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.Brain Hospital Affiliated Hospital of The Armed Police Logistics College,Tianjin 300162,China;3.Department of Medical Science,Affiliated Hospital of The Armed Police Logistics College,Tianjin 300162,China)

Key words：Magoliaofficinalis;Antibiotic-associated diarrhea;Diamine oxidase;D-lactic;Secreted immunoglobulin

0引言

臨床長期使用抗菌藥物可導(dǎo)致抗生素相關(guān)性腹瀉(Antibiotic-associated diarrhea,AAD)，后者不僅加重了危重患者的病情，甚至增加患者的死亡率，給家庭及社會帶來沉重的負擔(dān)。有文獻報道，對于AAD患者，每天要多花費將近1 h進行額外的調(diào)查、治療和護理[1]?？咕幬锏膹V泛使用使AAD患病率呈上升趨勢。普遍認為，AAD沒有特效療法，依據(jù)以菌治菌的原理，微生態(tài)調(diào)節(jié)劑益生菌對抗菌藥物引起的腸道菌群失調(diào)有預(yù)防作用，對AAD患者腸道微生態(tài)平衡有調(diào)節(jié)作用，但其在抗菌藥物使用患者中應(yīng)用的安全性尚不確定。祖國醫(yī)學(xué)認為，腹脹是胃腸氣機不暢所致。厚樸具有理氣消脹、瀉熱通腑之功效，可促進胃排空及小腸推進，對中毒性腸麻痹有很好的療效。厚樸制劑能否改善AAD大鼠腸粘膜各種屏障功能成為醫(yī)學(xué)研究的熱點。本文觀察厚樸復(fù)方制劑在治療抗生素相關(guān)性腹瀉過程中腸道菌群、血清二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)和D-乳酸含量以及腸粘膜分泌型免疫球蛋白(Secreted immunoglobulin,SIgA)水平的變化，以期對AAD的臨床治療提供參考。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組SD大鼠(SPF級)，購自天津醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，30只，雄性，體重180~220 g，在室溫20~22 ℃、相對濕度45%~50%的動物房中飼養(yǎng)，光照周期10~12 h。

1.2主要試劑硫酸慶大霉素注射液(2 mL∶8 萬UA/支，山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司)；頭孢拉定膠囊(0.25 g/粒，石藥集團歐意藥業(yè)有限公司)；SIgA試劑盒(中國原子能科學(xué)研究院同位素研究所)。

1.3模型制備與給藥將30只大鼠隨機取出10只作為正常組，其余20只每只每日灌胃給藥量分別為硫酸慶大霉素210 mg和頭孢拉定240 mg，按用藥量配成濃度為75 g/L混合溶液(即14支慶大霉素與6粒頭孢拉定膠囊)，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，每只每次給藥3 mL,每日灌胃2次(每次灌胃前禁食2 h)，連續(xù)給藥7 d，造成AAD大鼠模型[2]。連續(xù)給硫酸慶大霉素和頭孢拉定7 d時，觀察大鼠出現(xiàn)精神萎靡,體重下降,毛色無光,肛周微紅,并出現(xiàn)不同程度的腹瀉，大便呈粒狀，但“稀濕”，水分含量相對增多，顏色加深，呈黑色，能輕易捏碎，碎后易粘手，說明造模成功。將20只造模成功的大鼠隨機分為模型組和厚樸復(fù)方制劑組。厚樸復(fù)方制劑灌胃給藥每日2次，共14 d；正常組和模型組給予同體積的生理鹽水。厚樸復(fù)方制劑：厚樸9 g，白術(shù)18 g，熟地30 g，干姜9 g，山萸肉30 g，龍骨18 g，牡蠣18 g，共150 g，各藥物加2倍水浸泡，30 min后將龍骨、牡蠣大火煎煮至沸后轉(zhuǎn)中火，20 min后加入其他藥物再煎煮15 min，過濾，再加適量水，煎煮15 min，過濾，合并兩次濾液，65 ℃恒溫水浴濃縮至2 g/mL，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，每只鼠每?.5 mL，2次/d。

1.4觀察指標(biāo)及測定方法

1.4.1腸道菌群檢測處死大鼠后，無菌操作從盲腸中取出內(nèi)容物，加生理鹽水稀釋，震碎搖勻，按常規(guī)培養(yǎng)方法進行細菌培養(yǎng)。以菌落形態(tài)，生化反應(yīng)以及革蘭染色鑒定腸桿菌、雙歧桿菌和乳桿菌。培養(yǎng)好的細菌經(jīng)鑒定后，計算每毫升盲腸內(nèi)容物中細菌的數(shù)量。

1.4.2二胺氧化酶和D-乳酸含量測定連續(xù)給予14 d后，以頸椎脫臼法處死大鼠，心臟取血5 mL，檢測血清二胺氧化酶和D-乳酸的含量。

1.4.3腸粘膜SIgA檢測腸腔粘液采集：取自幽門下10 cm處開始往回盲部方向15 cm腸段，平鋪濾紙上，沿縱切面剖開，用無菌PBS緩沖液沖洗干凈腸粘膜表面物質(zhì)，最后用載玻片在腸粘膜表面，輕輕刮取部分粘液，放入1.5 mL無菌EP管凍存待測。按試劑盒說明書，采用生物素-抗生物素標(biāo)記的酶聯(lián)免疫檢測法分析腸粘膜中SIgA水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件包進行處理，數(shù)據(jù)均采用±s表示，組間比較采用雙因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1腸道菌群的比較大量使用慶大霉素和頭孢拉定7 d，可導(dǎo)致腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌減少，與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而使用厚樸制劑治療后，腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌逐漸增多，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1　大鼠腸道菌群數(shù)量的比較(logCFU/g)

注：**與正常組比較，P<0.01；##與模型組比較，P<0.01

2.2血清DAO和D-乳酸含量測定模型組血清DAO和D-乳酸的含量均明顯高于正常組(P<0.01)，經(jīng)藥物治療后，血清DAO和D-乳酸的含量較模型組顯著降低(P<0.01)，見表2。

表2　大鼠血清DAO、D-乳酸及腸粘膜SIgA含量比較

注：**與正常組比較，P<0.01；##與模型組比較，P<0.01

2.3腸粘液SIgA含量測定長期使用慶大霉素和頭孢拉定的大鼠，可導(dǎo)致腸粘膜SIgA水平降低(P<0.01)，而使用中藥治療后，腸粘膜SIgA水平均較模型組顯著升高(P<0.01)，見表2。

3討論

正常人體腸道內(nèi)寄居著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物，以細菌為主，統(tǒng)稱為腸道菌群，其細胞總數(shù)高達1014、種類>1 000種，是人體細胞總和的10倍[3]。腸道正常菌群對宿主有消化、吸收、營養(yǎng)、生物拮抗等生理作用，參與人體的生理、生化、病理和藥理過程，與人體形成了相互依存、相互受益、相互協(xié)調(diào)又相互制約的動態(tài)平衡統(tǒng)一體，實際上已成為宿主生命必需的組成部分[4]。AAD是由于抗菌藥物的使用造成腸道菌群紊亂，改變腸粘膜分泌、吸收功能，加快腸蠕動，從而引起以嘔吐、腹瀉等臨床癥狀為主要表現(xiàn)的消化系統(tǒng)疾病，其發(fā)病的機制尚不明確，但與腸道菌群種類及數(shù)量上的失調(diào)有很大關(guān)系。Ladirat等[5]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌藥物所致腸道菌群失調(diào)的水平與用藥劑量相關(guān)，高劑量組菌群變化更明顯。腸道菌群變化的同時也影響機體攝入食物的消化吸收、腸道粘膜分泌免疫等功能。腸粘膜具有三類屏障功能，即腸道中正常存在的菌群所形成的菌膜屏障，腸粘膜完整的結(jié)構(gòu)所組成的物理機械屏障以及腸壁內(nèi)的免疫細胞、腸腔內(nèi)的免疫球蛋白形成的免疫屏障。免疫屏障包括多種免疫成分，以SIgA為主的體液免疫起主導(dǎo)作用。腸道致病菌多為革蘭陰性桿菌，SIgA與革蘭陰性桿菌有很強的親和能力。SIgA結(jié)合革蘭陰性桿菌后，可阻礙該菌在腸道粘膜表面的粘附和定植，從而減少后者的數(shù)量。SIgA能與毒素結(jié)合，起到中和毒素的作用；另外，可以與補體以及溶菌酶協(xié)同對腸道致病菌有直接殺菌作用。因此，SIgA是防御致病菌在腸粘膜粘附定植的第一道防線，在阻止腸源性感染中具有重要作用。

二胺氧化酶(DAO)是廣泛存在于哺乳動物和人類腸粘膜的上皮絨毛細胞內(nèi)，具有催化二胺活性的氧化酶，其活性與腸粘膜上皮絨毛的高度以及腸粘膜細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)的生化合成有密切關(guān)系。當(dāng)腸道粘膜受損，粘膜上皮細胞破壞時，DAO將流入腸腔，被暴露出的腸粘膜細胞間隙內(nèi)血管和淋巴管所吸收，導(dǎo)致血液中的二胺氧化酶含量以及活性都隨之升高[6-7]。因此，測定腸黏膜受損時血漿中的DAO含量，可以反映出腸黏膜受損情況[8]。腸道菌群紊亂時，條件致病菌也會進入腸腔腸粘膜上皮間隙，導(dǎo)致腸道粘膜屏障的進一步損傷以及菌群移位[9]。D-乳酸是腸道細菌獨有的代謝終末產(chǎn)物，哺乳動物和人類既不能生產(chǎn)，也不能代謝或僅緩慢代謝D-乳酸。腸粘膜正常時，血清中檢測不到D-乳酸，只有在腸道粘膜受損，上皮細胞破壞脫落時，腸腔內(nèi)的D-乳酸才會通過創(chuàng)面進入血流，在血液中檢測到。DAO的變化同時也會受到腸外因素和腸微生態(tài)環(huán)境的影響[10]。本實驗結(jié)果表明，AAD組大鼠血清DAO和D-乳酸含量明顯升高，說明抗菌藥物作用7 d后，大鼠腸粘膜屏障的完整性遭到破壞，腸屏障功能受損。

目前，對AAD中醫(yī)的辨證主要分型為脾腎陽虛、脾虛濕阻、濕熱內(nèi)蘊三證，在準(zhǔn)確辨證的基礎(chǔ)上，針對素體虛弱的病本采用健脾益氣之法，再根據(jù)兼證之不同以治其標(biāo)[11]，結(jié)合中醫(yī)理論維持機體狀態(tài)的平衡是關(guān)鍵。近年來，已經(jīng)有一些中藥制劑應(yīng)用于AAD治療的研究，如參苓白術(shù)散、腸寧湯、七味白術(shù)散[12-14]，效果顯著。厚樸 (Magnolia of ficinalis Rehd,et wils) 為木蘭科植物厚樸的干燥干皮、枝皮或根皮，是我國傳統(tǒng)芳香化濕中藥。厚樸味苦，具有溫中、化濕、行氣的功能，主治氣滯、食積、便秘。厚樸乙醇提取液具有很好的抑菌強度和抑菌范圍，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假絲酵母菌、芽孢桿菌等微生物均具有較好的抑制效果[15]。

本研究對厚樸復(fù)方制劑治療慶大霉素和頭孢拉定導(dǎo)致的抗生素相關(guān)性腹瀉大鼠腸道粘膜的菌膜屏障、機械屏障和免疫屏障進行了全面研究，結(jié)果表明，厚樸復(fù)方制劑對AAD大鼠腸粘膜的三種屏障均具有保護和修復(fù)作用，這為臨床提供了一個新的治療AAD的研究方向。

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作者單位：揚州市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇 揚州 255000