新型免疫佐劑研究進(jìn)展

趙思俊，孫曉亮，曲志娜，王　娟，曹旭敏，王淑婷，王曉茵，李雪蓮（.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心動(dòng)物產(chǎn)品安全監(jiān)測室，山東青島　6603；.青島易邦生物工程有限公司，山東青島　6603）

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新型免疫佐劑研究進(jìn)展

趙思俊1，孫曉亮1，曲志娜1，王娟1，曹旭敏1，王淑婷1，王曉茵1，李雪蓮2
（1.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心動(dòng)物產(chǎn)品安全監(jiān)測室，山東青島266032；2.青島易邦生物工程有限公司，山東青島266032）

摘要：隨著免疫學(xué)研究的不斷深入，研究開發(fā)高效、低毒、副反應(yīng)小的免疫佐劑具有重要的理論和實(shí)際意義。本文對(duì)不同類型的新型免疫佐劑的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，以期為免疫佐劑的研制提供參考。

關(guān)鍵詞：免疫佐劑；納米佐劑；研究進(jìn)展

免疫佐劑（immunoadjuvant），又稱非特異性免疫增生劑，其本身不具有抗原性，但同抗原一起或預(yù)先注射到機(jī)體內(nèi)后，能非特異性地改變機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答。1925年，法國免疫學(xué)家Gaston Ramon[1]第一個(gè)制備出明礬沉淀破傷風(fēng)類毒素，可特異性增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，隨后國內(nèi)外學(xué)者對(duì)免疫佐劑進(jìn)行了廣泛而深入的研究。目前，常見的佐劑有鋁佐劑、弗氏佐劑等傳統(tǒng)佐劑，以及γ-干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素（Interleukins，ILs）、脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物（ISCOMs）、CpG寡脫氧核苷酸、中藥多糖、納米材料等新型免疫佐劑。

鋁佐劑和弗氏佐劑是目前被廣泛使用的免疫增強(qiáng)佐劑，其作用機(jī)理主要是在機(jī)體注射部位形成抗原儲(chǔ)藏庫，使抗原緩慢釋放，刺激漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體。但鋁佐劑容易形成肉芽腫，甚至?xí)l(fā)生局部無菌性膿腫，引起機(jī)體過敏反應(yīng)；而且鋁膠冷凍后容易變性，所以含鋁佐劑的生物制品不宜冷凍。而弗氏佐劑中的礦物油不能被機(jī)體代謝，容易引起注射部位的炎癥反應(yīng)、肉芽腫、潰瘍和發(fā)熱等副反應(yīng)，因此該佐劑通常不能用于人類疫苗。隨著免疫學(xué)研究的不斷深入和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，科研工作者廣泛開展了新型基因工程疫苗、以抗體為核心的新型診斷試劑的研制。為了提高抗原，尤其是小分子抗原的免疫原性，近年來廣大學(xué)者對(duì)新型免疫佐劑進(jìn)行了研究。本文對(duì)近幾年來新型免疫佐劑的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1　新型油佐劑

隨著乳化技術(shù)的進(jìn)步，傳統(tǒng)礦物油佐劑逐漸被含油比例低的Seppic佐劑或MF59、AS03、AF03 和SE等新型油佐劑所取代。如MF59水包油型乳劑（主要成分為角鯊烯、聚山梨醇酯80和去水山梨醇三油酸酯）是目前研究較為熱門的佐劑之一。研究發(fā)現(xiàn)，其可依賴于適調(diào)蛋白MyD88的非Toll樣受體依賴性的信號(hào)通路，提高機(jī)體體液免疫反應(yīng)的水平，可同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫[2]，并于1997年被歐洲批準(zhǔn)作為流感疫苗佐劑使用，目前已廣泛用作各種亞單位疫苗佐劑。

2　脂質(zhì)體

脂質(zhì)體（liposome）作為藥物載體和疫苗載體，可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞對(duì)抗原的攝入，進(jìn)而發(fā)揮免疫佐劑作用。由于脂質(zhì)體中的磷脂酰膽堿等是細(xì)胞膜的正常成分，可以被生物降解，所以其本身無毒性且沒有免疫刺激效應(yīng)。脂質(zhì)體的大小、脂類組成以及所帶電荷是影響其發(fā)揮免疫佐劑性能的重要影響因素。Bal等[3]將卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）分別與免疫增強(qiáng)劑PAM和非甲基化的CpG寡核苷酸包裹于脂質(zhì)體中進(jìn)行測定，結(jié)果表明包裹于脂質(zhì)體的免疫增強(qiáng)劑刺激樹突狀細(xì)胞成熟的能力較游離的免疫增強(qiáng)劑更強(qiáng)；且“OVA+CpG”脂質(zhì)體組較CpG處理組，更能在小鼠機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生IgG2a，并能顯著促進(jìn)小鼠體內(nèi)IFN-γ的分泌。Aramaki等[4]用BSA脂質(zhì)體鼻內(nèi)免疫Balb/c小鼠。結(jié)果表明：特異性血清IgG和唾液IgA水平顯著升高，而只用BSA免疫的小鼠，其IgG、IgA水平未見明顯升高；無論脂質(zhì)體帶正負(fù)電荷或不帶電荷，均可使IgA水平顯著升高，表明黏膜免疫的活化與脂質(zhì)體電荷無關(guān)。

然而，由于脂質(zhì)體穩(wěn)定性較差，在一定程度上影響其在疫苗領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，因此，國內(nèi)外學(xué)者通過脂雙層頭部反應(yīng)基團(tuán)的聚合、磷脂酰尾部反應(yīng)基團(tuán)的聚合等方式提高單層或多層脂質(zhì)體的穩(wěn)定性[5-6]。Moon等[7]采用一種脂雙層間交聯(lián)的多層脂質(zhì)體載體（interbilayer crosslinked multilamellar vesicles，ICMVs）包裹蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)在較長時(shí)間內(nèi)維持在一個(gè)較高的濃度水平，其在血清環(huán)境中釋放包裹物的速度變得極慢，進(jìn)而發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用。

3　免疫刺激復(fù)合物

免疫刺激復(fù)合物（immunostinulating complex，ISCOM）是由皂甙、膽固醇、磷酸類酯相互作用形成的一種籠狀的結(jié)構(gòu)，是一類抗原傳遞系統(tǒng)的佐劑。ISCOM與蛋白質(zhì)或其它免疫原分子混合，通過表面疏水作用捕獲蛋白抗原，通過內(nèi)吞作用被APC攝取。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，ISCOM可誘導(dǎo)強(qiáng)的Thl和Th2免疫應(yīng)答，具有較好的靶向性和呈遞作用，能誘生較為明顯的主要組織相容性復(fù)合物I類分子限制性細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答[8]。ISCOM發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用時(shí)所需的抗原量很少，所以可作為亞單位疫苗的有效佐劑。研究表明，ISCOM是目前誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞作用最強(qiáng)的免疫刺激物[9]。ISCOM具有佐劑和抗原提呈的雙重功能，可同時(shí)激發(fā)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和體液免疫。

4　細(xì)胞因子佐劑

細(xì)胞因子是由活化的免疫細(xì)胞（單核、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等）和其他非免疫細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等）經(jīng)刺激而合成、分泌的一類生物活性物質(zhì)。研究表明，IL-12、IL-2、IFN-γ能有效增強(qiáng)CTL、自然殺傷細(xì)胞活性和抗原提呈作用，促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答。IL-2可促進(jìn)T細(xì)胞增殖，維持T細(xì)胞在體外生長，故又稱為T細(xì)胞生長因子。IL-2還可作用于T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，促進(jìn)機(jī)體免疫應(yīng)答[10]。IFN-γ分子量小，可自由出入細(xì)胞，作用無特異性，可增強(qiáng)T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性[11]。

5 CpG寡脫氧核苷酸

CpG寡脫氧核苷酸（CpG oligonucleotide，CpG-ODN）是含有非甲基化CpG胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸的脫氧核苷酸，也被稱作CpG島，是細(xì)菌DNA產(chǎn)生免疫刺激作用的核心序列結(jié)構(gòu)[12-14]。CpG DNA可促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化，并分泌IL-6，激活抗原遞呈細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，進(jìn)一步促進(jìn)CTL和NK細(xì)胞的活性，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫[14]。研究表明，CpG DNA與氫氧化鋁佐劑具有協(xié)同作用，可有效增強(qiáng)腫瘤抗原、雞蛋溶菌酶、卵白蛋白、流感疫苗等抗原的免疫效果[15]。非甲基化CpG DNA具有免疫刺激活性，能誘導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答和CD8 T細(xì)胞免疫應(yīng)答[16]?？傊?，CpG DNA具有獨(dú)特的免疫增強(qiáng)作用和免疫記憶增強(qiáng)作用，可以增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。CpG DNA可以促進(jìn)全身或局部黏膜的抗微生物作用，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更快速、更強(qiáng)烈、更有親和力和更持久的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

6　多糖佐劑

多糖（Polysaccharides）由多個(gè)單糖分子縮合、失水而成，是一類具有廣泛生物活性的生物大分子物質(zhì)，又稱多聚糖。中藥多糖特別是補(bǔ)益類中藥多糖一般都有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，是良好的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑；具有佐劑活性的多糖主要包括黃芪多糖、當(dāng)歸多糖、靈芝多糖、黨參多糖、枸杞多糖、淫羊藿多糖等。柳仲勛等[17]以當(dāng)歸多糖和當(dāng)歸內(nèi)脂作為乙型肝炎基因工程苗的佐劑，免疫效果明顯優(yōu)于鋁佐劑。馬興銘等[18]研究了枸杞多糖、豬苓多糖、茯苓多糖、靈芝多糖、黃芪多糖、當(dāng)歸多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響，結(jié)果顯示，6種多糖都能顯著增強(qiáng)噬中性粒細(xì)胞的功能，提高細(xì)胞免疫力，且枸杞多糖增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能的作用明顯優(yōu)于其他中藥多糖。

7　納米佐劑

納米佐劑（nano-particulate adjuvant）即為用納米材料做成的免疫佐劑。納米粒子一般為粒徑小于100 nm的超微粒子。納米粒子具有比表面積大、表面活性中心多、反應(yīng)活性高、吸附和催化能力強(qiáng)的特點(diǎn)，因此會(huì)產(chǎn)生體積效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)[19]；且納米粒子具有很好的生物相容性，能夠持續(xù)釋放抗原，使機(jī)體抗原維持在有效濃度。此外，納米粒子能夠?qū)ζ浔砻嫘再|(zhì)進(jìn)行修飾，可以使其引入功能分子。如具有靶向性的配體可以靶向到特定的細(xì)胞或者其他成份，使納米佐劑在免疫后能有效運(yùn)輸?shù)较鄳?yīng)的免疫細(xì)胞[20-22]。所以，用納米材料作免疫佐劑往往具有許多常規(guī)佐劑不可比擬的優(yōu)勢。

納米佐劑可分為無機(jī)納米佐劑和有機(jī)納米佐劑。如氫氧化鋁納米佐劑、磷酸鈣納米佐劑、活性炭納米佐劑等屬于無機(jī)納米佐劑；而殼聚糖及其衍生物納米佐劑、聚丙交酯乙交酯納米佐劑、蜂膠納米佐劑、多糖納米佐劑等為有機(jī)納米佐劑。下面以納米磷酸鈣和納米殼聚糖為例，分別闡明了無機(jī)納米佐劑和有機(jī)納米佐劑的特點(diǎn)。

7.1納米磷酸鈣

與鋁佐劑等傳統(tǒng)佐劑相比，磷酸鈣具有良好的生物安全性，在生物體內(nèi)可被有效降解，而且對(duì)注射部位無刺激作用，是較為理想的佐劑材料之一[23]。然而，磷酸鈣的合成工藝是影響其在臨床廣泛應(yīng)用的瓶頸。He等[24]將皰疹病毒蛋白包裹于粒徑小于1 μm的磷酸鈣顆粒，并免疫小鼠，檢測發(fā)現(xiàn)納米級(jí)的磷酸鈣作為免疫佐劑可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的IgG及抗體，能較好地保護(hù)機(jī)體免受皰疹病毒的感染，且對(duì)注射部位未產(chǎn)生明顯的紅腫熱痛等副作用。

7.2納米殼聚糖

殼聚糖是一種廉價(jià)天然聚合物分子，生物相容性好，可生物降解。納米殼聚糖對(duì)各種抗原的負(fù)載率很高，且具有一定的免疫活性，因此其在藥物和疫苗傳輸載體中具有極大的應(yīng)用前景。由于IL-2可有效刺激活化T細(xì)胞的分化和增殖，激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞從而清除細(xì)菌等病原體，促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞（naturalkiller cells，NK）的細(xì)胞毒作用等。Yang等[25]將IL-2的質(zhì)粒DNA包裹于殼聚糖中，與副傷寒疫苗聯(lián)合免疫小鼠，結(jié)果顯示，與裸DNA免疫組相比，其顯著提高了機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫水平，保護(hù)小鼠免受沙門氏菌的攻擊。也就是說，殼聚糖包裹IL-2質(zhì)粒DNA后，使DNA免受核酸酶降解，且使得IL-2發(fā)揮了良好的免疫佐劑作用。張馨玉等[26]系統(tǒng)研究了殼聚糖作為口蹄疫疫苗載體在不同免疫方式中的免疫效果，分別以滴鼻、口服、直腸和生殖道等4種黏膜免疫途徑進(jìn)行免疫。結(jié)果顯示，經(jīng)滴鼻和直腸途徑免疫，納米殼聚糖佐劑可顯著促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生抗體。

8　結(jié)語

開發(fā)研制新型免疫佐劑、增強(qiáng)抗原的免疫效力、減少毒副作用，將是免疫學(xué)科研工作者追求的目標(biāo)。理想免疫佐劑應(yīng)當(dāng)能夠誘導(dǎo)機(jī)體增強(qiáng)細(xì)胞或體液免疫的強(qiáng)度以達(dá)到保護(hù)要求；對(duì)動(dòng)物或人類，副作用最小，且免疫作用持久穩(wěn)定。同時(shí)，在選擇免疫佐劑時(shí)，既要發(fā)揮免疫佐劑的特性，又要綜合考慮與其毒性作用的最佳平衡點(diǎn)。隨著研究的不斷深入，尤其是納米技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用及其潛在的巨大優(yōu)勢，納米佐劑將是今后疫苗佐劑研究的一個(gè)重要方向，尤其是對(duì)于同時(shí)具有免疫刺激和載體特性的納米佐劑的篩選、佐劑活性產(chǎn)生的機(jī)理、動(dòng)物模型建立等方面的研究。

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（責(zé)任編輯：杜憲）

Study Progress of New Type of Immunoadjuvant

Zhao Sijun1，Sun Xiaoliang1，Qu Zhina1，Wang Juan1，Cao Xumin1，Wang Shuting1，Wang Xiaoyin1，Li Xuelian2
（1. Department for Safety Supervision of Animal Products，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Qingdao Yebio Biological Engineering Co.，Ltd.，Qingdao，Shandong 266032）

Abstract：With the development of immunology research，important theoretical and practical significance of the study of immunological adjuvant，with the characteristics of high efficiency，low toxicity and small adverse，were found out. In this paper，the research progress of different types of new immune adjuvant was reviewed，in order to provide a reference for developing immunoadjuvant.

Key words：immunoadjuvant；nano-particulate adjuvant；progress

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：S859.79中圖分類號(hào)：B

文章編號(hào)：1005-944X（2016）07-0058-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.07.019

基金項(xiàng)目：中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2014IF-003FF）

通訊作者：李雪蓮