淺談臨床定量PCR實驗室的質(zhì)量控制

王秀麗 徐振興

（廈門中醫(yī)院檢驗科，福建 廈門 361009）

淺談臨床定量PCR實驗室的質(zhì)量控制

王秀麗 徐振興

（廈門中醫(yī)院檢驗科，福建 廈門 361009）

定量PCR；質(zhì)量控制

PCR聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction）自問世以來以其高靈敏性、高特異性、高效性在某些疾病如感染性疾病、腫瘤、法醫(yī)學、及科學研究等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。PCR的高敏感性和高特異性已經(jīng)體現(xiàn)了其臨床診療價值，正因如此，對其檢測中的錯誤也會有放大作用，往往引起嚴重的后果。在醫(yī)患矛盾較為突出的今天，做好PCR檢驗質(zhì)量控制，發(fā)出正確的PCR檢測結(jié)果尤為重要。本文對實踐工作中的心得和體會進行了總結(jié)，對PCR檢驗的各個環(huán)節(jié)進行質(zhì)量控制，探討PCR檢驗分析中的質(zhì)量控制方法及實驗效果。

1 分析前的質(zhì)量控制

1.1 實驗室環(huán)境：嚴格遵守“各區(qū)獨立、注意風向”，禁止使用中央空調(diào)。

1.2 儀器設(shè)備的管理：儀器設(shè)備的正確使用、維護和校準是保證PCR結(jié)果準確的前提，對實驗室中的儀器設(shè)備如擴增儀、離心機、加樣器、真空泵、生物安全柜等建立一套規(guī)范化、標準的操作程序。

1.3 試劑的貯存與比對：試劑一般貯存在-20 ℃以下。通過肉眼觀察試劑盒應(yīng)完整無破損，標識清楚——廠家名稱、批準文號、生產(chǎn)日期、有效期等；在更換不同批號的試劑時，本實驗室還建立了不同批次試劑間的比對程序；試劑現(xiàn)用現(xiàn)配，避免提前配好。

1.4 檢驗者素質(zhì)：PCR都是微量操作，要想獲得穩(wěn)定可靠的檢測結(jié)果，操作人員就需要一定的專業(yè)技術(shù)知識與經(jīng)驗，要盡可 能做到知其然又知其所以然。從實際工作上來看，不同的操作者所獲得的測定結(jié)果往往差異也很大，因此，人員培訓(xùn)相當重要，尤其是內(nèi)部針對性的培訓(xùn)[1]。

1.5 標本的采集、運送、接收及編號：標本采集、運送、接收及編號是準確發(fā)放報告的基礎(chǔ)。有些患者特別是肝病患者很多都需要長期治療和定期復(fù)查，經(jīng)濟負擔非常重，有時會出現(xiàn)冒用醫(yī)保卡的現(xiàn)象，這就需要相關(guān)人員嚴格執(zhí)行對各類標本的查對。

2 分析中的質(zhì)量控制

2.1 PCR儀器的保養(yǎng)和校正：PCR儀是PCR擴增的關(guān)鍵儀器，儀器的保養(yǎng)是PCR儀能正常工作的前提。實驗室建立了標準化操作程序，本實驗室采用的是羅氏LightCycler480實時熒光PCR儀，嚴格按照儀器的說明書及儀器的標準操作程序進行日、周、月保養(yǎng)。儀器是否處于一個良好的工作狀態(tài)是檢驗結(jié)果正確與否的重要保障。

2.2 主要污染來源與防污染措施：做好PCR最重要的工作就是防治污染。實驗室中主要的污染來源：①實驗室樣本中含有的待測微生物；②PCR擴增產(chǎn)物引起的殘留污染。PCR擴增引起擴增產(chǎn)物累積增加，如果不采取有效的防污措施，在很短的時間內(nèi)累積的氣溶膠化的擴增產(chǎn)物就會污染實驗室中的耗材、試劑和儀器設(shè)備等，造成嚴重的后果。污染重在預(yù)防，為了避免實驗室污染，獲得準確、可靠的檢測結(jié)果，實驗室應(yīng)制定一套具體可行的污染防護措施并嚴格執(zhí)行。防污措施：①嚴格實驗室分區(qū)及嚴格遵守實驗室工作制度，不同分區(qū)的物品如加樣器、筆等不得混用，建立外來人員登記程序；②在每次實驗后可使用10%次氯酸鈉清洗實驗室包括工作臺面、加樣器、離心機等，然后再用70%乙醇或清水洗去殘留次氯酸鈉。本實驗室每次實驗結(jié)束后都將實驗操作板放入10%次氯酸鈉溶液中浸泡1 h，而且盛有次氯酸鈉的容器還要定期更換，本實驗室曾經(jīng)有段時間陰性對照曲線總是有抬頭，經(jīng)多方查找原因，確定是沒有及時更換浸泡實驗操作板的容器引起的；③紫外線照射。

2.3 室內(nèi)質(zhì)控：室內(nèi)質(zhì)控可以監(jiān)測與控制實驗室工作的精密度，提高常規(guī)檢驗工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗結(jié)果的一致性，是用以確定檢驗結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出的一項重要工作[2]。儀器、試劑、耗材、核酸提取操作等因素都會影響質(zhì)控品的檢測[3]。在每次實驗過程中按照本實驗室的室內(nèi)質(zhì)控要求測定陰性質(zhì)控，高、低值2種濃度的質(zhì)控血清。質(zhì)控樣本的擺放順序在每一次擴增檢驗時都相應(yīng)順延，以保證核酸提取和擴增中所有檢測結(jié)果都符合質(zhì)控要求。

2.4 室間質(zhì)控：室間質(zhì)量控制是實驗室質(zhì)量控制體系中重要組成部分，是保證患者的檢驗結(jié)果及其報告的準確性和可靠性，以及各個實驗室間檢測結(jié)果的可比性的重要手段。隨著PCR技術(shù)的發(fā)展與普及，PCR檢測的室間質(zhì)控越來越重要。本實驗室每年都積極參加省臨檢中心和衛(wèi)生部的室間質(zhì)評，并對反饋回來的室間質(zhì)評成績進行認真分析和總結(jié)，及時改正存在的問題。

2.5 利用患者就診資料進行質(zhì)控比對：檢測結(jié)果與臨床情況的相關(guān)性如何，需要掌握患者的主要臨床情況，包括患者的病情與變化情況；檢測項目和其他項目的相關(guān)性，如大三陽患者在未經(jīng)抗病毒治療下DNA很少陰性；前后檢測結(jié)果的對比，將本次檢測結(jié)果與上幾次檢測結(jié)果進行比較等，都是可行的方法[4]。這些可以通過醫(yī)師或者患者的溝通來做到，或者通過LIS檢驗系統(tǒng)的“報告查詢”功能來實現(xiàn)，從而保證實驗結(jié)果的正確發(fā)出。

3 分析后的質(zhì)控

這一階段質(zhì)量保證的主要工作如下：檢驗結(jié)果的正確發(fā)出，咨詢服務(wù)，以及對檢驗樣品的保存及處理[5]。

3.1 報告單的及時發(fā)出：檢驗報告單要求及時、準確、完整地發(fā)出，保證醫(yī)師能夠及時的獲得檢驗結(jié)果。同時需要有報告簽發(fā)和審核程序。檢驗者還應(yīng)切記保護患者隱私。

3.2 咨詢服務(wù)：實驗室應(yīng)主動的努力做好咨詢服務(wù)這項工作，在解釋檢驗結(jié)果時應(yīng)耐心、細致、有理有據(jù)。

3.3 檢驗樣品的保存和處理：每天實驗結(jié)束后，每份樣本吸取0.5mL血清到離心管中，放入2～8 ℃冰箱內(nèi)保存7 d。后由衛(wèi)生人員集中處理。

[1] 李金明.實時熒光PCR技術(shù)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2012:143.

[2] 李金明.感染性疾病免疫測定的室內(nèi)質(zhì)量控制[J].醫(yī)學檢驗與臨床,2007,18(1):3-6.

[3] 陳松.法醫(yī)DNA實驗室的DNA污染和防范[J].刑事技術(shù),2007(3): 16-20.

[4] 徐忠玉.發(fā)光免疫分析的質(zhì)量控制[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2010,7 (3):280-281.

[5] 葉應(yīng)撫,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].3版.南京:東南大學出版社,2006:113.

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