家蠶等昆蟲貯存蛋白的研究進展

侯成香 覃光星 郭錫杰

(江蘇科技大學蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江 212018)

家蠶等昆蟲貯存蛋白的研究進展

侯成香 覃光星 郭錫杰

(江蘇科技大學蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江 212018)

介紹了家蠶等昆蟲貯存蛋白的種類、結(jié)構(gòu)和分子量，貯存蛋白在家蠶等不同昆蟲體內(nèi)的表達差異及調(diào)控研究進展;總結(jié)了家蠶等昆蟲貯存蛋白所具有的作為蛋白質(zhì)與氨基酸的儲存庫、參與昆蟲新表皮的形成、載體運輸、抗逆免疫，以及參與卵的形成和成蟲蛋白的合成等功能;展望了家蠶等昆蟲貯存蛋白今后的研究應用方向。

昆蟲;家蠶;貯存蛋白;脂肪體;血淋巴

昆蟲擁有開放式的循環(huán)系統(tǒng)，血淋巴是其體內(nèi)組織、器官進行物質(zhì)交換的媒介，其中含有貯存蛋白(storage protein，SP)等大量可溶性蛋白質(zhì)。貯存蛋白，是昆蟲體內(nèi)的一種特異性蛋白，一般在幼蟲末齡或倒數(shù)第2齡期的脂肪體內(nèi)大量合成并進入血淋巴;在化蛹前被脂肪體選擇性吸收，以蛋白顆粒的形式貯存于脂肪體中;在隱成蟲期水解、為成蟲的生長發(fā)育等生理活動提供各種必須氨基酸，故被稱為貯存蛋白［1］。在昆蟲可溶性血蛋白中貯存蛋白的含量最高達60%;該蛋白為昆蟲在氨基酸的儲存與正常代謝(如蛻皮、變態(tài)及卵殼形成等)之間提供了一個緩沖環(huán)節(jié)，對昆蟲的生長發(fā)育、免疫等生理功能起著重要的調(diào)節(jié)作用［1］。

自20世紀60年代在紅頭麗蠅中發(fā)現(xiàn)貯存蛋白后，鱗翅目、直翅目、半翅目、雙翅目等昆蟲也有相關(guān)報道［2－3］。貯存蛋白普遍存在于昆蟲血淋巴中，因此對其分類、表達、調(diào)控及功能等方面的研究對進一步了解昆蟲體內(nèi)的物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)化與利用、免疫等功能具有重要的意義。本文就昆蟲貯存蛋白的分類、表達、調(diào)控及功能展開論述，供同仁參考。

1 昆蟲貯存蛋白的分類

貯存蛋白具有明顯的多樣性，依據(jù)其氨基酸組成、進化史、功能等可將其分為以下幾類:第1類，鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等昆蟲的芳基貯存蛋白(酪氨酸和苯丙氨酸的含量超過15%)，是一類常見的貯存蛋白;第2類，雙翅目幼蟲貯存蛋白2，與芳基貯存蛋白在進化上無關(guān)，但合成過程相似、數(shù)量少;第3類，鱗翅目昆蟲的富甲硫氨酸蛋白(甲硫氨酸含量超過4%);第4類，主要存在于保幼激素濃度低的幼蟲末齡期的保幼激素抑制蛋白;第5類，先后在煙草夜蛾、大蠟螟等昆蟲中發(fā)現(xiàn)的核黃素結(jié)合蛋白;第6類，極高密度脂蛋白，該類蛋白具有藍色與密度極高2大特征;第7類，富酪氨酸蛋白，該類蛋白中酪氨酸含量高達27%，僅在化蛹前的幼蟲體內(nèi)合成并積累［4］。

盡管貯存蛋白曾被看作是幼蟲特異性蛋白，但不完全變態(tài)昆蟲在幼蟲期與成蟲期均有表達，這2個時期的貯存蛋白分別被稱為幼蟲特異性貯存蛋白與成蟲持續(xù)性貯存蛋白;不同于完全變態(tài)昆蟲中貯存蛋白在幼蟲期急劇表達及高濃度的狀況，不完全變態(tài)昆蟲如蚜蟲，其貯存蛋白在若蚜期與成蟲期積累程度與含量無明顯變化［5］。因此，完全變態(tài)與不完全變態(tài)昆蟲中貯存蛋白的結(jié)構(gòu)、功能等方面的異同有待于進一步研究。

貯存蛋白大都屬于六聚體蛋白家族，由6個相同或相似的分子量為70～90 kD的亞基組成，其分子量約為500 kD;家蠶芳基蛋白由2種異源六聚體BmSP2與BmSP3以3∶3的比例組合而成［6］。進化上昆蟲貯存蛋白與節(jié)肢動物的血藍素和酚氧化酶(prophenoloxidase，PPO)前體、雙翅目的貯存蛋白受體屬于同一個家族，其中貯存蛋白因喪失了Cu2+連接位點而不具有輸氧功能;在這個家族中，PPO是起源蛋白，血藍素緊隨其后進化，貯存蛋白則從血藍素中進化而來［7］。

目前報道的家蠶具有貯存功能的蛋白主要有富甲硫氨酸蛋白的BmSP1、芳基貯存蛋白BmSP2與BmSP3、30K蛋白等［8－9］。其中30K蛋白屬于鱗翅目昆蟲低分子量載脂蛋白家族，是末齡幼蟲與蛹血淋巴中含量較高的一類蛋白，也是胚胎中的卵黃原蛋白的重要組成部分。家蠶中目前已經(jīng)鑒定了46個30K蛋白，根據(jù)結(jié)構(gòu)可以將其分為3個亞家族:典型30K蛋白、富含絲氨酸和蘇氨酸的30K蛋白、ENT肽結(jié)合蛋白。

2 昆蟲貯存蛋白的表達與調(diào)控

2.1 昆蟲貯存蛋白的表達

昆蟲中，貯存蛋白主要在脂肪體中合成、表達，但其轉(zhuǎn)錄本在諸如表皮、中腸、腦及生殖腺等組織中也有表達。一般變態(tài)昆蟲的幼蟲在末齡或倒數(shù)第2齡期階段的脂肪體中大量合成貯存蛋白，隨后將之分泌到血淋巴中并積累到一個很高的濃度，化蛹時由特異性的貯存蛋白受體調(diào)節(jié)、通過內(nèi)吞的方式被脂肪體選擇性攝取、在細胞內(nèi)形成貯存蛋白顆粒，為成蟲器官、組織的形成提供氨基酸來源。

不同昆蟲中貯存蛋白的表達狀況存在差異。如在印度谷螟［10］、果蠅［11］體內(nèi)，幼蟲早期階段貯存蛋白的表達水平很低，從3齡開始表達量迅速上升，至末齡最后階段達到峰值;然后從預蛹期表達水平開始下降，至成蟲期降到最低水平。這些昆蟲的貯存蛋白在幼蟲發(fā)育的早期階段就能檢測到，而在煙草天蛾［12］及家蠶［13］等昆蟲體內(nèi)，僅在幼蟲發(fā)育的后期階段才特異性地出現(xiàn)。

家蠶的貯存蛋白從4齡末期在脂肪體中開始合成并分泌到血淋巴中，血淋巴中該蛋白的濃度在5齡初期便不斷上升，至吐絲期達到峰值，隨后濃度逐漸降低，同時脂肪體中該蛋白的濃度則不斷上升，直到蛹的中后期逐漸水解。盡管家蠶的貯存蛋白具有相似的表達模式，但它們之間仍然有一些區(qū)別，如BmSP1具有明顯的性特異性，即在雌蠶中表達量很大、雄蠶中幾乎不表達;而BmSP2與BmSP3雖然不是雌性幼蟲特異性蛋白，但雌蠶中的表達量仍然明顯大于雄蠶。

30K蛋白也是由脂肪體合成、分泌進入血淋巴，但在幼蟲期和成蟲期都有表達;盡管家蠶的各30K蛋白表達的提升水平、起始時間及持續(xù)時間等方面存在差異，但總體上是協(xié)同調(diào)控的［9］。家蠶貯存蛋白與30K蛋白除了均具有貯存功能和在家蠶基因組中的排列具有相同的線性關(guān)系外，兩者間還有一些差異。如蛹期血淋巴中30K蛋白減少時，生殖腺中的量增加，而貯存蛋白則是脂肪體中的量增加;大多數(shù)家蠶30K蛋白基因位于nscaf2795重疊群的970 kbp區(qū)域內(nèi)，而家蠶貯存蛋白基因位于 scaffold17上［9，12］。

2.2 昆蟲貯存蛋白表達的調(diào)控

盡管貯存類蛋白在昆蟲發(fā)育中具有多重功能［13］，且家蠶芳基蛋白的晶體結(jié)構(gòu)也已闡明［6］;然而其調(diào)控機制仍不明確。有研究表明，昆蟲20－羥基蛻皮激素(20－h(huán)ydroxyecdysone，20E)、保幼激素(juvenile hormone，JH)在貯存蛋白的表達調(diào)控中起了重要作用［14－18］。

米蛾中，20E調(diào)控了脂肪體中含芳基蛋白在內(nèi)的貯存蛋白的表達、增加了該蛋白在轉(zhuǎn)錄與蛋白水平上的表達［14］;在分析米蛾［14］、煙草天蛾［15］的貯存蛋白基因時發(fā)現(xiàn)，這些基因的啟動子中存在蛻皮激素應答元件(ecdysone response element，ERE)、且ERE是核因子連接物;說明20E可能具有促進核因子、蛻皮激素受體等的連接，再連接到ERE上，進而以不同的蛻皮激素應答基因調(diào)控芳基蛋白的表達［16］。JH強烈抑制了富蛋氨酸類貯存蛋白的表達，但對芳基蛋白的表達無影響［17－18］。

家蠶30K蛋白的合成可能受其體內(nèi)保幼激素的影響，因為摘去家蠶幼蟲中能分泌保幼激素的咽側(cè)體后，其血淋巴中30K蛋白的表達量會迅速上升;另外，從蟻蠶到4齡末期的家蠶血淋巴中檢測不到30K蛋白，但在保幼激素含量開始迅速降低的5齡起蠶體內(nèi)，30K蛋白的濃度迅速升高［19－20］。

3 昆蟲貯存蛋白的功能

昆蟲貯存蛋白具有多樣性，不同物種的貯存蛋白之間存在差異，同一物種也能合成1～5種不同的貯存蛋白，且不管是同一物種的不同貯存蛋白還是不同物種的貯存蛋白的同源物之間，其合成模式、積累、使用方式等方面也存在差異，這導致了這些貯存蛋白的功能存在差異。它們不僅可作為昆蟲變態(tài)時氨基酸和能量的儲存庫，也可以作為激素的載體以調(diào)控白蟻等群居昆蟲的等級制度［21］，還具有參與表皮合成、性腺成熟、卵的產(chǎn)生及免疫等功能［1，13，22－23］。

3.1 蛋白質(zhì)與氨基酸的儲存庫

MUNN等［2］發(fā)現(xiàn)正在取食的紅頭麗蠅幼蟲能合成名為“麗蠅蛋白”的貯存蛋白，且以蛋白晶體的形式儲存在蛹脂肪體細胞中，成蟲期幾乎全部降解為氨基酸;因此認為，該蛋白可能是以蛋白質(zhì)和氨基酸儲存庫的方式起作用，其降解所得的寡肽或游離氨基酸為成蟲發(fā)育、生殖所利用。小菜蛾中也有類似的情況:從幼蟲末期逐漸大量表達貯存蛋白，在蛹的早期階段貯存蛋白含量達到峰值，隨后逐漸降低，雌蛹在羽化蛻皮4 h時貯存蛋白含量迅速上升至峰值的2/3左右，隨后再繼續(xù)下降［24］。

3.2 參與昆蟲新表皮的形成

應用放射性技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲體內(nèi)的貯存蛋白參與其表皮的形成［25－26］。LEVENBOOK等［26］將含放射性標記14C的苯丙氨酸注入到末齡紅頭麗蠅體內(nèi)，SDS－PAGE和放射自顯影研究發(fā)現(xiàn)，在7日齡幼蟲與蛹殼中均檢測到了未經(jīng)降解而直接進入表皮的麗蠅蛋白;另外，運用電泳、放射性標記等技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)紅頭麗蠅、煙草天蛾等昆蟲的芳基貯存蛋白參與了表皮、腸、圍食膜、氣管、馬氏管等含幾丁質(zhì)的組織的構(gòu)建。

3.3 載體運輸功能

昆蟲貯存蛋白在體內(nèi)親脂性物質(zhì)的運輸中具有重要作用。用亞致死劑量的擬除蟲菊酯處理小菜蛾的雌性幼蟲后，其體內(nèi)貯存蛋白的mRNA表達量明顯增高［27］。HAUNERL等［28］用等電聚焦技術(shù)研究發(fā)現(xiàn):棉鈴蟲體內(nèi)的2種貯存蛋白(即載脂貯存蛋白與芳基貯存蛋白)均能與疏水性殺蟲劑結(jié)合，并將其輸送到靶組織中，其中載脂貯存蛋白能非特異性地結(jié)合疏水性殺蟲劑，而芳基貯存蛋白與中等極性的殺蟲劑的結(jié)合能力很強;載脂貯存蛋白中含有大量的脂類成分，主要將殺蟲劑溶解在其脂類成分中再進行輸送，而芳基貯存蛋白的氨基酸與糖基殘基可能構(gòu)成了它與殺蟲劑的結(jié)合位點。

家蠶30K蛋白不僅能輸送甘油二酯、膽固醇、類胡蘿卜素等成分，也可以運送體內(nèi)非極性最強的石蠟，為防止家蠶體表干燥、適應外界環(huán)境起著重要作用。

3.4 免疫功能

在昆蟲發(fā)育進程中，貯存蛋白扮演了一個很復雜的角色。它可能作為環(huán)境和營養(yǎng)應答因子以幫助生物體在營養(yǎng)、疾病壓力下存活［21］，同時也具有免疫等功能［1，7］。

庫蚊與棉鈴蟲在應對細菌侵染的過程中，產(chǎn)生了可繼代的抗性個體;在這些抗性個體的血清中發(fā)現(xiàn)了有促凝集、可誘導的貯存蛋白［23，29］，且這些蛋白可能是庫蚊抗性產(chǎn)生并遺傳、繼代的原因［23］;貯存蛋白被脂肪體吸收時需要特定的受體，而庫蚊抗性的產(chǎn)生正是由于其功能受體喪失了中腸上皮細胞上的連接位點［30］。在蘇云金桿菌處理的煙芽夜蛾幼蟲體內(nèi)，貯存蛋白表達時Cry毒素(蘇云金桿菌分泌的毒素)的毒力降低了;且該蛋白在Cry毒素損傷的中腸的再生中有一定的潛能，而中腸的再生是昆蟲應對Cry毒素的抗性機制［22］。這些實驗證實了免疫誘導與昆蟲貯存蛋白的高水平表達有關(guān)。

在抵御細菌侵染的過程中，貯存蛋白的高表達現(xiàn)象不僅出現(xiàn)在雙翅目、鱗翅目昆蟲中，也出現(xiàn)在半翅目昆蟲中［31］。螺原體侵染葉蟬時，編碼貯存蛋白的基因上調(diào)表達;RNA干擾(RNA inteference，RNAi)抑制貯存蛋白基因的表達導致了類過氧化物酶(peroxidase，PO)活性的顯著降低及感染葉蟬死亡率的增高，說明貯存蛋白與被感染葉蟬體內(nèi)的PO活性及被感染宿主的存活率有關(guān)。該蛋白可能在其中扮演了一個雙重角色，即為螺原體和宿主細胞提供能量和氨基酸，以及促進宿主體內(nèi)PO活性的作用。

昆蟲貯存蛋白應對細菌侵染時會上調(diào)表達，在應對真菌侵染時表達量也會增高。大蠟蛾應對較高濃度的真菌孢子(105個/μL)侵染時，宿主的細胞和體液免疫被誘發(fā)，表現(xiàn)為血細胞密度的增加及連接到孢子或菌絲上的芳基貯存蛋白、載脂蛋白等表達量顯著增高［32］。這表明昆蟲能“感覺”到微生物侵染的程度并作出“適度”應答以確保存活。

家蠶30K蛋白能與真菌表面的葡聚糖連接，并參與PPO的激活從而干擾被注入家蠶蛹體內(nèi)的真菌菌絲的生長，這表明30K蛋白可能參與了家蠶免疫［33］。KIM等［34］發(fā)現(xiàn)家蠶30K蛋白的過表達可抑制細胞的凋亡，以延長宿主細胞的存活時間;但不同的30K蛋白對提高宿主細胞的存活能力有不同的效果［35］。

很多研究表明，昆蟲在應答病原物侵染時其貯存蛋白的表達量上調(diào);但在一些昆蟲中發(fā)現(xiàn)外源物入侵時該類蛋白表達量降低，一般認為昆蟲應答微生物的侵染對宿主來說代價高昂，因為它需要利用內(nèi)源性資源，如特異性的貯存蛋白和與生殖能力相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，以通過抑制代謝、營養(yǎng)貯存、生殖等生物過程中的相關(guān)基因的表達，作為免疫基因表達的代價，最終在代謝和免疫之間達到一個平衡，來維持機體的自身平衡［36－37］。

3.5 其他功能

OGAWA等［38］發(fā)現(xiàn)雌性家蠶體內(nèi)富甲硫氨酸貯存蛋白中的大量蛋氨酸被用于構(gòu)造卵殼、轉(zhuǎn)化為其它氨基酸，參與卵的發(fā)育。PAN等［22］發(fā)現(xiàn)，貯存蛋白盡管在成分與抗原上有分歧，但在利用上都參與卵的形成和成蟲組織蛋白的合成。

KOOPMSNSCHAP等［39］研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯甲蟲的芳基貯存蛋白對昆蟲成蟲的發(fā)育有一定的滯育作用。而在紅螢火蟲成蟲體內(nèi)，滯育個體中貯存蛋白的含量明顯高于同時期的非滯育個體［40］。

大部分的富含絲氨酸和蘇氨酸的30K蛋白基因也有一定的性特異性，即在精巢中大量表達而卵巢中幾乎不表達，可能與精子形成或受精過程有關(guān);另外，30K蛋白在胚胎發(fā)育后期被吞入胚胎腸腔，并在其內(nèi)水解，為蟻蠶的孵化提供能量［9］。

4 展望

貯存蛋白是一類從功能上進行分類的蛋白，該類蛋白經(jīng)歷了幼蟲、蛹、成蟲階段，為昆蟲的生長發(fā)育、變態(tài)、繁殖等生理功能提供氨基酸來源;同時，由于它具有較高的可誘導性、抵御外源物的特性及發(fā)育時期的獨特性，且與昆蟲發(fā)育、繁殖、免疫抗性關(guān)系密切，也是研究昆蟲進化、生長發(fā)育及變態(tài)期蛋白質(zhì)合成、代謝、功能、基因調(diào)控、性別與營養(yǎng)機制等方面的很好的模式分子。

目前在昆蟲貯存蛋白的研究領(lǐng)域中，合成與選擇性攝取以及從mRNA水平上揭示其表達的時期、性別和組織特異性方面研究得比較多，而對其調(diào)控機制、降解機制和降解后游離氨基酸合成新蛋白的具體過程等方面的研究較少。因此，從分子水平探究貯存蛋白的表達調(diào)控、激素調(diào)控、免疫等重要生理過程的關(guān)系是今后該類蛋白的重要研究方向。此外，作為親脂性殺蟲劑的載體，將殺蟲劑輸送到靶器官等方面的研究，對了解殺蟲劑的作用機制和害蟲防治也有重大意義。

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1007－0982(2016)04－0001－05

10.16839/j.cnki.zgcy.2016.04.001

2016－07－20;接受日期:2016－09－08

國家自然科學基金(編號 2735011202、31672358);江蘇省自然科學基金(編號BK20161364)。

第1作者信息:侯成香(1972—)，女，安徽馬鞍山，博士，副研究員。Tel:0511－85616550，E-mail:cxhou587@163.com