血美安對(duì)特發(fā)性血小板減少性紫癜小鼠免疫細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用

朱飛躍　王　華

(婁底市中心醫(yī)院血液內(nèi)科,湖南　婁底　417000)

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血美安對(duì)特發(fā)性血小板減少性紫癜小鼠免疫細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用

朱飛躍王華1

(婁底市中心醫(yī)院血液內(nèi)科,湖南婁底417000)

〔摘要〕目的通過(guò)建立特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)小鼠動(dòng)物模型，觀(guān)察血美安對(duì)ITP小鼠外周血細(xì)胞因子的影響，探討血美安的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。方法40只Balb/c小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(A組)、模型組(B組)、陽(yáng)性對(duì)照組(C組)、血美安(D組)組。除A組外，其余各組隔日注射豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)建立ITP小鼠模型。注射GP-APS 6 d后，A組和B組灌服0.9%氯化鈉溶液，C組醋酸潑尼松按5 mg/kg灌胃，血美安膠囊按含藥量為49.1 g/L灌胃。觀(guān)察小鼠一般情況，連續(xù)給藥14 d后處死小鼠;分離血清檢測(cè)血小板、干擾素-γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素(IL)-4水平。結(jié)果與A組比較，IFN-γ水平顯著升高(P<0.05);血小板和IL-4水平顯著下降(P<0.05)，IFN-γ/IL-4比值升高。與B組比較，D組IFN-γ水顯著下降(P<0.05);血小板和IL-4水平顯著升高(P<0.05)，IFN-γ/IL-4比值降低具有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論血美安可通過(guò)影響Th1/Tp細(xì)胞因子水平而對(duì)ITP免疫功能起到調(diào)節(jié)作用。

〔關(guān)鍵詞〕血美安;特發(fā)性血小板減少性紫癜;血小板;干擾素-γ;白細(xì)胞介素-4

1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院眼科

第一作者：朱飛躍(1970-),女,副主任醫(yī)師,主要從事血小板減少性紫癜的中藥治療研究。

特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)是一種獲得性的自身免疫性疾病，其特點(diǎn)為無(wú)明顯外源性病因引起的血小板數(shù)目減少和皮膚黏膜的出血，是臨床最為常見(jiàn)的出血性疾病，其發(fā)病與T細(xì)胞的異常激活、T細(xì)胞亞群及其功能改變等有關(guān)〔1〕。ITP是一種血小板在體內(nèi)被破壞導(dǎo)致出血的自身免疫性疾病，免疫異常已構(gòu)成了發(fā)病機(jī)制的核心。已有研究表明Th1/Tp的比例增高與ITP的發(fā)病和疾病狀態(tài)密切相關(guān)，并且呈明顯Th1優(yōu)勢(shì)反應(yīng)〔2〕，臨床研究表明血美安膠囊對(duì) ITP 治療床應(yīng)用效果理想且無(wú)明顯毒副作用〔3〕，但其對(duì)免疫功能調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立與ITP動(dòng)物模型，并以血美安進(jìn)行干預(yù)治療，檢測(cè)ITP小鼠血清細(xì)胞因子干擾素(IFN)-γ和白細(xì)胞介素(IL)-4的水平，探討該藥物治療ITP的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1模型制備本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用二級(jí)Balb/c小鼠，體重18～22 g，8周齡，共60只，雌雄各半(由南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。 40只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為陰性對(duì)照組 (A 組)10 只、 模型組 (B 組)10只、潑尼松陽(yáng)性對(duì)照組(C 組)10只、血美安組(D 組)10只。 造模參考文獻(xiàn)〔4～6〕制作實(shí)驗(yàn)性ITP動(dòng)物模型，即用豚鼠抗Balb/c小鼠血小板血清(APS)給Balb/c小鼠尾靜脈注射，于造模第1，3，5，7，9，11，13天給小鼠尾靜脈注射 APS 20 μl/20 g，造成小鼠外周血小板持續(xù)減少(相當(dāng)于正常值25%)即為成功模型。

1.2干預(yù)方法A 組：正常飼養(yǎng)，并予等量生理鹽水灌胃(四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字B040503-02)。B 組：以上述等量生理鹽水灌胃。C 組：予潑尼松0.5 mg/ml灌胃(浙江仙琚制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字p3021207)。D 組：以血美安膠囊灌胃(珠海安生鳳凰制藥有限公司 生產(chǎn)，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050633)，將膠囊中的顆粒粉末以生理鹽水配成混懸液，含藥量為49.1 g/L灌胃。 除正常組外，其余 3 組小鼠均按上述方法造模，并于造模第6日起均按 0.2 ml/10 g 體質(zhì)量灌胃，每日 1 次，連續(xù) 9 d。

1.3觀(guān)察指標(biāo)為觀(guān)察、監(jiān)測(cè)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠模型一般情況，是否能維持理想狀態(tài)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中先后以尾靜脈采血法以檢測(cè)對(duì)比小鼠血小板(PLT)計(jì)數(shù)情況。各組小鼠于造模第 15 日處死取材。 觀(guān)察一般情況，不良反應(yīng)，死亡情況，血小板計(jì)數(shù)變化，故最終實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組取材小鼠數(shù)分別為A組10只，B組8只，C組9只，D 組10 只。取小鼠外周血，ELISA方法檢測(cè)血清IFN-γ和 IL-4。96孔板分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液和待測(cè)樣品100 μl，37℃ 60 min，洗板5次，甩干;加生物素化的抗小鼠IFN-γ、IL-4 抗體100 μl，37℃ 60 min，洗板同前;加HRP標(biāo)記的親和素100 μl，37℃ 30 min，洗板同前;加底物工作液(TMB)100 μl，37℃避光15 min，加終止液100 μl，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光值(OD值)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，所有樣品孔OD值均減除空白孔值后計(jì)算IFN-γ和IL-4含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用 SPSS16.0 軟件行t檢驗(yàn)及方差分析。

2結(jié)果

2.1各組小鼠一般情況觀(guān)察 A組小鼠反應(yīng)靈活，毛色光潤(rùn)，喜活動(dòng)，主動(dòng)覓食，大便呈條狀。B 組小鼠在造模后的第 5 日即出現(xiàn)軟便，伴有活動(dòng)減少、喜扎堆、拱背、豎毛、毛不光潔等現(xiàn)象。 注射APS 后 24 h，除 A 組外，其余各組小鼠均出現(xiàn)明顯的皮下紫癜，可見(jiàn)到四肢、腹部、尾部有不同程度出血點(diǎn)和瘀斑。造模第 4 至 5 日出血點(diǎn)和瘀斑最為明顯。在造模第 14 日，與 B 組比較，C、D給藥組小鼠皮下紫癜都有不同程度減輕，其減輕程度各組基本相似。B 組及 C 組各有 12只和 21只小鼠在灌胃時(shí)出現(xiàn)死亡，尸解見(jiàn)肺部有挫裂傷，氣管內(nèi)殘留灌胃藥液，考慮死亡原因?yàn)楣辔笗r(shí)灌胃器誤插入氣管，導(dǎo)致小鼠窒息及肺部受損所致。

2.2血美安對(duì)ITP模型小鼠外周血血小板數(shù)量、細(xì)胞因子的影響與A組比較，B組IFN-γ水平升高，IFN-γ/IL-4比值明顯升高，外周血血小板數(shù)量和IL-4水平下降(P<0.01)。與B組比較，A組和D組均能降低ITP小鼠血清IFN-γ水平，顯著提升外周血血小板數(shù)量和IL-4水平，從而顯著減低IFN-γ/IL-4比值(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　血美安膠囊對(duì)ITP模型小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)、

與A組比較：1)P<0.01；與B組比較：2)P<0.05

3討論

ITP是一種獲得性的自身免疫性疾病，它是一種由血小板自身抗體所致的血小板減少性疾病，常反復(fù)發(fā)作，其特點(diǎn)為無(wú)明顯外源性病因引起的血小板數(shù)目減少和皮膚黏膜的出血，是臨床最為常見(jiàn)的出血性疾病〔7〕，其發(fā)病與T細(xì)胞的異常激活、T細(xì)胞亞群及其功能改變等有關(guān)。慢性原發(fā)性血小板減少性紫癜(CITP)病程較長(zhǎng)，大多在1年以上，治療棘手。另外，病人多反復(fù)使用腎上腺糖皮質(zhì)激素治療，長(zhǎng)期應(yīng)用激素治療無(wú)效，停用激素后副作用多〔8，9〕。近年來(lái)，中醫(yī)對(duì)于血小板減少性紫癜的治療取得了一定的成就，由豬蹄甲、地黃、赤芍、牡丹皮3種成分組合的血美安膠囊用于血熱傷陰夾瘀所致皮膚紫癜、赤衄、鼻衄、婦女月經(jīng)過(guò)多、口渴、煩熱、盜汗等ITP。但是，此藥物藥理機(jī)制研究仍然存在著一些問(wèn)題：①缺乏公認(rèn)的、統(tǒng)一的 診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)。有的醫(yī)家也未將急性型與慢性型區(qū)分開(kāi)來(lái)，從而造成療效分析缺乏客觀(guān)性、公正性〔10，11〕；②該病除了活血化淤法在臨床和實(shí)驗(yàn)方面研究較深入外，其對(duì)ITP免疫功能從實(shí)驗(yàn)角度研究其作用機(jī)制較少。本研究通過(guò)連續(xù)小鼠腹腔注射抗小鼠血小板抗體，使小鼠體內(nèi)血小板持續(xù)處于低水平，成功建立ITP模型。此種方法建立的模型不損害其他臟器特性又符合其發(fā)病的原因〔12〕，其臨床表現(xiàn)與ITP基本一致，便于直接觀(guān)察藥物的治療效果。本研究證實(shí)，血美安可能主要通過(guò)減低IFN-γ和提高IL-4水平影響Th1/Tp比值，調(diào)節(jié)ITP產(chǎn)生的細(xì)胞免疫功能紊亂，從而升高外周血血小板數(shù)量。

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〔2014-12-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

通訊作者：王華(1972-)，女，博士后，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

基金項(xiàng)目:婁底市科技局項(xiàng)目(No.2012-211)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R587.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6343-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.011