老齡大鼠呼吸系統(tǒng)病理和生理學(xué)變化

曾昭定　戴愛(ài)國(guó)　蔣永亮

(永州市中心醫(yī)院，湖南　永州　425000)

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老齡大鼠呼吸系統(tǒng)病理和生理學(xué)變化

曾昭定戴愛(ài)國(guó)1蔣永亮1

(永州市中心醫(yī)院，湖南永州425000)

〔摘要〕目的探討老齡SD大鼠呼吸系統(tǒng)病理和生理學(xué)變化。方法隨機(jī)將SD雄性大鼠分為成年組(6月齡)和老齡組(18月齡)，每組各20只，檢測(cè)其肺功能，肺系數(shù)(肺重量/體重)，肺組織病理生理改變以及支氣管肺泡灌洗液(BLAF)細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果大鼠肺功能檢測(cè)，老齡組與成年組大鼠相比，呼氣峰流量(PEF)、第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)及FEV0.3/用力肺活量(FVC)(%)均有所降低(P<0.01)；對(duì)成年組、老齡組大鼠體重、肺臟重量及肺臟系數(shù)進(jìn)行兩兩比較結(jié)果顯示不同月齡大鼠體重及肺臟重量具有極顯著性差異(P<0.00)，而肺系數(shù)則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≥0.05)；肺組織病理生理觀察，老齡組與成年組大鼠比較老齡大鼠肺臟存在生理性老化和退行性變，并且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加；支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)，老齡組白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)顯著高于成年組(P<0.00)。結(jié)論從呼吸系統(tǒng)病理和生理學(xué)方面觀察18月齡大鼠已經(jīng)處于老齡階段。

〔關(guān)鍵詞〕老齡；肺功能；肺系數(shù)；病理改變；生理改變；支氣管肺泡灌洗液

1湖南省老年醫(yī)院湖南省老年醫(yī)學(xué)研究所呼吸疾病研究室

第一作者：曾昭定(1986-)，男，碩士，主要從事老年慢性阻塞性肺疾病的研究。

我國(guó)人口老齡化加速發(fā)展，高齡化趨勢(shì)日益加劇〔1〕，據(jù)推算65歲及以上老年人口占總?cè)丝诘谋壤龑?000年的7．0%上升到2050年的30．4%〔2〕。因此，爭(zhēng)取健康老齡化與老年保健及抗衰老成為目前研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。然而，很多實(shí)驗(yàn)研究從倫理學(xué)角度不可能直接在人體進(jìn)行，所以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用。SD大鼠是目前我國(guó)藥物非臨床研究中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其特點(diǎn)為頭部狹長(zhǎng)，尾長(zhǎng)接近身長(zhǎng)，產(chǎn)仔多，生長(zhǎng)發(fā)育快，抗病能力強(qiáng)(尤以對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病的抵抗力強(qiáng))，自發(fā)腫瘤發(fā)生率較低，常用于營(yíng)養(yǎng)學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)和毒理學(xué)等研究〔3〕。然而，目前國(guó)內(nèi)對(duì)“老齡大鼠”這一概念沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，有的認(rèn)為14～16月齡為老齡大鼠〔4〕，而有的學(xué)者認(rèn)為18～20月齡為老齡大鼠〔5〕，也有報(bào)道24月齡甚至更大月齡才稱為老齡大鼠〔6〕。目前已經(jīng)有很多對(duì)SD大鼠生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)和主要臟器正常參考值的研究報(bào)道〔7，8〕，而國(guó)內(nèi)對(duì)老齡大鼠呼吸系統(tǒng)病理和生理學(xué)變化的報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)從呼吸系統(tǒng)病理和生理學(xué)角度對(duì)成年組和老齡組SD雄性大鼠的體重及肺部各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，旨在為今后老齡大鼠呼吸系統(tǒng)的研究提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠40只(6月、18月齡各20只)，由長(zhǎng)沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部提供，合格證號(hào)：NO.43006700001049。

1.2飼養(yǎng)條件及儀器飼養(yǎng)在SPF屏障系統(tǒng)中，室溫20℃～25℃，相對(duì)濕度51%～67%左右，照明12 h明亮，12 h黑暗。飲水：自來(lái)水過(guò)濾滅菌，置于高壓滅菌的飲水瓶中自由飲用。飼料：由長(zhǎng)沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部提供全價(jià)顆粒飼料。主要儀器：小動(dòng)物肺功能儀(美國(guó)BUXCO公司)，DHX75-B小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都儀器廠)，Maclab數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)(美國(guó)BUXCO公司)，PB602-s型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，普通光學(xué)顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)，低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，微量移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1大鼠肺功能測(cè)定在中南大學(xué)醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心進(jìn)行大鼠肺功能測(cè)定：以1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，分離氣管做V型切口，插入Y形管，Y形管兩端分別與流速、壓力傳感器相連，流速傳感器對(duì)應(yīng)端與小動(dòng)物呼吸機(jī)連接。設(shè)置潮氣量為10 ml/kg,呼吸頻率為60次/min。將流速、壓力傳感器分別與Maclab數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)連接。在描記一段平靜呼吸后，在呼氣末以注射器經(jīng)三通管迅速以相當(dāng)于潮氣量5倍的氣量充氣(相當(dāng)于深吸氣)，然后立即脫開，連接負(fù)壓(-25 cmH2O)抽氣造成深吸氣，所引起的容積變化經(jīng)微機(jī)處理計(jì)算出PEF、FEV0.3、FEV0.3/FVC。

1.3.2肺臟稱重及肺臟系數(shù)測(cè)定以1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠腹主動(dòng)脈放血處死(解剖前禁食12 h，不禁水)，取出肺臟后立即稱重(肺臟稱重前將其周圍脂肪組織和結(jié)締組織等剔除，并用濾紙吸去肺臟表面的血液及體液)，肺臟系數(shù)=肺重(g)/體重(100 g)。

1.3.3大鼠肺組織病理學(xué)觀察測(cè)完肺功能后，2 h內(nèi)將大鼠腹主動(dòng)脈放血處死，開胸夾閉除右肺中葉以外的所有肺葉，于右肺中葉灌注4%多聚甲醛(含1‰DEPC水)1～2 ml結(jié)扎，取下，置于4%多聚甲醛中固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片，厚度4 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察。

1.3.4支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行右心室灌注，去除肺血。開胸夾閉右支氣管，用10 ml生理鹽水，一般為37℃，室溫下(25℃左右)生理鹽水可應(yīng)用，進(jìn)行在體肺泡灌洗，緩慢的經(jīng)氣道把生理鹽水注入肺臟至大鼠肺逐漸變得膨脹、蒼白、至出現(xiàn)阻力，再回抽液體，如此反復(fù)進(jìn)行3次，最終回收量約8 ml左右，回收率為75%～85%左右。灌洗液做細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)，將BALF 1 500 r/min離心10 min，沉渣定量稀釋重懸后計(jì)數(shù)細(xì)胞。取BALF沉渣稀釋液少許，涂片，瑞氏染色作中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1大鼠外觀及體重比較成年組大鼠毛發(fā)順滑，有光澤，神情活潑，體重(380.36±13.02)g；老齡組大鼠毛蓬亂少光澤，顯得遲鈍少動(dòng)，反應(yīng)緩慢，缺少靈敏性，體重(592.38±38.71)g。

2.2大鼠肺功能比較與成年組大鼠相比，老齡組大鼠PEF、FEV0.3及FEV0.3/FVC均有降低(P<0.01)。見表1。

表1　不同月齡SD雄性大鼠肺功能比較

2.3病理形態(tài)觀察

2.3.1肺大體形態(tài)觀察成年組大鼠肺表面光滑平整，無(wú)出血及滲出物，呈淡粉紅色，大小正常，質(zhì)地均勻，彈性適當(dāng)；老齡組大鼠肺表面欠光滑，肺組織色澤灰暗，觸摸肺呈棉花樣感，甚至局部出現(xiàn)粘連。

2.3.2肺臟稱重及肺臟系數(shù)測(cè)定兩組大鼠體重及肺臟重量具有極顯著性差異(P<0.00)，而肺系數(shù)則無(wú)差異(P>0.05)。見表2。

表2　不同月齡SD雄性大鼠體重、肺重及

2.3.3光鏡觀察成年組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，大鼠肺泡結(jié)果完整，肺泡腔及間質(zhì)隙內(nèi)未見出血、水腫，各級(jí)支氣管壁有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中層平滑肌未增厚，氣道未見狹窄，未見明顯的肺泡腔擴(kuò)大及肺大泡的形成，肺泡隔血管無(wú)充血、淤血，支氣管纖毛排列整齊。老齡組大鼠與成年組大鼠相比肺組織結(jié)構(gòu)欠清晰，各級(jí)支氣管壁有更多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見部分肺泡腔擴(kuò)大及肺大泡形成，其余則與成年組大鼠沒(méi)有多大差別。見圖1。

圖1　不同月齡SD雄性大鼠肺組織HE染色比較(×100)

2.4BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類老齡組大鼠白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)顯著高于成年組(P≤0.00)，見表3。

表3　不同月齡SD雄性大鼠BALF

3討論

隨著年齡的增長(zhǎng)，人體各系統(tǒng)的器官結(jié)構(gòu)會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的老化，并伴隨器官功能的減退，而呼吸系統(tǒng)的改變尤為顯著。同樣，大鼠各器官隨著增齡也出現(xiàn)類似的老化。大鼠的肺臟在經(jīng)歷生長(zhǎng)期和發(fā)育期之后，即開始隨著增齡出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和形態(tài)的改變及其功能的進(jìn)行性減退。

肺功能檢查能夠提供重要的臨床信息，可以確定并量化呼吸系統(tǒng)功能的缺陷和異常，有助于判斷有無(wú)通氣功能障礙，以及障礙的性質(zhì)和程度，可以作為某些肺疾患診斷的輔助手段。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明大鼠隨著年齡增加，小氣道阻力也相應(yīng)增加，存在一定的氣流受限、阻塞性肺通氣功能障礙。本文推測(cè)這些功能改變與呼吸系統(tǒng)結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，可能是隨著增齡其胸壁順應(yīng)性及肺彈性回縮力下降、呼吸肌動(dòng)力作用降低等導(dǎo)致的。同時(shí)，我們觀察老齡組SD雄性大鼠在增齡過(guò)程中肺功能儲(chǔ)備能力降低的更為明顯，說(shuō)明18月齡大鼠已經(jīng)處于老齡階段。

已知肺是具有彈性的海綿狀器官，肺泡腔增大，肺泡壁變薄，呼吸膜內(nèi)的基膜增厚是肺衰老的典型特征，即“老年肺”。 我們通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)18月齡大鼠的肺組織形態(tài)基本符合“老年肺”的特征〔9〕。臟器系數(shù)常能反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和內(nèi)臟的病變情況。動(dòng)物的臟器系數(shù)會(huì)受到物種，性別，年齡和環(huán)境的影響，可見它是一個(gè)非常重要的觀察指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明肺臟重量與體重比值并不隨著年齡增長(zhǎng)而增加。這一結(jié)果與王堯等〔8～10〕的研究相一致，而老齡組大鼠肺臟重量及肺系數(shù)與練有文等〔11〕研究的結(jié)果有一定的差異。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示老齡大鼠肺臟存在生理性老化和退行性變，這與馬佳等〔12〕研究的結(jié)果相一致。而且，老齡大鼠肺泡管和肺泡腔擴(kuò)大更加明顯，我們推測(cè)是由于隨著年齡的增長(zhǎng)呼吸細(xì)支氣管和肺泡區(qū)的部分彈性纖維退化、斷裂和盤繞有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)推測(cè)大鼠肺臟隨著年齡的增加，特別是進(jìn)入老年階段可能引起功能低下，從而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞增加。

綜上所述，不同SD大鼠其全身各項(xiàng)指標(biāo)會(huì)存在不同程度的差異，特別是隨著年齡的增加其全身指標(biāo)的變化更加明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明18月齡SD大鼠已經(jīng)處于老齡階段，其肺部病理生理改變符合老齡大鼠標(biāo)準(zhǔn)。

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〔2014-03-07修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

通訊作者：戴愛(ài)國(guó)(1966-)，男，教授，博士后，碩士生導(dǎo)師，主要從事肺動(dòng)脈高壓研究。

基金項(xiàng)目：湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011FJ6048)

〔中圖分類號(hào)〕R363

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6341-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.010