Wnt/β-catenin通路對大鼠腦出血的保護作用*

李治華，陳　曦，臧衛(wèi)東，郭付有#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室 鄭州 450001　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052

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Wnt/β-catenin通路對大鼠腦出血的保護作用*

李治華1)，陳曦2)，臧衛(wèi)東1)，郭付有2)#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室 鄭州 4500012)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052

關(guān)鍵詞腦出血；Wnt/β-catenin通路；RNA干擾；腦保護；大鼠

摘要目的：探討Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路對大鼠腦出血的保護作用機制。方法：96只成年SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組、腦出血組、腦出血假干預(yù)組、siDkk-1干預(yù)組4組，采用Real-time PCR方法檢測各組大鼠腦出血后24、72 h腦組織中Wnt-1和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β) mRNA表達的變化，采用Western blot法檢測各組大鼠腦出血后24、72 h腦組織中β-catenin表達的變化，各組大鼠處死前均進行行為學(xué)檢測。結(jié)果：大鼠腦出血后24和72 h，Wnt-1 mRNA水平與假手術(shù)組相比均降低，經(jīng)siDkk-1干預(yù)后，Wnt-1 mRNA 水平較腦出血假干預(yù)組升高(F=9.040和26.400, P均<0.05)。大鼠腦出血后24 和72 h，GSK-3β mRNA 水平與假手術(shù)組相比均升高，經(jīng)siDkk-1干預(yù)后，GSK-3β mRNA水平較腦出血假干預(yù)組下降(F=41.100和17.800, P均<0.001)。大鼠腦出血后24和72 h，β-catenin蛋白的表達較假手術(shù)組均升高，經(jīng)siDkk-1干預(yù)后，其表達較腦出血假干預(yù)組進一步升高(F=15.100和14.000, P均<0.05)。大鼠腦出血后24和72 h，刺激觸須前肢上抬比例較假手術(shù)組降低，經(jīng)siDkk-1干預(yù)后，前肢上抬比例較腦出血假干預(yù)組升高(F=2 450.000和2 230.000，P均<0.001)。結(jié)論：Wnt/β-catenin通路對腦出血大鼠有保護作用，可能是通過活化Wnt-1、抑制 GSK-3β，進而導(dǎo)致β-catenin 在胞漿中聚集、移位入核后啟動Wnt下游靶基因的轉(zhuǎn)錄所致。

AbstractAim: To investigate the neuroprotective effect of Wnt/β-catenin signaling pathway on intracranial hemor rhage(ICH) in rats.Methods: A total of 96 adult SD rats were allocated into sham-operation group,ICH group,ICH+vehicle-treated group,and ICH+siDkk-1 group.The mRNA expressions of Wnt-1 and GSK-3β were assessed by Real-time PCR at 24 and 72 h after ICH respectively. The expression of β-catenin was evaluated by Western blot analysis. Behavioral test was performed by the vibrissae-elicited forelimb-placing test in different groups.Results: There were remarkably down-regulated expression of Wnt-1 mRNA following ICH at 24 and 72 h, and the mRNA level of Wnt-1 was elevated after siDkk-1 administration(F=9.040 and 26.400, P<0.05). Increased GSK-3β mRNA expression was observed at 24 and 72 h after ICH, and the mRNA level of GSK-3β were reversed after siDkk-1 administration(F=41.100 and 17.800, P<0.001). Western blot analysis showed that β-catenin protein was increased at 24 h and 72 h after ICH respectively, and the level of β-catenin was further up-regulated after being treated by siDkk-1 compared with ICH+vehicle-treated group(F=15.100 and 14.000, P<0.05). Meanwhile, decreased behavior scores regarding forelimb use asymmetry was found in the ICH group. However, the behavior scores regarding forelimb use asymmetry was improved after siDkk-1 administration than those in the ICH+vehicle-treated group at 24 and 72 h after ICH(F=2 450.000 and 2 230.000, P<0.001).Conclusion: Wnt/β-catenin signaling pathway has neuroprotective effects against secondary brain injury following ICH, which may be associated with activation of Wnt-1, inhibition of GSK-3β resulting in β-catenin aggregation in the cytoplasm,subsequent nuclear translocation and the downstream neuroprotective gene transcription.

腦出血是臨床上嚴重威脅人類生命的最常見的腦血管疾病之一。研究[1-2]發(fā)現(xiàn)：Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在蛛網(wǎng)膜下腔出血和脊髓損傷后均能發(fā)揮重要的神經(jīng)保護作用。Dickkopf-1(Dkk-1)是調(diào)控Wnt通路的關(guān)鍵負性因子[3-5]，在正常腦組織中很少表達，但在缺血性腦卒中被強烈誘導(dǎo)表達。應(yīng)用 Dkk-1的拮抗劑或中和抗體誘導(dǎo)Wnt經(jīng)典通路激活，在缺血性腦卒中發(fā)揮了腦保護作用[6]。此外，有研究[7]報道，視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞可以通過Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路的激活對光所致的感受器損害具有神經(jīng)保護作用；相反玻璃體內(nèi)注射Dkk-1能夠使視網(wǎng)膜Wnt/β-catenin通路的保護作用消失。研究[8]發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路不僅可誘導(dǎo)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的表達，而且在調(diào)控血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的發(fā)育及促進BBB的腦內(nèi)皮細胞完整性方面發(fā)揮重要作用[9-10]；而誘導(dǎo)BDNF表達可促進神經(jīng)功能恢復(fù)和維持BBB穩(wěn)定性，進而減輕血管源性腦水腫，對神經(jīng)有顯著的保護作用。目前有關(guān)Wnt通路在大鼠腦出血中的表達及能否對腦出血產(chǎn)生神經(jīng)保護作用均未見文獻報道。因此，該研究擬通過構(gòu)建表達Dkk-1靶向小干擾RNA(siDkk-1)的慢病毒載體對腦出血大鼠進行干預(yù)，探討激活Wnt通路能否發(fā)揮神經(jīng)保護作用，從而為臨床治療腦出血提供新途徑。

1材料與方法

1.1實驗動物及模型制作選用河南省實驗動物中心提供的體重275~300 g、成年SD雄性大鼠，共96只，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉后固定在腦立體定位儀上，于前囟前0.2 mm、中線向右旁開3.5 mm處鉆一直徑1 mm的骨孔，用26號針頭經(jīng)骨孔垂直進針，深度5.5 mm，到達基底節(jié)區(qū)，用微量注射泵將提前抽取的大鼠股動脈血(100 μL)緩慢注入右側(cè)基底節(jié)區(qū)，留針10 min以防血液沿針孔溢出，無菌骨蠟封閉骨孔，縫合切口。具體方法參見文獻[11]。

1.2表達Dkk-1 siRNA慢病毒載體的構(gòu)建按照Elbashir等[12]提出的RNAi序列設(shè)計原則，結(jié)合慢病毒載體的特征，由上海銳勁生物技術(shù)有限公司合成針對Dkk-1的慢病毒包裹的特異siRNA片段，實驗用量為2×107個傳導(dǎo)單元(transducing units，Tu)。

1.3動物分組及處理實驗共分為假手術(shù)組、腦出血組、腦出血假干預(yù)組、siDkk-1干預(yù)組4組，每組24只；其中每個時間點(24、72 h) 取6只大鼠采用Real-time PCR檢測Wnt-1、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)基因表達的變化，其余動物用Western blot檢測腦組織中β-catenin蛋白表達的變化；不同組別大鼠處死前均進行行為學(xué)檢測。假手術(shù)組留置注射針而不注射血液。siDkk-1干預(yù)組于制作腦出血模型前2 d，術(shù)側(cè)腦室(腦室立體定位坐標(biāo)參考前囟后1.5 mm、中線旁開1.0 mm、腦表面下3.2 mm[13])給予體外成功構(gòu)建且穩(wěn)定表達的siDkk-1的慢病毒載體10 μL。腦出血假干預(yù)組給予轉(zhuǎn)染試劑包裹的無關(guān)序列10 μL。

1.4大鼠腦組織中Wnt-1、GSK-3β mRNA水平檢測Trizol法提取腦組織總RNA，檢測濃度后取1 μg，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，再進行Real-time PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix EX Taq(2×)10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL(表1)，ddH2O 7 μL，總體積20 μL。Real-time PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min。根據(jù)各個樣本PCR反應(yīng)的Ct值進行相對定量。腦出血組和siDkk-1干預(yù)組目的基因的表達水平分別用其相對于假手術(shù)組和腦出血假干預(yù)組相應(yīng)基因表達水平的倍數(shù)來表示(2-ΔΔCt)，具體操作方法參照文獻[14]。

表1　引物序列和擴增產(chǎn)物大小

1.5大鼠腦組織中β-catenin蛋白表達的Western blot檢測大鼠麻醉后灌注處死，取出大腦，在額極后方4 mm處切取3 mm厚的冠狀切片，取血腫周圍1 mm外腦組織(以防血液污染)，然后將取得的理想標(biāo)本置入0.5 mL蛋白裂解緩沖液內(nèi)并超聲打碎，持續(xù)30 s，離心15 min，取10 μL上清液用于蛋白質(zhì)濃度分析，其余上清液加蛋白上樣緩沖液混勻煮沸，取50 μg的蛋白樣品加入到聚丙烯酰胺電泳槽內(nèi)電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(PVDF)膜上，脫脂牛奶封閉2 h后，依次加入β-catenin一抗(按11 000稀釋，Cell Signaling Technology公司)和β-actin一抗(按13 000稀釋，北京銳抗生物科技有限公司)、二抗(按12 000稀釋，均為上海威奧生物科技有限公司產(chǎn)品)，TBST徹底清洗PVDF膜，加ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑后立刻在FluorChem E機器上進行曝光，依據(jù)條帶的相對灰度值判斷蛋白的表達水平。

1.6行為學(xué)檢測采用刺激觸須前肢上抬實驗進行大鼠行為學(xué)評估：觀察大鼠在輕觸患側(cè)觸須時，對側(cè)前肢上抬并成功觸及桌面的情況，重復(fù)10次。當(dāng)右側(cè)基底節(jié)受損時，大鼠左側(cè)前肢出現(xiàn)無力癥狀，計算左側(cè)上肢成功上抬的比例。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較各組大鼠不同時間點腦組織中Wnt-1和GSK-3β mRNA、β-catenin蛋白表達的變化以及行為學(xué)的變化，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1各組大鼠不同時間點腦組織中Wnt-1 mRNA表達水平的變化見表2。

表2　各組大鼠不同時間點

*：與腦出血假干預(yù)組相比，P<0.05。

2.2各組大鼠不同時間點腦組織中GSK-3β mRNA表達水平的變化見表3。

表3　各組大鼠不同時間點

*：與腦出血假干預(yù)組相比，P<0.05。

2.3各組大鼠不同時間點腦組織中β-catenin蛋白表達水平的變化見表4。

表4　各組大鼠不同時間點

*：與腦出血假干預(yù)組相比，P<0.05。

2.4各組大鼠不同時間點行為學(xué)檢測結(jié)果見表5。

表5　各組大鼠不同時間點行為學(xué)檢測結(jié)果　%

*：與腦出血假干預(yù)組相比，P<0.05。

3討論

經(jīng)典Wnt通路又稱Wnt/β-catenin通路，在存在Wnt配體的情況下，抑制GSK-3β，導(dǎo)致β-catenin在胞漿中聚集，隨后移位至胞核。在細胞核內(nèi)，β-catenin與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，激活Wnt下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而參與多種疾病的病理生理變化。該研究結(jié)果顯示：大鼠腦出血后Wnt-1 mRNA水平降低，GSK-3β mRNA水平升高，β-catenin蛋白表達升高；經(jīng)siDkk-1干預(yù)后，Wnt-1激活，GSK-3β被抑制，β-catenin進一步升高，同時改善了腦出血大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。行為學(xué)表現(xiàn)的改善表明激活的Wnt通路在腦出血早期具有腦保護作用；此外，作者前期的動物實驗(待發(fā)表)發(fā)現(xiàn)siDkk-1通過激活Wnt通路，能夠減輕伊文藍外滲和腦組織含水量，說明Wnt通路的激活可能通過誘導(dǎo)β-catenin的大量表達，進而啟動Wnt下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進受損BBB一定程度的修復(fù)，發(fā)揮了腦保護的作用。

作者在研究中還發(fā)現(xiàn)，大鼠腦出血后Wnt-1 mRNA和β-catenin蛋白表達趨勢不完全一致：大鼠腦出血后Wnt-1被抑制，但是與假手術(shù)組相比，β-catenin蛋白升高，推測原因可能是除了Wnt-1 以外，還存在其他上調(diào)胞質(zhì)β-catenin蛋白表達的信號通路，例如Wnt 蛋白家族的其他成員，如Wnt-3a、Wnt-8a、Wnt-8b等[15]亦通過穩(wěn)定胞質(zhì)β-catenin 水平來介導(dǎo)下游事件；此外PTEN、EGFR通路[16]或β-catenin 降解機制的異常也可導(dǎo)致β-catenin 在胞質(zhì)濃度的升高，因此，胞質(zhì)β-catenin受調(diào)節(jié)的因素很多，它的表達可不完全與Wnt-1一致。

Wnt/β-catenin 通路在腦出血中的表達目前文獻報道極少。2014年Zhou等[17]發(fā)現(xiàn)腦出血后Wnt-3a和β-catenin分別在第3和7天達峰值，而且Wnt-3a/β-catenin表達與細胞凋亡呈顯著正相關(guān)。但Wnt-1/β-catenin在腦出血中的表達及阻斷Dkk-1表達是否對腦出血具有腦保護作用尚未見文獻報道。鑒于Dkk-1是調(diào)控Wnt通路的關(guān)鍵負性因子，作者通過體外構(gòu)建穩(wěn)定表達Dkk-1 siRNA的慢病毒載體，對大鼠腦出血進行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：大鼠腦出血后腦組織內(nèi)Wnt-1 mRNA表達下調(diào)，而經(jīng) siDkk-1干預(yù)后不僅能夠激活Wnt-1 mRNA，使其表達上調(diào)，而且能夠改善腦出血大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。該實驗充分表明：通過應(yīng)用靶向小干擾技術(shù)獲得的siRNA治療腦出血可能是未來腦出血治療的新方向。

綜上所述，Wnt通路活化能抑制GSK-3β的活性，從而使胞漿內(nèi)β-catenin蛋白的水平升高，進而移位至胞核，激活Wnt下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮腦保護作用，改善行為學(xué)表現(xiàn)，但Wnt下游靶基因轉(zhuǎn)錄的具體機制還有待進一步研究。

參考文獻

[1]Yin ZS,Zu B,Chang J,et al.Repair effect of Wnt3α protein on the contused adult rat spinal cord[J].Neurol Res,2008,30(5):480

[2]李卓,姜惠麗,劉殿瑋,等.Wnt3α在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中對神經(jīng)發(fā)生的作用[J].山東大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2014,52(5):15

[3]Cappuccio I,Calderone A,Busceti CL,et al.Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is required for the development of ischemic neuronal death[J].J Neurosci,2005,25(10):2647

[4]Scott EL,Brann DW.Estrogen regulation of Dkk1 and Wnt/β-Catenin signaling in neurodegenerative disease[J].Brain Res,2013,1514:63

[5]Glinka A,Wu W,Delius H,et al.Dickkopf-1 is a member of a new family of secreted proteins and functions in head induction[J].Nature,1998,391(6665):357

[6]Mastroiacovo F,Busceti CL,Biagioni F,et al.Induction of the Wnt antagonist, Dickkopf-1, contributes to the development of neuronal death in models of brain focal ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,2009,29(2):264

[7]Braunger BM,Ohlmann A,Koch M,et al.Constitutive overexpression of Norrin activates Wnt/β-catenin and endothelin-2 signaling to protect photoreceptors from light damage[J].Neurobiol Dis,2013,50(1):1

[8]Yi H,Hu J,Qian J,et al.Expression of brain-derived neurotrophic factor is regulated by the Wnt signaling pathway[J].Neuroreport,2012,23(3):189

[9]Liebner S,Corada M,Bangsow T,et al.Wnt/beta-catenin signaling controls development of the blood-brain barrier[J].J Cell Biol,2008,183(3):409

[10]Artus C,Glacial F,Ganeshamoorthy K,et al.The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells[J].J Cereb Blood Flow Metab,2014,34(3):433

[11]Guo F,Hua Y,Wang J,et al.Inhibition of carbonic anhydrase reduces brain injury after intracerebral hemorrhage[J].Transl Stroke Res,2012,3(1):130

[12]Elbashir SM,Lendeckel W,Tuschl T.RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs[J].Genes Dev,2001,15(2):188

[13]He Z,Ostrowski RP,Sun X,et al.CHOP silencing reduces acute brain injury in the rat model of subarachnoid hemorrhage[J].Stroke,2012,43(2):484

[14]郭付有,宋來君,孫紅衛(wèi),等.破裂顱內(nèi)動脈瘤組織中Caspase-3 mRNA的表達與血管平滑肌細胞的凋亡測定[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2007,42(5):877

[15]Peifer M,Polakis P.Wnt signaling in oncogenesis and embryogenesis：a look outside the nucleus[J].Science,2000,287(5458):1606

[16]Brennan KR,Brown AM.Wnt proteins in mammary development and cancer[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,2004,9(2):119

[17]Zhou L,Deng L,Chang NB,et al.Cell apoptosis and proliferation in rat brains after intracerebral hemorrhage: role of Wnt/β-catenin signaling pathway[J].Turk J Med Sci,2014,44(6):920

*國家自然科學(xué)基金資助項目30801133

Neuroprotective effects of Wnt/β-catenin signaling pathway on intracranial hemorrhage in rats

LIZhihua1),CHENXi2),ZANGWeidong1),GUOFuyou2)

1)DepartmentofHumanAnatomy,SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

2)DepartmentofNeurosurgery，theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordsintracranial hemorrhage;Wnt/β-catenin signal pathway;RNA interference;neuroprotection;rat

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.006

中圖分類號R743

通信作者#，男，1973年10月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：腦血管病，E-mail：chyou666@hotmail.com