兩株紫花苜蓿根際芽孢桿菌的篩選及生防效果研究

劉莎莎，程園園，張丹，王曉丹，劉佳莉，郭長(zhǎng)虹

(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150025)

兩株紫花苜蓿根際芽孢桿菌的篩選及生防效果研究

劉莎莎**，程園園**，張丹，王曉丹，劉佳莉，郭長(zhǎng)虹*

(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150025)

摘要：從紫花苜蓿根際土中分離出2株芽孢桿菌(Bacillus spp.)菌株CYY-6和CYY-42，并評(píng)價(jià)了其對(duì)尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的抑制作用，及其對(duì)由尖孢鐮刀菌引起的苜蓿根腐病的防治效果。經(jīng)過(guò)形態(tài)觀(guān)察、16S rDNA序列分析和生理生化鑒定，確定菌株CYY-6為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，CYY-42為短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)。同時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這2株芽孢桿菌均能不同程度地合成嗜鐵素。在平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中，2株菌株均能對(duì)尖孢鐮刀菌產(chǎn)生拮抗作用，并產(chǎn)生抑菌帶，抑菌率分別為49.3%和56.3%。且其發(fā)酵液可以致使尖孢鐮刀菌菌絲及孢子生長(zhǎng)異常，出現(xiàn)菌絲扭曲、斷裂、破碎，孢子數(shù)量明顯減少等現(xiàn)象。在盆栽實(shí)驗(yàn)中，2株菌株對(duì)由尖孢鐮刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的相對(duì)防效分別為57.55%和64.03%，在紫花苜蓿根腐病防治方面具有較好的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌；紫花苜蓿；生物防治；尖孢鐮刀菌；根腐病

Isolation, identification, and biocontrol effects ofBacillusspp. from the rhizosphere of alfalfa

LIU Sha-Sha**, CHENG Yuan-Yuan**, ZHANG Dan, WANG Xiao-Dan, LIU Jia-Li, GUO Chang-Hong*

KeyLaboratoryofMolecularCytogeneticsandGeneticBreedingofHeilongjiangProvince,CollegeofLifeScienceandTechnology,HarbinNormalUniversity,Harbin150025,China

Abstract:The aims of this study were to identify two Bacillus spp., CYY-6 and CYY-42, isolated from the rhizosphere of alfalfa, and to evaluate their ability to inhibit Fusarium oxysporum, the causal pathogen of alfalfa root rot. Based on physiological, biochemical, morphological, and 16S rDNA sequencing analyses, strain CYY-6 was identified as Bacillus licheniformis and CYY-42 as Brevibacillus brevis. Both strains were able to synthesize siderophores, although at different levels. In a dual culture assay, both strains inhibited the growth of F. oxysporum. Based on the inhibition zones, the inhibitory rates of CYY-6 and CYY-42 against F. oxysporum were 49.3% and 56.3%, respectively. The fermentation broth of each strain resulted in deformed growth of the mycelia and spores of F. oxysporum. The mycelia were twisted, broken, or fragmented, and the number of spores was significantly decreased. Strains CYY-6 and CYY-42 showed 57.55% and 64.03% inhibition of alfalfa root rot in pot experiments, indicating that both strains have potential applications in controlling alfalfa root rot.

Key words:Bacillus spp.; alfalfa (Medicago sativa); biocontrol; Fusarium oxysporum; root rot

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上栽培最廣的優(yōu)質(zhì)多年生豆科牧草，具有產(chǎn)草量高、再生性強(qiáng)、利用年限長(zhǎng)、適口性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)。至今，紫花苜蓿在我國(guó)的種植歷史已超過(guò)兩千年，是我國(guó)種植面積最大的牧草[1-3]。然而隨著種植年限和種植面積的增加，紫花苜蓿病害也隨之出現(xiàn)，如根腐病、褐斑病、霜霉病、白粉病等，其中紫花苜蓿根腐病(root rot)是一種世界性病害，會(huì)危害紫花苜蓿的各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，主要癥狀表現(xiàn)為根部出現(xiàn)壞死斑，根莖腐爛中空，側(cè)根大量腐爛死亡，莖葉全部枯死，嚴(yán)重影響紫花苜蓿的品質(zhì)和產(chǎn)量[4-6]。據(jù)估計(jì)，全世界紫花苜蓿每年因根腐病造成的產(chǎn)量損失在20%~40%[5]，而通過(guò)對(duì)黑龍江省8個(gè)地區(qū)的紫花苜蓿根腐病進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該病害發(fā)生普遍，嚴(yán)重地塊發(fā)病率高達(dá)92%，這種病害還會(huì)隨著種植面積和年限的增長(zhǎng)而加重[7]。雖然紫花苜蓿根腐病病原復(fù)雜，但據(jù)研究表明多與鐮刀菌有關(guān)[4,8-9]。

防治苜蓿根腐病的主要方法有選育苜蓿抗病品種、采取農(nóng)業(yè)措施和使用化學(xué)殺菌劑等[5]，但由于苜蓿根腐病屬于土傳病害，上述方法的防治效果往往不太理想。因此，篩選對(duì)紫花苜蓿根腐病菌(鐮刀菌)有較強(qiáng)抗性的生防菌株并用于紫花苜蓿生產(chǎn)，將會(huì)有效解決紫花苜蓿根腐病病害問(wèn)題，同時(shí)對(duì)紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。生防菌株一般通過(guò)產(chǎn)生抗真菌代謝物或通過(guò)誘發(fā)系統(tǒng)抗性來(lái)防治植物病害[10]。芽孢桿菌是一類(lèi)好氧或厭氧、桿狀、產(chǎn)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性菌[11]，能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如嗜鐵素、溶菌酶(蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶)和抗真菌脂肽等[10]，因其營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、繁殖速度快，能產(chǎn)生抗逆耐熱的芽孢，有利于生防菌劑的制備和劑型的加工生產(chǎn)[12]，因此芽孢桿菌在生物防治方面被廣泛地研究應(yīng)用。目前，還沒(méi)有關(guān)于應(yīng)用芽孢桿菌防治紫花苜蓿根腐病的報(bào)道。

本研究從紫花苜蓿根際土中分離鑒定了2株芽孢桿菌菌株，評(píng)價(jià)其對(duì)尖孢鐮刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的防治效果，為開(kāi)發(fā)苜蓿根腐病的生防菌劑奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　土壤樣品采集

供試土樣于2013年9月中旬取于哈爾濱師范大學(xué)試驗(yàn)田中生長(zhǎng)的紫花苜蓿根際，將土樣帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存。

1.2　植物病原真菌

尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)分離自田間患根腐病的大豆病根，屬大豆專(zhuān)化型，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物免疫研究室提供。

1.3　培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)、溶菌肉湯培養(yǎng)基(luria-bertani，LB)[13-15]，鉻奧醇培養(yǎng)基(chrome azurol sulphonate，CAS)[16]，改良的金氏B培養(yǎng)基(Modified King’s B，MKB)[17]。

1.4　土樣中芽孢桿菌的分離純化

稱(chēng)取5 g土樣，加入盛有玻璃珠和45 mL無(wú)菌水的錐形瓶中，在培養(yǎng)搖床上劇烈振蕩30 min(37℃)后于80℃的水浴鍋中保持15 min。將懸濁液稀釋10-3、10-4和10-5，從其中各取100 μL于PDA平板上涂布，置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)1~3 d，待平板上出現(xiàn)較多單菌落時(shí)，在無(wú)菌條件下挑取菌落形態(tài)、顏色等性狀不同的單菌落于PDA平板劃線(xiàn)純化至第6代，制成甘油菌-80℃保存。

1.5　分離菌株的鑒定

1.5.1分離菌株的16S rDNA序列分析采用CTAB/NaCl方法提取細(xì)菌DNA。根據(jù)原核生物16S rDNA保守序列通用引物。

F8：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；F1541：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min(共30個(gè)循環(huán))；72℃延伸10 min。將所得產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序，得到16S rDNA序列后，通過(guò)一套在DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比較的分析工具(basic local alignment search tool，BLAST)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性分析。

1.5.2生理生化鑒定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]和《南伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[15]對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察及生理生化鑒定。

1.6　芽孢桿菌嗜鐵素合成能力的分析

定性測(cè)定參照Schwyn和Neilands[16]的方法，將已分離的菌株接種于CAS培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2~3 d，觀(guān)察菌落周?chē)囵B(yǎng)基上有無(wú)形成橘黃色的透明暈圈。

定量測(cè)定采用水溶性色素產(chǎn)生菌鐵載體的定量檢測(cè)法[17]，等體積的樣品與CAS檢測(cè)液反應(yīng)后，在630 nm處測(cè)得的吸光值為A，對(duì)照為去離子水加CAS檢測(cè)液，測(cè)得的值記作Ar，樣品中嗜鐵素的相對(duì)含量為A/Ar。

1.7　分離菌株抑菌能力測(cè)定

1.7.1平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)采用平板對(duì)峙法[18]，將植物病原真菌尖孢鐮刀菌接種于PDA平板中央，在平皿四周距邊緣2 cm處接種分離菌株，以只接種尖孢鐮刀菌為對(duì)照。28℃下恒溫培養(yǎng)5 d，測(cè)量尖孢鐮刀菌菌落半徑，并計(jì)算抑菌率：

抑菌率=[(對(duì)照菌落半徑-處理菌落半徑)/對(duì)照菌落半徑]×100%

1.7.2發(fā)酵液對(duì)病原菌絲及孢子生長(zhǎng)的抑制作用PDA板活化尖孢鐮刀菌，刮取培養(yǎng)基表面菌絲，接種于50 mL PDA液體培養(yǎng)基中。同時(shí)，取200 μL過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌發(fā)酵液也接入PDA液體培養(yǎng)基中，對(duì)照組不接種細(xì)菌發(fā)酵液。28℃振蕩培養(yǎng)2 d，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察不同處理尖孢鐮刀菌菌絲及孢子的生長(zhǎng)情況[19]。

1.7.3分離菌株對(duì)盆栽紫花苜蓿的防病作用參照張璐等[20]的方法，并稍作修改。紫花苜蓿種子經(jīng)表面殺菌后密播于無(wú)菌蛭石中，45 d后，將植株根部用石英砂揉搓制造傷口，分別浸入無(wú)菌水和培養(yǎng)2 d的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液中40 min，將植株重新種回?zé)o菌蛭石(每盆10株)，并實(shí)施如下處理：(a)無(wú)菌水；(b)接種尖孢鐮刀菌孢子懸浮液和無(wú)菌水；(c)接種尖孢鐮刀菌孢子懸浮液且施用CYY-6菌懸液；(d)接種尖孢鐮刀菌孢子懸浮液且施用CYY-42菌懸液。(c)和(d)處理組每2 d用分離菌株制成的菌懸液灌根，(a)和(b)處理組澆灌等量的無(wú)菌水。每處理4個(gè)重復(fù)，接種10 d后觀(guān)察記錄病情。參照陳雅君和崔國(guó)文[9]的病害嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將紫花苜蓿根腐病分為5級(jí)：0級(jí)為健康植株，無(wú)枯萎或腐爛癥狀；1級(jí)為主根或根莖局部出現(xiàn)病斑，面積低于10%，地上部分生長(zhǎng)良好；2級(jí)為主根及根莖出現(xiàn)連片病斑，面積在10%~30%，地上部分生長(zhǎng)較好；3級(jí)為30%~50%，主根及根莖出現(xiàn)病斑，地上生長(zhǎng)很差；4級(jí)為主根及根莖部病斑面積超過(guò)50%，全株枯死。根據(jù)病害嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算不同處理的病情指數(shù)和防治效果[19]。

1.8　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

嗜鐵素合成含量為平均值±SE，使用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用LSD法。

2結(jié)果與分析

2.1　芽孢桿菌的分離與鑒定

從試驗(yàn)田種植的紫花苜蓿根際土中分離出2株芽孢桿菌菌株CYY-6和CYY-42，用PDA培養(yǎng)基純化后觀(guān)察菌落形態(tài)，CYY-6菌落扁平，圓形或不規(guī)則形，邊緣裂片狀；CYY-42菌落圓形，邊緣整齊或嚙蝕狀。2菌株在接觸酶反應(yīng)、檸檬酸鹽利用、葡萄糖產(chǎn)酸、明膠液化實(shí)驗(yàn)中均呈陽(yáng)性；CYY-6在淀粉水解、V-P測(cè)定、厭氧生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中均呈陽(yáng)性，而CYY-20均呈陰性；CYY-6在pH 5.5和9.0及5%和7%(W/V)NaCl的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，而CYY-42均不能生長(zhǎng)(表1)。將已測(cè)得的CYY-6和CYY-42菌株的16S rDNA序列與相近種屬的16S rDNA進(jìn)行比對(duì)(圖1)，菌株CYY-6序列與Bacilluslicheniformisstrain KIBGE-IB4與Brevibacillusbrevisstrain MH1(150419319)的同源性達(dá)97%，再結(jié)合其菌落形態(tài)及生理生化特征初步鑒定CYY-6為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、CYY-42為短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevis)。

表1　菌株生理生化特征鑒定

注：+，陽(yáng)性；-，陰性。

Note: +, Positive; -, Negative.(281335878)的同源性達(dá)99%，菌株CYY-42序列

圖1　16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1　Phylogenetic tree derived from 16S rDNA gene sequence of CYY-6 and CYY-42　分支點(diǎn)上的數(shù)字為自展支持率(%)。括號(hào)內(nèi)序號(hào)為菌株在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)。標(biāo)尺代表序列分歧度。Numbers at each branch points indicate the percentage supported by bootstrap (%). Those in parentheses are the GenBank accession number. Bar represents sequence divergence.

2.2　分離菌株嗜鐵素合成能力分析

菌株CYY-6和CYY-42在CAS檢測(cè)培養(yǎng)基上均能夠形成橘黃色透明暈圈，說(shuō)明兩菌株都具有嗜鐵素合成能力。對(duì)兩菌株的嗜鐵素合成能力進(jìn)行定量測(cè)定，一般A/Ar值越小，其合成嗜鐵素的能力越強(qiáng)。如圖2所示，CYY-6嗜鐵素合成量為(2.577±0.091)，而CYY-42嗜鐵素合成量為(1.067±0.006)，由此可知CYY-42合成嗜鐵素能力顯著強(qiáng)于CYY-6(P<0.05)。

圖2　分離菌株嗜鐵素合成量Fig.2　Siderophore synthesis of isolates　　　*表示顯著水平(P<0.05)。 * indicates significant different level (P<0.05).

2.3　分離菌株抑菌能力測(cè)定

在PDA平板上，菌株CYY-6和CYY-42對(duì)尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)都有拮抗作用。如圖3可知，菌株CYY-42對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果好于CYY-6，抑菌帶更加明顯。CYY-6和CYY-42的抑菌率分別為49.3%和56.3%。

圖3　分離菌株對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用Fig.3　Antagonism of isolates against F. oxysporuma. 對(duì)照，b. CYY-6，c. CYY-42。a. Control, b CYY-6, c. CYY-42.

菌株CYY-6和CYY-42的發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲和孢子生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用。在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，對(duì)照組(CK)菌絲大量生長(zhǎng)，邊緣光滑，可見(jiàn)清晰的分支結(jié)構(gòu)，并伴有大量孢子生成。與對(duì)照相比，菌株CYY-6處理過(guò)的尖孢鐮刀菌菌絲明顯減少，菌絲體扭曲、斷裂，且孢子數(shù)量也明顯減少；CYY-42處理過(guò)的菌絲斷裂、破碎，細(xì)胞壁溶解、原生質(zhì)泄露，菌絲量和孢子量也明顯減少(圖4)。

圖4　尖孢鐮刀菌菌絲及孢子受拮抗菌作用后的異常形態(tài)(40×)Fig.4　Abnormal forms of the F. oxysporum mycelia and spores inhibited by the Bacillus spp. in PDA in vitro (40×)　a. 正常尖孢鐮刀菌菌絲及孢子，b. 受CYY-6抑制的菌絲和孢子，c. 受CYY-42抑制的菌絲和孢子。a. Normal mycelia and spores of F. oxysporum, b. Abnormal mycelia and spores of F. oxysporum inhibited by CYY-6, c. Abnormal mycelia and spores of F. oxysporum inhibited by CYY-42.

分離菌株生防能力的盆栽試驗(yàn)表明，僅破壞植株根部不接菌(圖5a)，植株根、莖、葉均生長(zhǎng)良好，無(wú)發(fā)病癥狀；僅接種尖孢鐮刀菌的紫花苜蓿(圖5b)，最初幾天部分植株葉片開(kāi)始逐漸枯萎，10 d后幾乎全部發(fā)病，植株根部發(fā)黑、腐爛、死亡，莖和葉幾乎全部枯死，病情指數(shù)達(dá)到86.88%；在用菌株CYY-6和CYY-42接種10 d后， 發(fā)病癥狀有所減輕，植株根部出現(xiàn)黑褐色斑點(diǎn)，但并未腐爛、死亡，根部生長(zhǎng)良好，植株少量葉片干枯，但莖和葉整體長(zhǎng)勢(shì)良好，病情指數(shù)分別為36.88%和31.25%(圖5c，d)。由此可見(jiàn)，與僅接種尖孢鐮刀菌的對(duì)照相比，菌株CYY-6和CYY-42都有防病效果，相對(duì)防效分別為57.55%和64.03%。

圖5　分離菌株對(duì)苜蓿根腐病的防治作用Fig.5　Biocontrol of root rot in alfalfa with bacterial isolates　　　a. 破壞根部，加無(wú)菌水；b. 接種尖孢鐮刀菌，加無(wú)菌水；c. 接種尖孢鐮刀菌且施用CYY-6；d. 接種尖孢鐮刀菌且施用CYY-42。a. All plants treated with sterile water; b. All plants treated with F. oxysporum alone; c. All plants treated with F. oxysporum and isolates CYY-6; d. All plants treated with F. oxysporum and isolates CYY-42.

3討論

在可持續(xù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，應(yīng)用芽孢桿菌防治植物病害是一個(gè)極具潛力的途徑[21]。本研究從紫花苜蓿根際土中分離出地衣芽孢桿菌CYY-6和短短芽孢桿菌CYY-42，評(píng)價(jià)了其對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗作用及由其引起的紫花苜蓿根腐病的防治效果，結(jié)果表明，兩菌株顯著減輕了人工接種尖孢鐮刀菌導(dǎo)致的紫花苜蓿根腐病的病情。

尖孢鐮刀菌是一種世界性分布的土傳病原真菌，既可在土壤中存活又能侵染植物。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的受尖孢鐮刀菌危害嚴(yán)重的植物包括苜蓿、甜椒(Capsicumfrutescens)、花生(Arachishypogaea)、西瓜(Citrulluslanatus)、香蕉(Musaparadisiaca)、高粱(Sorghumbicolor)等[5,22-24]。在平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)中，菌株CYY-6和CYY-42均能有效抑制尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)，并產(chǎn)生抑菌帶，抑菌率分別達(dá)到49.3%和56.3%。兩菌株表現(xiàn)出的拮抗活性可能是由于其產(chǎn)生的抗真菌代謝物的作用，如嗜鐵素，其通過(guò)螯合反應(yīng)，釋放出難溶性的鐵，形成嗜鐵素-鐵螯合物，并將鐵轉(zhuǎn)移到體內(nèi)，以滿(mǎn)足微生物自身的生長(zhǎng)需求，從而降低環(huán)境中的鐵濃度，由此病原菌因缺鐵而不能正常的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而控制植物病害發(fā)生[25]。本研究中，菌株CYY-42的嗜鐵素合成能力強(qiáng)于CYY-6，且菌株CYY-42對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗效果也比CYY-6好，這一研究結(jié)果與Duijff等[26]和許煜泉等[27]發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象相似，細(xì)菌合成嗜鐵素的含量與拮抗病原菌的能力有關(guān)，且呈正相關(guān)[28]。菌株CYY-6和CYY-42的發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲和孢子生長(zhǎng)有明顯的拮抗作用，Pual等[29]和謝棟等[30]也表明芽孢桿菌能夠使真菌菌絲畸形、斷裂，細(xì)胞壁溶解，孢子不萌發(fā)，這可能與拮抗菌分泌的抗菌肽類(lèi)或蛋白類(lèi)物質(zhì)有關(guān)。芽孢桿菌分泌的幾丁質(zhì)酶具有降解幾丁質(zhì)的能力，而幾丁質(zhì)是病原真菌細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)組成，細(xì)菌菌株通過(guò)溶解植物病原真菌細(xì)胞壁來(lái)發(fā)揮拮抗作用[23]，因此幾丁質(zhì)酶可能是生物防治植物病原真菌最重要的物質(zhì)，Basha和Ulaganathan[31]也表現(xiàn)，新月彎孢菌(Curvularialunata)菌絲的斷裂和細(xì)胞壁的溶解與芽孢桿菌菌株分泌的幾丁質(zhì)酶相關(guān)。

生防芽孢桿菌對(duì)植物病害的防治機(jī)制主要包括拮抗、競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)植物抗性等多種方式[21]。無(wú)生防菌株時(shí)，病原真菌依靠植物提供的生存條件進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，有生防菌株存在時(shí)，生防菌株與病原真菌競(jìng)爭(zhēng)，爭(zhēng)奪有利生態(tài)位，形成菌膜屏障，阻止病原真菌進(jìn)一步侵染植物[19]。Lee等[32]篩選到的地衣芽孢桿菌對(duì)番茄灰霉病具有顯著防治效果，張璐等[20]從黃瓜根際土分離到的短短芽孢桿菌DS-1對(duì)苗期黃瓜枯萎病的生防效果顯著。雖然已經(jīng)報(bào)道了地衣芽孢桿菌和短短芽孢桿菌對(duì)一些植物病害有生防活性，但本研究首次報(bào)道地衣芽孢桿菌和短短芽孢桿菌能顯著減輕由尖孢鐮刀菌引起的紫花苜蓿根腐病病情。李文英等[23]發(fā)現(xiàn)香蕉根際芽孢桿菌PAB-1和PAB-2對(duì)由尖孢鐮刀菌引起的香蕉枯萎病的防效為18.8%和46.9%。本研究也表明，從紫花苜蓿根際篩選出的地衣芽孢桿菌菌株CYY-6和短短芽孢桿菌菌株CYY-42對(duì)由尖孢鐮刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的相對(duì)防效分別達(dá)到了57.55%和64.03%。

本研究篩選出2株紫花苜蓿根際芽孢桿菌CYY-6和CYY-42，它們對(duì)由尖孢鐮刀菌引起的紫花苜蓿根腐病都表現(xiàn)出生防效果，這可能是嗜鐵素、蛋白類(lèi)或抗菌肽類(lèi)物質(zhì)等多種抗真菌代謝物共同作用的結(jié)果，其抗菌物質(zhì)和抑菌機(jī)理的確定還有待于深入研究。由于本研究是在盆栽條件下進(jìn)行的，紫花苜蓿的生長(zhǎng)條件及生長(zhǎng)期與大田存在一定差異，其實(shí)際的生防效果尚待后續(xù)田間試驗(yàn)驗(yàn)證。

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通訊作者*Corresponding author. E-mail:kaku3008@126.com

作者簡(jiǎn)介：劉莎莎(1988-)，女，黑龍江鶴崗人，在讀碩士。E-mail:liusha90923@163.com。 程園園(1987-)，女，黑龍江大慶人，在讀碩士。E-mail:cyy315335@163.com。**共同第一作者 These authors contributed equally to this work.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31470571;31170479)，國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011BAD17B04-2-1)，黑龍江省科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.GC12B304)和黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.C201142)資助。

收稿日期：2015-01-16；改回日期：2015-03-30

DOI：10.11686/cyxb2015026http://cyxb.lzu.edu.cn