• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    農(nóng)桿菌介導含硫氨基酸γ-zein轉(zhuǎn)化菊苣的初步研究

    2016-01-28 02:08:09張玉白史且李聰
    草業(yè)學報 2015年9期
    關鍵詞:菊苣

    張玉,白史且,李聰

    (1.四川省草原科學研究院,四川 成都611731;2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100094)

    農(nóng)桿菌介導含硫氨基酸γ-zein轉(zhuǎn)化菊苣的初步研究

    張玉1*,白史且1,李聰2

    (1.四川省草原科學研究院,四川 成都611731;2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100094)

    摘要:含硫氨基酸具有動物營養(yǎng)與免疫相關的重要生理功能,為提高菊苣中含硫氨基酸含量,采用根癌農(nóng)桿菌介導法將玉米種子貯藏蛋白含硫氨基酸基因γ-zein和綠色熒光蛋白GFP融合基因轉(zhuǎn)入到菊苣無菌苗葉片中,經(jīng)過共培養(yǎng)、潮霉素抗性篩選、分化、再生和煉苗, 得到抗性植株。對抗性植株進行PCR、PCR-Southern、斑點雜交和RT-PCR分析,結果表明,外源目的基因已經(jīng)整合到菊苣基因組中并且得到了表達,為提高菊苣含硫氨基酸含量,改善其品質(zhì)奠定了基礎。

    關鍵詞:γ-zein基因;菊苣;農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化;含硫氨基酸

    Preliminary studies on transgenic chicory using the sulphur-amino acid gene, γ-zein, mediated byAgrobacteriumtumefacien

    ZHANG Yu1*, BAI Shi-Qie1, LI Cong2

    1.SichuanGrasslandScienceAcadem,Chengdu611731,China; 2.InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Beijing100094,China

    Abstract:Sulfur-containing amino acids have important physiological functions related to animal nutrition and immunity. To improve the sulfur-amino acid content of chicory, leaves of chicory were transformed with the Sulphur-amino acid gene γ-zein, an important prolamin storage protein from Zea mays and a green fluorescent protein (GFP) gene using Agrobacterium mediated transfusion. After co-culture, selective differentiation and regeneration, hygromycin resistant plants were obtained. Resistant plants were detected using PCR, PCR-southern, dot blot hybridization and RT-PCR. The results demonstrated that the γ-zein genes had been integrated into the genome of chicory and expressed on a nucleic acid level in the transgenic plants.

    Key words:γ-zein genes; chicory (Cichorium intybus); agrobacterium-mediated transformation; sulphur-amino acid

    蛋白短缺包括蛋白含量短缺和營養(yǎng)品質(zhì)低下,是21世紀全球性的嚴重問題,在盡快提高作物品種的蛋白質(zhì)含量的同時,積極改善蛋白質(zhì)的氨基酸組成,提高營養(yǎng)價值,具有重要意義。

    含硫氨基酸如甲硫氨酸(也稱為蛋氨酸,methionine,Met)、胱氨酸、半胱氨酸(cysteine, Cys)等是合成蛋白質(zhì)的重要氨基酸,蛋白質(zhì)中含硫氨基酸的含量與種子萌發(fā)、生長和作物品質(zhì)均有密切關系。含硫氨基酸是人體必需氨基酸之一,也是形成動物毛發(fā)角蛋白的必需組分,并且研究表明含硫氨基酸含量的增加可提高羊毛產(chǎn)量22%以上,增產(chǎn)的幅度在22%~104%[1-2],同時還可增加牲畜的重量,含硫氨基酸的這種獨特作用是別的氨基酸不具有的[2]。如能提高牧草或動物飼料中含硫氨基酸的含量,對提高動物重量、改善動物品質(zhì),具有重要的經(jīng)濟價值。是穩(wěn)定畜產(chǎn)品價格和確保畜產(chǎn)品安全的有效途徑之一[3]。

    菊苣(Cichoriumintybus)為菊科菊苣屬多年生宿根草本植物,其適應性廣,根系發(fā)達,產(chǎn)量高,營養(yǎng)豐富,粗蛋白質(zhì)16.44%~27.35%,菊苣常用作牧草飼料、蔬菜、制糖原料及咖啡的替代品,也是工業(yè)和藥品的生產(chǎn)原料[3-4]。雖然菊苣蛋白質(zhì)含量高,但是蛋白質(zhì)中氨基酸組成不平衡,含硫氨基酸含量較低。

    近年來,基因工程的誕生使人類的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)史發(fā)生了巨大的變化,通過轉(zhuǎn)基因技術提高植物抗性、改善織物品質(zhì),具備并已展現(xiàn)了巨大的應用價值和經(jīng)濟價值[5]。目前已經(jīng)從玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、向日葵(Helianthusannuus)及豌豆(Pisumsativum)等中分離得到富含硫氨基酸的蛋白及其編碼基因。玉米醇溶蛋白(zein)是玉米種子中的主要貯藏蛋白質(zhì),可分為α-、β-、γ-和δ-zein 4種主要類型。其中β-、γ-和δ-zein富含蛋氨酸和半胱氨酸2種含硫氨基酸[6]。通過轉(zhuǎn)γ-zein基因來提高植物的含硫氨基酸已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[7]、煙草(Nicotianatabacum)[8]、白三葉草(Trifoliumrepens)[9]、紫花苜蓿(Medicagosativa)[10-11]等中取得良好的結果。γ-zein基因的成功轉(zhuǎn)入和表達為增加牧草可食性組織的含硫氨基酸含量提供了新的途徑,但這在菊苣上還沒見報道。本文通過農(nóng)桿菌介導將GFP和γ-zein融合基因轉(zhuǎn)化菊苣,對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行檢測,以期提高菊苣植株含硫氨基酸的含量,改善菊苣品質(zhì),同時也為菊苣新品種的培育提供中間材料。

    1材料與方法

    1.1 植物材料

    普那菊苣(Cichoriumintybuscv. puna)由四川省草原科學研究院提供。普那菊苣是一個產(chǎn)量高、抗蟲性強的國家登記牧草品種。

    1.2 質(zhì)粒及菌種

    本實驗中使用根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404、植物表達載體pCAMBIA1302和γ-zein基因均由中國農(nóng)業(yè)科學研究院畜牧獸醫(yī)研究所李聰實驗室提供。質(zhì)粒圖譜見圖1。該質(zhì)粒包括CaMV35S啟動子、γ-zein、GFP蛋白基因。

    圖1 植物表達載體pCB-GFP-zein結構Fig.1 Schematic maps of plant expression vectors pCB-GFP-zeinLB為左邊界Left T-border;RB為右邊界Right T-border.

    1.3 試驗用培養(yǎng)基成分

    見表1。

    1.4 方法

    1.4.1菊苣無菌苗的獲得選取飽滿菊苣種子,經(jīng)體積分數(shù)75%乙醇浸泡2 min,倒出浸泡液,再用0.1%的升汞浸泡10 min,無菌水反復清洗4~5次,無菌濾紙吸干水分后, 接種于1/2 MS培養(yǎng)基上,放于溫室,待植株成苗。

    表1 培養(yǎng)基成分

    1.4.2菌液的活化參照王關林和方宏藥(2002)的方法,略有變動。取-80℃加入15%甘油保存的菌液于碎冰上融化,用接種針蘸取少量菌液,在添加有50 mg/L Kan和50 mg/L Str的固體平板培養(yǎng)基上劃線,于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置暗培養(yǎng)2 d。待長出單菌落后,用牙簽挑取單菌落于含50 mg/L Kan和50 mg/L Str的液體LB或YMB培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)16~24 h至對數(shù)生長期,然后按1∶100比例轉(zhuǎn)入不含抗生素的新鮮液體培養(yǎng)基中繼續(xù)振搖培養(yǎng)至OD600達0.6左右。無菌條件下取新鮮菌液于50 mL離心管中于常溫5000 r/min離心10 min,去除上清液,用1/2 MS無菌液體培養(yǎng)基重懸沉淀至需要的OD值,用于侵染轉(zhuǎn)化。

    1.4.3轉(zhuǎn)基因抗性植株的獲得選取無菌苗中上部充分展開、生長健壯、均勻一致的幼嫩葉片,用5~10 mm打孔器制取葉盤外植體,將其接種在預培養(yǎng)基中預培養(yǎng)2 d后,用OD600=0.4 Abs農(nóng)桿菌菌液浸泡10 min, 其間不斷搖動,取出后用無菌濾紙吸取受體表面多余菌液,迅速將受體材料移置鋪有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)基上,黑暗中共培養(yǎng)到有肉眼可見微菌落。共培養(yǎng)結束后,將其轉(zhuǎn)入含25 mg/L Hyg和500 mg/L Cef的篩選培養(yǎng)基中篩選得到抗性芽。當抗性芽長到1 cm時,轉(zhuǎn)入含15 mg/L Hyg和500 mg/L Cef的分化培養(yǎng)基中擴繁,將擴繁芽轉(zhuǎn)入含10 mg/L Hyg和250 mg/L Cef的生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng),直到長成完整的小植株,然后馴化移栽,得到轉(zhuǎn)基因抗性植株。

    1.4.4抗性植株的檢測1) PCR檢測

    用CTAB法和普博欣植物基因組DNA小量提取試劑盒提取抗性植株及對照(未轉(zhuǎn)化植株)的總DNA,根據(jù)標記基因GFP和目的基因γ-zein序列用primer 5.0設計引物進行PCR擴增,GFP引物序列為:

    5′-CAGTGGAGAGGGTGAAGGTG-3′

    5′-CGAAAGGGCAGATTGTGTGG-3′

    預期擴增長度為538 bp。

    γ-zein引物序列為:

    5′-TGCCACTACCCTACTCAACCG-3′

    5′-GGAGGACCAAGCCGAAGAT-3′

    預期擴增長度為283 bp。

    以質(zhì)粒pCB-GFP-zein作為陽性對照,以未轉(zhuǎn)化的植株作為陰性對照。PCR反應體系為:10×PCR Reaction Buffer 2.5 μL,dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μL,上游引物(10 μmol/L)1 μL,下游引物(10 μmol/L)1 μL,基因組DNA 1 μg Taq DNA Polymerase(5 U/μL) 0.5 μg, 添加 ddH2O 補充到 25 μL。PCR反應程序為:94℃ 4 min,94℃ 30 s,50℃ 30 s, 72℃ 1 min,30個循環(huán), 最后72℃ 10 min。電泳完后,取5 μL PCR擴增產(chǎn)物在濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳,檢測擴增結果。

    2) PCR-Southern

    以質(zhì)粒pCB-GFP-γ-zein DNA 為模板進行PCR,對PCR產(chǎn)物進行回收,用回收產(chǎn)物做探針標記,具體標記方法見Roche 公司的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I,然后對PCR 產(chǎn)物進行電泳、轉(zhuǎn)膜、預雜交、雜交和顯色檢測,具體方法見Roche 公司的說明書。

    3)斑點雜交

    對陽性植株DNA變性,冰中速冷。在帶正電荷尼龍膜上用鈍鉛筆劃0.5 cm×0.5 cm方格網(wǎng),先用蒸餾水浸潤尼龍膜,然后用20×SSC浸泡,用Tip將變性DNA點于膜上,以質(zhì)粒pCB-GFP-zein DNA為陽性對照,以未轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照,每個樣點2~10 μg DNA,室溫晾干,烘烤,進行預雜交、雜交和顯色檢測[12]。

    4) 轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測

    利用TRIzol法對菊苣陽性轉(zhuǎn)化植株和非轉(zhuǎn)化植株的總RNA進行提取、純化,然后對RNA進行反轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應體系為25 μL,含模板RNA 2 μg,Oligo(dT)15 Primer 1 μL,M-MLV Reaction Buffer 5 μL,Dntp (10 mmol/L) 5 μL,Ribonuclease Inhibitor 1 μL,M-MLV RT 200 U,加DEPC水補足25 μL。用γ-zein基因引物對反轉(zhuǎn)錄的cDNA進行PCR檢測和電泳分析。

    2結果與分析

    2.1 轉(zhuǎn)基因菊苣獲得

    菊苣無菌苗葉片預培養(yǎng)2 d后,葉片邊緣開始膨大,用含pCB-gfp-zein的LBA4404浸染,浸染后的菊苣葉片(圖2A)在黑暗下共培養(yǎng)2~3 d,轉(zhuǎn)于含20 mg/L Hyg和500 mg/L Cef的篩選培養(yǎng)基上,20 d后分化出具有抗性的不定芽(圖2B),將抗性芽轉(zhuǎn)入含15 mg/L Hyg和500 mg/L Cef的分化培養(yǎng)基中擴繁1~2周 (圖2C),再轉(zhuǎn)入含10 mg/L Hyg和250 mg/L Cef的生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng),2~3周后植株生根(圖2D)發(fā)育成完整植株(圖2E),煉苗室內(nèi)盆栽,最終獲得48株形態(tài)特征正常的菊苣抗性再生植株 (圖2F)。

    圖2 轉(zhuǎn)化菊苣分化與再生Fig.2 Differentiation and regeneration of transformed chicory A:浸染后的菊苣葉片Leaf soaked of chicory;B:不定芽的篩選(箭頭指向為抗性芽) Screen the Hyg-resistant regeneration buds (the arrowed places are the transgene buds);C: 抗性植株生根培養(yǎng)Radicating of the Hyg-resistant regeneration buds; D:抗性芽的分化Differentiation of the Hyg-resistant regeneration buds;E:完整的抗性植株Intact plant;F:移栽成活的抗性植株The survival Hyg-resistant regeneration plant transplanted to plate.

    2.2 抗性植株的PCR檢測

    提取轉(zhuǎn)化抗性植株DNA,用GFP基因和γ-zein基因引物分別對轉(zhuǎn)化植株及非轉(zhuǎn)基因植株總DNA進行PCR擴增,結果顯示轉(zhuǎn)化的48株抗性再生植株中有29株能擴增出γ-zein基因的283 bp預期片段,只列出部分PCR圖(圖3),有26株能擴增出GFP基因538 bp的預期片段(圖4,只列出部分PCR圖),而非轉(zhuǎn)基因植株均未擴增出任何條帶(圖3,圖4)。

    圖3 轉(zhuǎn)基因植株γ-zein-PCR 檢測Fig.3 PCR analysis of γ-zein gene from transformed chicory   1: DL 2000 DNA marker;2: pCB-gfp-zein質(zhì)粒Plasmid pCB-gfp-zein;3:陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣) Negative control(non-transgenic );4~10:轉(zhuǎn)化植株Transformed plants.

    圖4 轉(zhuǎn)基因植株gfp-PCR 檢測Fig.4 PCR analysis of gfp gene from transformed chicory

    2.3 抗性植株的PCR-Southern檢測

    對gfp 和γ-zein基因PCR檢測都為陽性的植株進行γ-zein-PCR——Southern檢測,檢測結果(圖5)表明:檢測的植株都為陽性,初步說明外源目的基因γ-zein已經(jīng)轉(zhuǎn)化到菊苣基因組中。

    圖5 轉(zhuǎn)基因植株γ-zein-PCR-Southern 檢測Fig.5 PCR-Southern analysis of γ-zein gene from transformed chicory

    M: DL 2000 DNA marker; P: pCB-gfp-zein質(zhì)粒Plasmid pCB-gfp-zein; CK: 陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣) Negative control(non-transgenic );1~7: 轉(zhuǎn)化植株Transformed plants.1: pCB-gfp-zein質(zhì)粒Plasmid pCB-gfp-zein; 2: 陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣) Negative control(non-transgenic);3~7: 轉(zhuǎn)化植株Transformed plants.

    2.4 抗性植株的斑點雜交檢測

    對上面檢測均為陽性的轉(zhuǎn)基因植株DNA進行斑點雜交,所用探針為pCB-gfp-zein質(zhì)粒DNA的γ-zein-PCR回收產(chǎn)物,雜交結果顯示(圖6):除陰性對照外,轉(zhuǎn)基因植株都有雜交信號,說明γ-zein已經(jīng)整合到菊苣基因組中。

    圖6 轉(zhuǎn)基因植株γ-zein斑點雜交檢測Fig.6 Dot blot hybridization analysis of γ-zein gene   P: pCB-gfp-zein質(zhì)粒Plasmid pCB-gfp-zein; CK: 陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣) Negative control (non-transgenic);1~8: 轉(zhuǎn)化植株Transformed plants.

    2.5 抗性植株的RT-PCR檢測

    采用TRIzol法對菊苣轉(zhuǎn)化植株和未轉(zhuǎn)化植株提取RNA,經(jīng)檢測RNA質(zhì)量良好(圖7),經(jīng)過RT-PCR檢測,結果表明(圖8),除1株為陰性外其余都為陽性,表明大部分基因在轉(zhuǎn)基因菊苣植株中得到了表達。檢測表明陰性的植株是假陽性,還是在RNA上沉默,還有待Southern雜交的進一步檢測。

    圖7 提取的植株RNA Fig.7 RNA extraction of plants

    圖8 轉(zhuǎn)基因植株γ-zein-RT-PCR 檢測Fig.8 RT -PCR analysis of γ-zein gene    1: DL 2000 DNA marker; 2:pCB-gfp-zein質(zhì)粒Plasmid pCB-gfp-zei; CK: 陰性對照(非轉(zhuǎn)基因菊苣) Negative control (non-transgenic);3~8: 轉(zhuǎn)化植株Transformed plants.

    3結論與討論

    改進農(nóng)作物品質(zhì)歷來為各國科學工作者所重視。菊苣中缺乏蛋氨酸和半胱氨酸, 蛋氨酸和半胱氨酸成了其營養(yǎng)限制,菊苣是一個多用途的經(jīng)濟作物、藥用植物和飼料作物, 提高其蛋氨酸和半胱氨酸含量具有巨大的潛在經(jīng)濟價值。該論文以菊苣無菌苗葉片為外植體,利用根癌農(nóng)桿菌介導法對含硫氨基酸γ-zein基因和GFP基因的融合基因轉(zhuǎn)移到菊苣的研究,迄今還未見報道。在菊苣中利用基因工程法進行基因轉(zhuǎn)化的報道并不多見,目前在國內(nèi)外報道的只有與花發(fā)育相關AFL2基因[13]、β-glucuronidase (uidA)基因[14]、抗壞血酸過氧化物酶(APX)基因[15]、pBI121-GFP載體[16]、菊苣中分離克隆的DREB基因[17]和茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(ALNHX)[18]被導入菊苣,并且這些報道都只做了最初的PCR檢測,沒有在RNA的表達上進行檢測。

    在植物遺傳轉(zhuǎn)化中,預培養(yǎng)的主要作用是促進細胞分裂,因為處于分裂狀態(tài)的細胞更易整合外源DNA,提高轉(zhuǎn)化率。研究發(fā)現(xiàn)菊苣預培養(yǎng)時間比較短,只需要2 d即可,如果預培養(yǎng)時間超過3 d,外植體邊緣除了膨大外,還開始分化出綠點,影響轉(zhuǎn)化效率。根癌土壤農(nóng)桿菌只能感染植物的損傷部位,在植物細胞損傷及修復過程中,植物細胞釋放出一些化學物質(zhì)(酚類物質(zhì)、酸性多糖等),這些誘導物可以通過外膜蛋白將環(huán)境中的植物損傷信號傳遞到農(nóng)桿菌細胞內(nèi),最終引起vir 基因的表達和T-DNA 的轉(zhuǎn)移。其中誘導效果最佳的為乙酰丁香酮(AS),它可以使農(nóng)桿菌質(zhì)粒上的vir 基因活化,提高轉(zhuǎn)化率。也有報道稱AS對于轉(zhuǎn)化效果沒有明顯影響。本研究中得出共培養(yǎng)中AS濃度對抗性率影響差異顯著,其中以濃度為100 μmol/L最佳。有報道AS 對于河北楊的侵染轉(zhuǎn)化并沒有促進效果,隨著施加濃度的增加反而還會產(chǎn)生一定的抑制作用。不同研究獲得結果不一致,可能與所選用材料、菌液濃度和菌株的類型有關系。

    PCR的高度靈敏極易產(chǎn)生假陽性結果。DNA插入植物基因組后易發(fā)生重排,即使載體上的抗性基因或其他基因能表達, 目的基因也未必完整的存在于轉(zhuǎn)化體中,從而造成檢測結果的假陽性。而且,轉(zhuǎn)基因植株存在基因沉默等現(xiàn)象,影響外源基因的正常表達,因此,轉(zhuǎn)基因PCR檢測結果可能不是百分之百準確,所以,除了PCR檢測外,還有必要在DNA水平用點雜交、Southern Blot檢測,在RNA表達水平上用RNA-PCR進行檢測。本文通過轉(zhuǎn)化葉片進行不同濃度梯度潮霉素的篩選,分化和再生得到了菊苣抗性植株,通過PCR、PCR-Southern和斑點雜交檢測證明了γ-zein基因已經(jīng)轉(zhuǎn)化到菊苣基因組中。再通過RT-PCR進一步證明了γ-zein基因已整合到菊苣基因組中,并在轉(zhuǎn)錄水平上得到了正確表達,并且該轉(zhuǎn)化方法抗性率高,陽性率也較高,為菊苣以后的遺傳轉(zhuǎn)化和育種中間材料的創(chuàng)制奠定了基礎。一個完整的轉(zhuǎn)基因植株的檢測應該包括DNA、RNA方面的檢測,還應該包括該基因表達產(chǎn)物的檢測。本試驗中,γ-zein基因表達的產(chǎn)物主要為含硫氨基酸的蛋氨酸和半胱氨酸,但是由于含硫氨基酸在轉(zhuǎn)基因菊苣中表達量的檢測,需要一定量的菊苣干樣并打成草粉,因此,該指標只有等到轉(zhuǎn)基因菊苣單株樣品比較多的情況下才能進行測定。

    References:

    [1]Radcliffe B C, Hynd P I, Benevenga N J,etal. Effects of cysteine ethyl ester supplements on wool growth tate. Australian Journal of Agricultural Resear, 1985, 36: 709-715.

    [2]Reis P J. Effects of amino acids on the growth and properties of wool. Physiological and Environmental Liminations to Wool Growth[M]. Amidale: University of New England Publishing Unit, 1979: 223-242.

    [3]Wang C M, Yang L J, Chang S H,etal. Price analysis of domestic and international major livestock and forage products. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(1): 300-311.

    [4]Sanderson M A, Labreveux M, Hall M H. Nutritive value of chicory and English plantain forage. Crop Science Society of America, Madison, USA, 2003, 43(5): 1747-1804.

    [5]Xu L M, Zhang Z B, Liang X L,etal. Advances in genetic engineerin for drought tolerance in plant. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(6): 293-303.

    [6]Shewry P R, Casey R. Seed Protein[M]. Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1999: 109-139.

    [7]Geli M I, Torrent M, Ludevid D. Two structural domains mediate two sequential events in γ-zein targeting: protein endoplasmic reticulum retention and protein body formation. Plant Cell, 1994, 6(12): 1911-1922.

    [8]Bellucci M, Alpini A, Paolocci F,etal. Accumulation of maize γ-zein and γ-zein: KDELTo high levels in tobacco leaves and differential increase of BiP synthesis in transformants. Theoretical and Applied Genetics, 2000, 101(5-6): 796-804.

    [9]Sharma S B, Hancock K R, Ealing P M,etal. Expression of a sulphur-rich maize seed storage protein, δ-zein, in white clover (Trifoliumrepens) to improve forage quality. Molecular Breeding, 1998, 4: 435-448.

    [10]Bellucci M, Alpini A, Arcioni S. Zein accumulation in forage species (LotuscorniculatusandMedicagosativa) and co-expression of the γ-zein: KDEL and β-zein: KDEL polypeptides in tobacco leaf. Plant Cell Reports, 2002, 20(9): 848-856.

    [11]Lu D Y, Fan Y L, Yu M M,etal. Transgenic plant regeneration with high sulfur-containing amino acids protein gene about alfalfa. Acta Genetic Sinica, 2000, 27(4): 331-337.

    [12]Li S J, Zhang Z Y. Expression of the Ta6-SFT gene in brassica napus under drought stress. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(5): 161-167.

    [13]Cheng L M, Cao Q F, Gao H W. Study on the efficient systems for regeneration and AFL2 gene transformation of puna chicory (CichoriumintybusL). Acta Agrestia Sinica, 2004, 12(3): 199-203.

    [14]Zhang L J, Cheng L M, Du J Z. Estabilishent and optimization of puna chicory genetic transformation system with agrobacterium-mediated method. Acta Agrestia Sinica, 2008, 2: 130-134.

    [15]Fanny Frulleuxl, Guy Weyens, Michel Jacobs. Agrobacterium tumefaciens-mediatated transformation of shoot-buds of chicory. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1997, 50: 107-112.

    [16]Song S F, Cao F, Yang P Z,etal. High efficient system establishment on plant regeneration and study on genetics Transformation in Puna Chicory (CichoriumintybusL.). Molecular Plant Breeding, 2006, 4(4): 565-570.

    [17]Zhao L. Isolation and Characterization of the DREB Transcription Factor from Commander Chicory and Establishment of Genetic Transformation System of Commander[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University Library, 2013.

    [18]Zhao L, Chen D D, Ling M X,etal. Comparative study on regeneration and genetic transformation between puna chicory and commander chicory. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2012, 32(11): 2169-2176.

    參考文獻:

    [3]王春梅, 楊林杰, 常生華, 等. 國內(nèi)外主要畜產(chǎn)品與飼料價格分析. 草業(yè)學報, 2014, 23(1): 300-311.

    [5]徐立明, 張振葆, 梁曉玲, 等. 植物抗旱基因工程研究進展. 草業(yè)學報, 2014, 23(6): 293-303.

    [11]呂德?lián)P, 范云六, 俞梅敏, 等. 苜蓿高含硫氨基酸蛋白轉(zhuǎn)基因植株再生. 遺傳學報, 2000, 27(4): 331-337.

    [12]李淑潔, 張正英. Ta6-SFT 基因?qū)τ筒说霓D(zhuǎn)化及抗旱性分析. 草業(yè)學報, 2014, 23(5): 161-167.

    [13]程林梅, 曹秋芬, 高洪文, 等. 菊苣再生體系的建立及轉(zhuǎn)AFL2基因的研究. 草地學報, 2004, 12(3): 199-203.

    [14]張麗君, 程林梅, 杜建中, 等. 菊苣農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的研究. 草地學報, 2011, 6: 1042-1049.

    [16]宋書鋒, 曹鳳, 楊培志, 等. 普那菊苣高效再生體系建立和遺傳轉(zhuǎn)化研究. 分子植物育種, 2006, 4(4): 565-570.

    [17]趙龍. 將軍菊苣DREB家族基因的克隆、功能研究及其遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學, 2013.

    [18]趙龍, 陳丹丹, 梁明祥, 等. 2種菊苣再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化效率的比較. 西北植物學報, 2012, 32(11): 2169-2176.

    張玉, 白史且, 李聰. 農(nóng)桿菌介導含硫氨基酸γ-zein轉(zhuǎn)化菊苣的初步研究. 草業(yè)學報, 2015, 24(9): 73-79.

    ZHANG Yu, BAI Shi-Qie, LI Cong. Preliminary studies on transgenic chicory using the sulphur-amino acid gene, γ-zein, mediated byAgrobacteriumtumefacien. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(9): 73-79.

    通訊作者*Corresponding author.

    作者簡介:張玉(1975-),女,四川仁壽人,博士。E-mail:zhyforage@126.com

    基金項目:四川省十二五牧草育種攻關(2011NZ0098-11),四川省應用基礎項目(2013JY0111)和國家牧草產(chǎn)業(yè)技術體系阿壩綜合試驗站資助。

    收稿日期:2014-07-07;改回日期:2015-03-10

    DOI:10.11686/cyxb2014307http://cyxb.lzu.edu.cn

    猜你喜歡
    菊苣
    菊苣氨基酸分析及添加菊苣對土雞生長及生化指標的影響
    快樂環(huán)游記
    享譽中西的菊苣歷史進程及產(chǎn)業(yè)應用
    長江蔬菜(2019年10期)2019-07-02 10:33:52
    健胃消食的菊苣
    菊苣在肉兔飼養(yǎng)中的應用
    紫外可見分光光度法測量菊苣藥材中菊苣多糖含量分析
    外界環(huán)境和食品體系對菊苣酸穩(wěn)定性的影響
    食品科學(2015年15期)2015-11-02 13:00:36
    菊苣降眼壓
    愛你(2015年3期)2015-07-05 11:49:33
    菊苣降眼壓
    愛你(2015年6期)2015-04-20 06:45:55
    菊苣無公害栽培技術及利用
    欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 精品久久蜜臀av无| 免费高清在线观看视频在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一级,二级,三级黄色视频| 国产精品国产三级专区第一集| av免费在线看不卡| 精品久久蜜臀av无| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 五月天丁香电影| 国产在视频线精品| 妹子高潮喷水视频| 精品亚洲成国产av| 亚洲第一青青草原| 成人亚洲精品一区在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 日韩一本色道免费dvd| 欧美bdsm另类| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 99香蕉大伊视频| 成人国语在线视频| 成人国产av品久久久| 国产精品蜜桃在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久国内精品自在自线图片| 国产成人av激情在线播放| 国产成人av激情在线播放| 两个人看的免费小视频| 一本色道久久久久久精品综合| 26uuu在线亚洲综合色| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 人成视频在线观看免费观看| 日韩一本色道免费dvd| 人成视频在线观看免费观看| 国产成人精品久久二区二区91 | 国产高清不卡午夜福利| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美日韩一级在线毛片| 多毛熟女@视频| 最新中文字幕久久久久| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产成人精品婷婷| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品免费视频内射| 久久久久久免费高清国产稀缺| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品久久久久久精品古装| 日韩电影二区| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲成色77777| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久久精品久久久久真实原创| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 激情视频va一区二区三区| 自线自在国产av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久精品国产综合久久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日韩免费高清中文字幕av| 国产精品嫩草影院av在线观看| 曰老女人黄片| 国产乱来视频区| 性色av一级| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 人人妻人人澡人人看| 国产男女内射视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 曰老女人黄片| 国产在线一区二区三区精| 久热这里只有精品99| 国产免费现黄频在线看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 桃花免费在线播放| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日韩免费高清中文字幕av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 精品亚洲成a人片在线观看| www.av在线官网国产| 成人毛片60女人毛片免费| 99精国产麻豆久久婷婷| 美女午夜性视频免费| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 高清视频免费观看一区二区| 色网站视频免费| 久久久亚洲精品成人影院| 又大又黄又爽视频免费| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 曰老女人黄片| 自线自在国产av| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久久国产一区二区| 久久青草综合色| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲图色成人| 99国产精品免费福利视频| av在线观看视频网站免费| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 欧美人与性动交α欧美软件| 一级a爱视频在线免费观看| 日日啪夜夜爽| 亚洲国产日韩一区二区| 麻豆av在线久日| xxx大片免费视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 97精品久久久久久久久久精品| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久精品国产亚洲av涩爱| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 男人操女人黄网站| 丰满乱子伦码专区| 亚洲精品国产av成人精品| 纯流量卡能插随身wifi吗| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 国产av一区二区精品久久| 黄频高清免费视频| 亚洲精品,欧美精品| 国产成人精品婷婷| 一级毛片我不卡| 18禁观看日本| 免费在线观看完整版高清| 国产福利在线免费观看视频| 七月丁香在线播放| 欧美精品av麻豆av| 国产1区2区3区精品| 青春草亚洲视频在线观看| 国产一区二区 视频在线| av卡一久久| av国产久精品久网站免费入址| 三级国产精品片| 国产成人精品一,二区| 亚洲,欧美,日韩| 国产毛片在线视频| 国产精品一区二区在线观看99| 寂寞人妻少妇视频99o| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产极品天堂在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 99香蕉大伊视频| 极品人妻少妇av视频| 777米奇影视久久| 久久久精品94久久精品| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲人成77777在线视频| 波多野结衣一区麻豆| 中文字幕最新亚洲高清| 日本欧美国产在线视频| 国产在线一区二区三区精| 不卡视频在线观看欧美| 久久99精品国语久久久| 黑人猛操日本美女一级片| 美女国产高潮福利片在线看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产av国产精品国产| 国产成人欧美| 日韩精品免费视频一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 人体艺术视频欧美日本| 少妇人妻 视频| 午夜日韩欧美国产| 熟妇人妻不卡中文字幕| 91精品三级在线观看| 亚洲人成电影观看| 丰满乱子伦码专区| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲国产日韩一区二区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久久久久久免费视频了| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 少妇的逼水好多| 超色免费av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲四区av| 天天影视国产精品| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产一区二区在线观看av| 久久韩国三级中文字幕| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜免费鲁丝| 黄色 视频免费看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 在线观看国产h片| 少妇熟女欧美另类| 国产又色又爽无遮挡免| 视频在线观看一区二区三区| 精品一区在线观看国产| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲内射少妇av| 曰老女人黄片| 久久这里有精品视频免费| 日韩人妻精品一区2区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 成人二区视频| 九草在线视频观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 91精品国产国语对白视频| 九九爱精品视频在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 色吧在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久久久久久久久久久大奶| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久久久精品性色| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产日韩欧美亚洲二区| 最近中文字幕2019免费版| 日本wwww免费看| 嫩草影院入口| 曰老女人黄片| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久久久国产一级毛片高清牌| 97人妻天天添夜夜摸| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 满18在线观看网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 免费观看在线日韩| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲国产精品999| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲精品在线美女| 久久免费观看电影| 午夜日韩欧美国产| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美另类一区| 午夜影院在线不卡| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品久久久久久久久免| freevideosex欧美| 成年人午夜在线观看视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| a级毛片黄视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 看免费av毛片| 18+在线观看网站| 成年女人毛片免费观看观看9 | 91精品伊人久久大香线蕉| 18+在线观看网站| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲精品一区蜜桃| 国产精品一国产av| 亚洲精品第二区| 欧美xxⅹ黑人| 美女福利国产在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美日韩亚洲高清精品| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲av福利一区| 女性被躁到高潮视频| 少妇的逼水好多| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 日韩大片免费观看网站| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精品人妻在线不人妻| 成人手机av| av卡一久久| 青春草视频在线免费观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美日韩一级在线毛片| av卡一久久| 亚洲三区欧美一区| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 美女中出高潮动态图| 亚洲一区二区三区欧美精品| 最近中文字幕高清免费大全6| 18禁动态无遮挡网站| 免费高清在线观看日韩| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品人妻在线不人妻| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲成人一二三区av| 久久久a久久爽久久v久久| 天天操日日干夜夜撸| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产亚洲精品第一综合不卡| 男的添女的下面高潮视频| 午夜久久久在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 成年人免费黄色播放视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 岛国毛片在线播放| 成人国语在线视频| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品国产av在线观看| 香蕉国产在线看| 日韩免费高清中文字幕av| 在线观看人妻少妇| 寂寞人妻少妇视频99o| 高清av免费在线| 自线自在国产av| 国产成人精品久久二区二区91 | 亚洲美女视频黄频| a级毛片黄视频| 十八禁网站网址无遮挡| av免费在线看不卡| 秋霞在线观看毛片| 国产一区二区激情短视频 | av卡一久久| 美女中出高潮动态图| 日本wwww免费看| 亚洲一区中文字幕在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 色播在线永久视频| 男女午夜视频在线观看| 亚洲成人av在线免费| 久久这里只有精品19| 激情视频va一区二区三区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日韩三级伦理在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 韩国精品一区二区三区| 一区二区三区精品91| 在线观看免费高清a一片| 午夜福利在线免费观看网站| 久久精品国产综合久久久| 老汉色∧v一级毛片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲,欧美精品.| 最黄视频免费看| 在线观看www视频免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 97在线视频观看| 少妇熟女欧美另类| 交换朋友夫妻互换小说| 精品少妇久久久久久888优播| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲美女黄色视频免费看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 成年美女黄网站色视频大全免费| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 欧美日本中文国产一区发布| 黑人欧美特级aaaaaa片| 少妇精品久久久久久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久久精品区二区三区| 国产黄频视频在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 大话2 男鬼变身卡| 在线 av 中文字幕| 中文字幕人妻丝袜制服| 春色校园在线视频观看| 久久人妻熟女aⅴ| 一区二区三区乱码不卡18| av有码第一页| 精品少妇内射三级| 夫妻性生交免费视频一级片| 午夜老司机福利剧场| 国产av精品麻豆| 大片免费播放器 马上看| av有码第一页| 午夜老司机福利剧场| 叶爱在线成人免费视频播放| 男男h啪啪无遮挡| 欧美激情极品国产一区二区三区| 一二三四中文在线观看免费高清| 在线天堂中文资源库| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产一区二区三区综合在线观看| 天美传媒精品一区二区| 捣出白浆h1v1| 校园人妻丝袜中文字幕| 成年人免费黄色播放视频| 成人影院久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产精品av久久久久免费| 精品少妇内射三级| 国产有黄有色有爽视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 欧美激情高清一区二区三区 | 丝瓜视频免费看黄片| 久久精品国产自在天天线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 少妇被粗大猛烈的视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 伊人久久国产一区二区| 十分钟在线观看高清视频www| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲成国产人片在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 一级毛片 在线播放| 涩涩av久久男人的天堂| 久久久久国产一级毛片高清牌| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 交换朋友夫妻互换小说| 中文字幕色久视频| 好男人视频免费观看在线| 免费黄频网站在线观看国产| 啦啦啦在线观看免费高清www| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产成人91sexporn| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产97色在线日韩免费| 青草久久国产| 久久久精品区二区三区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲天堂av无毛| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲图色成人| 一本色道久久久久久精品综合| 一个人免费看片子| 国产亚洲欧美精品永久| 热99久久久久精品小说推荐| 黑人欧美特级aaaaaa片| 成人免费观看视频高清| 国产av国产精品国产| 黄色一级大片看看| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲av日韩在线播放| www日本在线高清视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 好男人视频免费观看在线| 国产精品av久久久久免费| 五月天丁香电影| 一级片免费观看大全| 午夜激情av网站| 国产黄色免费在线视频| 免费看av在线观看网站| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久国产欧美日韩av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 我的亚洲天堂| 看十八女毛片水多多多| 最近手机中文字幕大全| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲美女搞黄在线观看| 各种免费的搞黄视频| 亚洲国产看品久久| 青春草亚洲视频在线观看| 99国产精品免费福利视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久人妻熟女aⅴ| 少妇 在线观看| 中文欧美无线码| 中文字幕制服av| 国产成人91sexporn| 久久狼人影院| 国产日韩一区二区三区精品不卡| www.av在线官网国产| 亚洲欧美一区二区三区久久| 大话2 男鬼变身卡| 久久久精品区二区三区| 极品人妻少妇av视频| 亚洲第一av免费看| 国产高清国产精品国产三级| 五月开心婷婷网| 美国免费a级毛片| 夫妻性生交免费视频一级片| www日本在线高清视频| 亚洲人成电影观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 性少妇av在线| 精品一品国产午夜福利视频| 久久久久久久久免费视频了| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 99久久精品国产国产毛片| a级毛片在线看网站| 超碰97精品在线观看| 一区二区av电影网| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久久久久久久免费视频了| 99国产综合亚洲精品| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲一码二码三码区别大吗| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日本wwww免费看| 欧美在线黄色| 日韩成人av中文字幕在线观看| 看十八女毛片水多多多| 9热在线视频观看99| 亚洲人成电影观看| 亚洲少妇的诱惑av| 97在线视频观看| 国产成人精品福利久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 午夜日本视频在线| 三上悠亚av全集在线观看| 在线观看三级黄色| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | xxxhd国产人妻xxx| 成年美女黄网站色视频大全免费| 韩国高清视频一区二区三区| 国产一区二区在线观看av| 日韩欧美一区视频在线观看| 在线观看免费高清a一片| 永久网站在线| 久久精品久久久久久久性| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 青春草视频在线免费观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 色网站视频免费| 在线免费观看不下载黄p国产| 99香蕉大伊视频| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 女人久久www免费人成看片| 99久国产av精品国产电影| 91aial.com中文字幕在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 人人澡人人妻人| 成人亚洲欧美一区二区av| 五月天丁香电影| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 日韩中文字幕欧美一区二区 | 亚洲熟女精品中文字幕| 在线观看人妻少妇| 中国国产av一级| 国产有黄有色有爽视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产97色在线日韩免费| 免费在线观看完整版高清| 亚洲精品国产av成人精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 色网站视频免费| 麻豆乱淫一区二区| 99热网站在线观看| 国产不卡av网站在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| av网站免费在线观看视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久精品亚洲av国产电影网| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 一本大道久久a久久精品| 国产精品二区激情视频| 亚洲国产欧美在线一区| 性色av一级| 日本免费在线观看一区| 久久午夜综合久久蜜桃| 日韩在线高清观看一区二区三区| av天堂久久9| av视频免费观看在线观看| 国产人伦9x9x在线观看 | 99热网站在线观看| 国产又爽黄色视频| 精品久久蜜臀av无| 日韩电影二区| 伦理电影免费视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产熟女欧美一区二区| 下体分泌物呈黄色| 久久99蜜桃精品久久| 男人舔女人的私密视频| 国产成人免费观看mmmm| 欧美97在线视频| 国产一区二区 视频在线| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 性色avwww在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲欧洲国产日韩| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产在线视频一区二区| 亚洲成人手机| 人成视频在线观看免费观看| 日韩一区二区三区影片| 精品一区二区免费观看| 91精品三级在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产成人免费观看mmmm| 国产欧美亚洲国产| 人妻系列 视频| 亚洲精品乱久久久久久| 日韩一区二区视频免费看| 人人澡人人妻人| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 男女啪啪激烈高潮av片|