蛋白質組學在中醫(yī)藥科學研究中的應用進展△

朱宇偉，于慶云，劉培，張衛(wèi)華，于金高，李會偉，張穎，朱悅

(1.南京中醫(yī)藥大學 江蘇省方劑高技術研究重點實驗室/江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，江蘇 南京 210023)

·綜述·

蛋白質組學在中醫(yī)藥科學研究中的應用進展△

朱宇偉1，2，于慶云1，2，劉培1*，張衛(wèi)華2，于金高1，李會偉1，張穎1，朱悅1

(1.南京中醫(yī)藥大學 江蘇省方劑高技術研究重點實驗室/江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，江蘇 南京 210023)

蛋白質組學是以生物體的全部或部分蛋白為研究對象，研究其在生命活動過程中的作用和功能。近年來，蛋白質組學在中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中的應用越來越廣泛，本文對蛋白質組學在中醫(yī)藥若干科學問題研究中的應用現(xiàn)狀，包括中藥材栽培、中藥作用靶點、中醫(yī)證候本質及對方劑作用機理等方面進行分析與論述，以期為蛋白質組學進一步應用于中醫(yī)藥研究提供參考。

蛋白質組學；中醫(yī)藥研究；應用進展

蛋白質組學(proteomics)是指通過生化方法對蛋白質進行大規(guī)模研究的科學，其與轉錄組學、基因組學和代謝組學等一同構成系統(tǒng)生物學的組學(omics)生物技術基礎。隨著人類基因組測序計劃的完成，單純的基因組研究已經滿足不了科研的需求，生命科學的重心開始轉移到對基因的表達產物蛋白質的研究上來。中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，是中華醫(yī)學文化幾千年臨床經驗的積淀。蛋白質組學可以作為連接中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)藥兩種科學體系的橋梁，為中醫(yī)藥認識疾病的方法、理論的現(xiàn)代科學表征體系提供適宜的方法。

隨著科技的發(fā)展，蛋白質組學具有整體性和系統(tǒng)性[1]的特點，隨著科技的發(fā)展，蛋白質組學在中醫(yī)藥科學研究中的應用越來越多，其應用范圍從藥材的種植、性狀研究，到中藥作用機制的探討，再到中醫(yī)基本理論的量化、方劑臨床療效的分析等方面。

1 蛋白質組學在中藥材栽培研究中的應用

植物從生長發(fā)育到衰老死亡，體內的蛋白質將發(fā)生相應的改變，通過研究植物的蛋白質組學，可以發(fā)現(xiàn)相關的反應蛋白，進而指導植物的栽培。近年來，國際上越來越多地利用蛋白質組學技術研究植物組織(器官)、細胞器、植物發(fā)育過程和植物響應環(huán)境脅迫的蛋白質組特征等方面內容。

在中藥材栽培上，李改玲[2]對地黃連作障礙的差異蛋白質組學進行研究，發(fā)現(xiàn)不同連作條件下37個發(fā)生差異表達的蛋白質，并鑒定了其中與光合作用、代謝、能量、抗性、細胞分裂相關的31個蛋白質。林茂茲等[3]采用差異蛋白質組學方法研究連作、輪作下太子參葉片蛋白質的差異表達，結果發(fā)現(xiàn)，連作可導致葉片中與植物衰老或病害、植物抗性相關的蛋白表達量上調，初步解釋了太子參連作病害頻發(fā)和提前退黃的分子基礎。Prinsi等[4]利用蛋白質組學的技術發(fā)現(xiàn)，兩個品種(軟溶質和硬溶質)的桃果實在躍變前后有53個蛋白差異表達，其中1-氨基環(huán)丙烷基-1-羥酸(ACC)氧化酶在桃果實躍變前后變化最為顯著，其次是腺苷甲硫氨酸合成酶和β-氰丙氨酸合成酶。這3種酶都參與了乙烯的生物合成和代謝，在果實成熟過程中發(fā)揮著重要作用。Dong等[5]發(fā)現(xiàn)，在成熟過程中蛋白質組學多態(tài)性在毛毛蟲體內和冬蟲夏草基質中呈動態(tài)變化。毛孢(HS)和蝙蝠蛾擬青霉(PH)蛋白質組學多態(tài)性與冬蟲夏草不同，這表明，在成熟過程中與冬蟲夏草相關的真菌和多種冬蟲夏草基因型存在差異蛋白表達。章燕珍[6]應用紫外線B波(UV-B)誘導技術對活體闊葉十大功勞葉進行紫外誘導及相關蛋白質組學分析。通過對6 h UV-B照射、不同時間培養(yǎng)后的指紋圖譜進行分析，發(fā)現(xiàn)闊葉十大功勞中次生代謝產物有顯著的變化。與對照組相比，藥根堿、非洲防己堿、巴馬汀和小檗堿分別增加了919.6%、391.4%、192.4%和33.1%。通過基質輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)鑒定，普通雙向電泳得到了13個差異點，利用組合肽配體庫技術后，檢測到了91個新蛋白點，同時異喹啉生物堿合成的6個關鍵酶基因經誘導后也顯著提高。

植物各組織(器官)和細胞器中的許多蛋白在植物生長發(fā)育過程中發(fā)生變化。大部分中藥材中含有與光合作用、代謝、細胞分裂、成熟相關的蛋白質。通過對這些蛋白質的比較研究，可掌握藥用資源生物生長成熟過程中與可利用物質相關的蛋白質的變化規(guī)律，可為從分子水平對藥用資源生物可利用物質生物合成進行定向調控提供依據。

2 蛋白質組學在中藥作用靶點研究中的應用

中藥進入體內發(fā)揮作用的基本環(huán)節(jié)是藥物分子與細胞之間的直接或間接的相互作用，而這必然會引起從遺傳信息到整體功能實現(xiàn)中的分子、細胞、器官、整體多個層面的結構與功能狀態(tài)的改變，調節(jié)這些層面的結構與功能的本質是基因，而直接的作用者主要是蛋白質。通過蛋白質組學分析可以進行中藥材有效部位或有效成分作用靶點的識別，進而指導和預見中藥材中化學成分的發(fā)現(xiàn)和分離[5-7]。

Yue QX等[8]用蛋白質雙向電泳結合基質輔助激光解吸電離質譜與電噴霧質譜(MALDI-MS/MS)鑒定的方法研究靈芝中的靈芝酸D(Ganoderic acid D)對人宮頸癌細胞株Hela細胞毒性的作用機制，發(fā)現(xiàn)了21個可能是靈芝酸D靶點的差異表達蛋白，并繪制了這些蛋白的相互作用網絡。Wang X等[9]利用蛋白質組學方法發(fā)現(xiàn)，從藤黃中分離的S型藤黃酸(S-gambogic acid)抑制人肝癌細胞株HepG2細胞增殖的蛋白質分子靶標為stathmin 1。趙欣等[10]應用二維電泳與質譜聯(lián)用技術，在帕金森病小鼠模型上對中藥成分松果菊苷的神經保護作用機制進行研究，發(fā)現(xiàn)膽綠素還原酶B可能為其作用過程中的關鍵蛋白之一。Liu等[11]采用蛋白質組學技術考察了丹參酮IIA保護阿霉素造成的小鼠腎損傷的分子機制。張李峰[12]在紅芪和黃芪的免疫調節(jié)作用及抗免疫老化機制比較硏究中，通過蛋白質組學技術掃描得到蛋白質圖譜，并進行質譜鑒定，分析差異蛋白質。結果發(fā)現(xiàn)，老齡小鼠脾淋巴細胞總蛋白圖譜經含紅芪或含黃芪玉屏風含藥血清干預后發(fā)生明顯變化。根據美國國立生物技術信息中心(NCBI)蛋白質數據庫中提供的功能信息，成功鑒定了9個蛋白質，實驗結果初步證明，這些蛋白可能與衰老有關。Lin等[13]在系統(tǒng)生物學文獻回顧研究中發(fā)現(xiàn)，許多研究都表明針灸和草藥具有治療價值。不同的穴位、不同的治療時間和草藥提取物可用于緩解各種癥狀，并通過改變基因和蛋白的表達來調節(jié)生物途徑。Lao等[14]通過概括蛋白質組學的應用，研究中醫(yī)藥補充治療神經疾病、癌癥、心血管疾病、糖尿病、免疫相關疾病的作用機制，取得了實質性的進展。Wang等[15]利用代謝組學和蛋白質組學方法來鑒定和評估抗丙型肝炎病毒感染的熊膽粉蛋白質(PBBP)，結果鑒定出38種生物標志物，發(fā)現(xiàn)兩個獨特的代謝途徑在不同程度上影響丙型肝炎病毒動物。Chak KF等[16]在中國傳統(tǒng)中藥燙傷膏(Shiunko)對成纖維細胞及其應用于傷口愈合過程的研究中發(fā)現(xiàn)，被Shiunko誘導的成纖維細胞有差異蛋白表達，與抗氧化活性、細胞增殖、抗凋亡、膠原分泌和細胞運動等生理功能相關。Stathmin蛋白可能是傷口愈合過程的良好標志。Wang等[17]對中藥梔子的主要成分梔子苷采用生化、代謝組學和蛋白質組學的治療效果進行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)梔子苷具有潛在的調節(jié)多種干擾途徑的藥理作用。Manavalan A等[18]通過研究天麻對大腦蛋白質代謝的定量蛋白質組學，獲得了天麻治療與腦功能之間有直接關系的證據。天麻的長期治療可以通過下調如Gnao1、Dctn2等蛋白調節(jié)腦蛋白代謝。

中草藥的藥效作用靶點與機制不明確是中醫(yī)藥國際發(fā)展的一大障礙。通過蛋白質組學分析可以比較中草藥作用前后相應靶器官或組織中蛋白質的變化，從而進行中藥有效部位或有效成分作用靶點的識別，有利于中藥作用機制的科學解釋。

3 蛋白質組學技術對中醫(yī)基本理論之證候學說的本質研究

證候是生命活動的表現(xiàn)特征，而生命活動的主要執(zhí)行者則是蛋白質，基因決定蛋白質的表達，蛋白質的表達決定人的外表、特征、行為等，那么不同的“證”可能受不同的基因調控。而基因作為遺傳信息的載體，均要表達為相應的蛋白質或修飾相關蛋白才能影響生物的功能。

周俊亮等[19]運用蛋白質組學技術，對中醫(yī)氣虛體質的組織和細胞進行蛋白質組分析，探索氣虛體質與蛋白質組學之間的關系，建立“氣虛體質-蛋白質指紋圖譜”，進而嘗試揭示中醫(yī)氣虛體質的科學內涵。Zhao等[20]對中醫(yī)胸痹血瘀證行蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，在患者血漿中α1-酸性糖蛋白等表達升高，載脂蛋白AIV等表達降低，并預測該差異蛋白可能作為冠心病血瘀證診斷或治療的新靶標。張曉麗等[21]運用蛋白質組學技術進行正常、病理薄苔、厚苔和剝苔各20例的舌苔蛋白質組檢測，篩選出具有明顯表達差異的36個蛋白質點。趙慧輝等[22]采用差異凝膠雙向電泳和質譜聯(lián)用技術對冠心病不穩(wěn)定性心絞痛血瘀證患者和健康人血漿進行比較研究，發(fā)現(xiàn)急性時相反應相蛋白(APR)、載脂蛋白和凝血相關蛋白三類差異蛋白，其中Fibrinogenβchain、Fibrinogenγchain、α1-Antitrypsin、Haptoglobinβchain、Haptoglobinα2 chain在冠心病不穩(wěn)定性心絞痛血瘀證患者中高表達，ApoA-IV、ApoA-I、Transthyretin、ApoJ在患者中低表達。Liu等[23]通過篩選和鑒定潛在生物標志物，成功地將結核病的3個中醫(yī)證候進行區(qū)分，載脂蛋白C-III被確定為結核病中醫(yī)證候的潛在生物標志物。黃金燕[24]通過蛋白組學技術分離并鑒定子宮內膜異位癥(EM)血瘀證、氣滯血瘀證、腎虛血瘀證患者在位內膜的差異蛋白質，結果發(fā)現(xiàn)，EM血瘀證患者與健康婦女在位內膜之間有差異蛋白表達，Ang-2、Foxp3、MIF可能是潛在的EM血瘀證及其主要相關復合證腎虛血瘀證、氣滯血瘀證的辨證相關分子標物；Survivin在各組的表達特異性較差，不適于作為指導診斷和辨證的備選分子。Liu等[25]通過篩選和鑒定在冠心病血瘀證中差異表達的活化血小板蛋白，解釋活血藥抗血小板的作用機制，并提供可用于血瘀證的許多潛在可用于評估抗血小板臨床療效的生物標志物。Song等[26]研究蛋白質組學、代謝組學等和證型分化的關系，總結了典型組學在普通疾病和中醫(yī)辨證中的應用，并討論了證型分化研究的主要問題及對策。Liu等[27]運用蛋白質組分析的方法——二維凝膠電泳(2-DE)與基質輔助激光解吸/電離飛行時間的質譜(MALDI-TOF-MS)，探索血漿蛋白質組和中醫(yī)中慢性乙型肝炎(CHB)不同證型的聯(lián)系。結果發(fā)現(xiàn)，在CHB 5個中醫(yī)證候中，免疫球蛋白J-鏈(IGJ)和C反應蛋白(CRP)是上調的，而結合珠蛋白(HPT)、視黃醇結合蛋白(RBP)等被下調。IGJ可以作為不同證型慢性乙肝患者診斷的一種新的生物標志物。

中醫(yī)證候學說是中醫(yī)的特色理論之一，但其缺乏科學的量化標準，對于證候的判斷往往是醫(yī)生憑借經驗，不同的醫(yī)生其診斷的結果往往不同。而蛋白質組學技術應用于中醫(yī)證候學說研究，是以蛋白質為切入點，深入進行證候實質的研究，在生物標志物的發(fā)現(xiàn)、證候的物質基礎與量化表征方面具有獨特優(yōu)勢。

4 蛋白質組學在方劑作用機理研究中的應用

方劑是在辨證論治的基礎上按照組方原則，通過選擇合適藥物，酌定劑量，規(guī)定適宜劑型及用法等一系列過程形成的治療處方。方劑具有多活性組分、多靶點、代謝途徑復雜等特點，而分析尋找各作用靶點成為方劑作用機制和療效研究的重點。苗蘭等[28]研究血府逐瘀湯對氣滯血瘀證模型大鼠血清蛋白質組表達的影響，利用雙向凝膠電泳分離血清總蛋白，通過Image Master 2D Elite 6.01凝膠圖像分析軟件分析2-DE圖譜，比較各組間蛋白表達譜的改變情況。經軟件分析確定的差異蛋白點有7個，其中模型組大鼠血清與正常組相比有1個蛋白質下調，5個蛋白質上調，1個蛋白表達缺失，而給予血府逐瘀湯后可改善這些改變及缺失蛋白質的表達水平。

楊軍等[29]用蛋白質組學的方法研究壯骨止痛方治療骨質疏松的作用機理，建立去卵巢大鼠骨質疏松癥模型，結合蛋白質生物信息庫證實胰島素受體蛋白、熱休克同源M、道爾頓蛋白、分泌顆粒素NN在壯骨止痛方治療骨質疏松病過程中發(fā)揮著重要的調控作用。高燕[30]通過三水白虎湯含藥血清干預類風濕關節(jié)炎(RA)、骨關節(jié)炎(OA)患者的關節(jié)滑膜成纖維細胞，觀察該方對細胞增殖的抑制情況。結果發(fā)現(xiàn)，三水白虎湯含藥血清干預關節(jié)炎滑膜成纖維細胞后，11個蛋白在RA滑膜成纖維細胞中表達明顯變化，15個蛋白在OA滑膜成纖維細胞中表達有明顯差異。推測這些分子中部分可能與三水白虎湯抑制滑膜成纖維細胞增殖有關，其可能是該方治療類風濕關節(jié)炎的作用機制之—。張穎[31]以卵巢切除大鼠作為絕經后骨質疏松癥動物模型，用左歸丸進行干預，應用蛋白組學方法從大鼠股骨骨髓中分析鑒定出11個差異蛋白質。這些差異蛋白質主要涉及能量代謝、抗氧化、信號傳導、細胞增殖、分化和調亡等多方面的功能。說明在分子水平上左歸丸可通過調節(jié)骨髓內細胞增殖、分化、凋亡和能量代謝以及氧化反應等來實現(xiàn)對去卵巢所致大鼠骨質疏松癥的預防作用。Wang等[32]分析茵陳蒿湯，證明其為有效的臨床治療肝損傷綜合征的經典組合。茵陳蒿湯由黃花蒿、梔子和大黃構成，其主要活性成分分別為6，7-二甲基七葉亭(D)、京尼平苷(G)、和大黃酸(R)。將DGR組合施加在肝損傷的大鼠模型中，結果發(fā)現(xiàn)，DGR協(xié)同導致代謝生物標志物的動態(tài)變化，通過靶蛋白的分子調控網絡，具有協(xié)同/相加效應。Sun等[33]利用雙向電泳技術和MALDI技術進行中藥復方茵陳蒿湯保肝作用的蛋白質組學研究，結果發(fā)現(xiàn)，用藥后鋅指蛋白407、觸珠蛋白、巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶顯著下調，運甲狀腺素蛋白、維生素D結合蛋白、凝血酶原等顯著上調，這些蛋白與代謝、能量產生、抗氧化、信號轉導、蛋白質折疊和凋亡有關。Zheng等[34]在研究《金匱要略》方金公式時，運用蛋白質組學分析表明，熱休克蛋白(HSP)如，HSP90AA1和HSPA1B，在金公式組明顯下調。

方劑作用過程復雜，作用機制尚不明確。通過蛋白質組學研究方劑可直接比較藥物組合對蛋白質數量、種類的影響與改變，探知作用靶點、作用過程，揭示藥物與機體間的相互作用機制，同時又可發(fā)現(xiàn)復方中的有效成分及各成分間的協(xié)同關系，為復方的二次優(yōu)化奠定基礎。

5 總結與展望

蛋白質組具有整體性、動態(tài)性、時空性、復雜性等特征，這與中醫(yī)基本理論體系十分吻合。以蛋白質組學為切入點進行中醫(yī)藥科學研究在現(xiàn)代實驗研究中具有明顯的優(yōu)勢[35]，主要表現(xiàn)在以下幾方面：1)通過分析藥用生物細胞內蛋白質組成、表達和修飾狀態(tài)，可從分子水平解釋藥用生物自身遺傳或對環(huán)境響應的分子機理，有利于從蛋白質層面對藥用生物可利用物質的生物合成進行定向調控；2)對中醫(yī)證候的蛋白質組學分析，建立某種證型特定的蛋白質數據庫，有利于補充中醫(yī)診斷的標準，為其提供客觀準確的依據；3)蛋白質組學從整體出發(fā)進行中藥作用靶點、方劑作用機制研究，有助于揭示中藥方劑治療疾病的分子作用機理，建立客觀評價體系，為中藥新藥研發(fā)提供新的思路和方法[36]。

目前，蛋白質組學在中藥材栽培、中藥作用靶點、中醫(yī)證候研究、方劑作用機制等方面已取得一定成果，但作為一門新興學科，現(xiàn)仍處于不斷發(fā)展和逐步完善的階段，如相關的蛋白質組學研究技術仍不能完全滿足研究的需要，或有些操作過程過于繁瑣，需要技術發(fā)展以簡化過程、提高效率等。盡管蛋白質組學在發(fā)展過程中還存在一些問題，但其應用的價值極大?，F(xiàn)階段，蛋白質組學正逐步與基因組學、轉錄組學、代謝組學整合，有望從中獲得對中醫(yī)藥作用的全面綜合認識，促進中醫(yī)藥事業(yè)快速發(fā)展。

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AdvancesofProteomicsinTraditionalChineseMedicineResearches

ZHU Yuwei1，2，YUQingyun1，2，LIUPei1*，ZHANGWeihua2，YUJingao1，LIHuiwei1，ZHANGYing1，ZHUYue1

(1.JiangsuKeyLaboratoryforHighTechnologyResearchofTCMFormulae，andJiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.BasicMedicalCollege，UniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

The research object of proteomics is all or part of the protein in living organism.Their role and function in biological processes were studied.In recent years，the application of proteomics is becoming more and more widely.In this paper，the application status in traditional Chinese medicine was reviewed，including the research of Chinese traditional medicine planting，the effect targets，the essence of TCM syndrome，the mechanism of formulae and so on.It would provide support for further application of proteomics in the effective mechanism revelation of traditional Chinese medicine.

Proteomics；traditional Chinese medicine research；application progress

2014-12-16)

國家自然科學基金項目(81202880)；江蘇省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201410315001Z)

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劉培，助理研究員 ，研究方向：中藥與方劑功效物質基礎研究；Tel：(025)85811917，E-mail：liupeinj@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.028