P38MAPK抑制劑對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷發(fā)展及TNF-α與IL-10表達(dá)的影響

羅小鳳

(宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，江西　宜春　336000)

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P38MAPK抑制劑對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷發(fā)展及TNF-α與IL-10表達(dá)的影響

羅小鳳

(宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室，江西宜春336000)

摘要〔〕目的探討P38MAPK抑制劑對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷發(fā)展及腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-10表達(dá)的影響。方法選取48只12～14周齡的健康Wistar大鼠，并將其制作為大鼠腹部軸型淺動(dòng)靜脈皮瓣模型，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其均分為對(duì)照組、缺血再灌注組、生理鹽水組和抑制劑組。術(shù)后第7天分別采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)定各組大鼠的皮瓣存活率和血清TNF-α、IL-10濃度，同時(shí)采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠皮瓣的P38MAPK和P-P38MAPK表達(dá)情況。結(jié)果①對(duì)照、抑制劑組大鼠皮瓣存活率高于缺血再灌注、生理鹽水組(P<0.05)，對(duì)照、抑制劑組，缺血再灌注、生理鹽水組之間皮瓣存活率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；②對(duì)照、抑制劑組大鼠血清TNF-α濃度低于缺血再灌注、生理鹽水兩組(P<0.05)，對(duì)照、抑制劑組，缺血再灌注、生理鹽水組之間血清TNF-α濃度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；抑制劑組大鼠血清IL-10濃度高于對(duì)照、缺血再灌注、生理鹽水組(P<0.05)，缺血再灌注、生理鹽水、抑制劑三組大鼠血清IL-10濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；③缺血再灌注、生理鹽水、抑制劑組大鼠P38MAPK、P-P38MAPK評(píng)分高于對(duì)照組，而缺血再灌注、生理鹽水組評(píng)分高于抑制劑組(P<0.05)；④皮瓣存活率與TNF-α呈負(fù)相關(guān)(r=-0.582，P<0.05)，P38MAPK、P-P38MAPK評(píng)分與TNF-α均呈正相關(guān)(r=0.608、0.775，P<0.05)，皮瓣存活率、P38MAPK、P-P38MAPK評(píng)分與IL-10均無(wú)相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。結(jié)論P(yáng)38MAPK抑制劑通過(guò)抑制皮瓣中P38MAPK信號(hào)通路，減少P38MAPK和P-P38MAPK的表達(dá)，從而降低血清TNF-α的濃度，減輕缺血再灌注損傷，提高皮瓣的存活率。

關(guān)鍵詞〔〕P38MAPK抑制劑；皮瓣；缺血再灌注損傷；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-10

第一作者：羅小鳳(1976-)，女，碩士，講師，主要從事人體解剖學(xué)方面的研究。

缺血再灌注損傷是導(dǎo)致皮瓣移植術(shù)后壞死的主要因素，也是目前器官、組織移植領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)〔1〕。隨著絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路在缺血再灌注損傷中的作用逐漸受到重視，越來(lái)越多的研究證實(shí)了P38MAPK信號(hào)通道在多種器官以及組織缺血再灌注損傷中發(fā)揮著不同的作用〔2〕。細(xì)胞因子作為組織炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志物，激活的P38MAPK會(huì)促進(jìn)其分泌和釋放，進(jìn)而參與缺血再灌注損傷的發(fā)生及發(fā)展〔3〕。SB202190作為一種P38MAPK抑制劑，它通過(guò)阻礙ATP與P38MAPK的結(jié)合，可以特異性地抑制P38MAPK信號(hào)通道的活性〔4〕。本研究旨在研究SB202190對(duì)皮瓣缺血再灌注損傷發(fā)展和腦瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-10表達(dá)的影響，從而為缺血再灌注損傷的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取48只健康Wistar雄性大鼠(蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，周齡12～14 w，體重250～350 g，未出現(xiàn)特定病原菌級(jí)(SPF級(jí))。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器、試劑

1.2.1儀器CT14RD-冷凍離心機(jī)(由天美公司生產(chǎn)提供)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀器(Biotek公司生產(chǎn))，-80℃超低溫冰箱(Thermo公司生產(chǎn))，BX51光學(xué)顯微鏡以及圖像采集系統(tǒng)(Olympus公司生產(chǎn))。

1.2.2試劑即用型快速免疫組化試劑盒(基因公司生產(chǎn))，SB202190(Cayman公司)，在使用之前溶解并配制成0.1 mg/ml的溶液，大鼠TNF-α、IL-10酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒(R&D公司)，P38一抗、P-P38一抗(Abcam公司)。

1.3動(dòng)物模型的建立及分組

1.3.1大鼠皮瓣模型的建立大鼠稱(chēng)重后注射2%的戊巴比妥鈉(35～40 kg)進(jìn)行麻醉，麻醉成功后將其固定在手術(shù)板上，在手術(shù)前進(jìn)行腹部脫毛、消毒處理，隨后參照有關(guān)文獻(xiàn)〔5〕制作腹壁淺動(dòng)靜脈皮瓣。

1.3.2實(shí)驗(yàn)分組及處理方法按照隨機(jī)數(shù)字表法將48只大鼠均分為四組，每組12只。對(duì)照組對(duì)建立的皮瓣模型不進(jìn)行任何處理，只以3-0絲線(xiàn)對(duì)皮瓣切口進(jìn)行原位縫合；缺血再灌注組在掀開(kāi)大鼠皮瓣后，通過(guò)無(wú)損顯微鏡微血管夾將腹壁淺動(dòng)靜脈夾閉，缺血6 h后將血管夾取出，待腹部淺動(dòng)靜脈血流恢復(fù)正常后對(duì)皮瓣進(jìn)行原位縫合；生理鹽水組，在缺血再灌注組處理的基礎(chǔ)上，于手術(shù)后的第2、4、6天向腹腔注射生理鹽水(2 ml/kg)；抑制劑組，在缺血再灌注組處理的基礎(chǔ)上，在手術(shù)后的第2、4、6天向腹腔注射SB202190(2 μg/kg)。

1.4觀(guān)察指標(biāo)手術(shù)后第7天測(cè)定各組大鼠以下指標(biāo)：(1)皮瓣存活率：采用Image-Pro Plus.V6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算皮瓣的存活率，成活率=成活面積/總面積×100%。(2)血清TNF-α、IL-10濃度：采用酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA)測(cè)定各組大鼠的血清TNF-α、IL-10濃度。(3)皮瓣P(guān)38MAPK的表達(dá)情況：采用免疫組化法測(cè)定各組大鼠皮瓣內(nèi)的P38MAPK表達(dá)情況，并參照有關(guān)文獻(xiàn)〔6〕對(duì)P38MAPK以及P-P38MAPK染色強(qiáng)弱以及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行評(píng)分：①染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)為0，弱為1，中等為2，強(qiáng)為3；②陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為含棕黃色顆粒的細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)目的比例，其中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目<25%計(jì)為1，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目25%～50%計(jì)為2，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目>50%計(jì)為3。

在進(jìn)行房屋建筑施工過(guò)程中，通常都會(huì)遇到一些問(wèn)題：①材料問(wèn)題，現(xiàn)在的市場(chǎng)上建筑材料有好有壞，有些企業(yè)使用比較好的材料，建筑質(zhì)量相應(yīng)的也會(huì)更好，但是也有一些企業(yè)為了謀求更大的經(jīng)濟(jì)利益，他們往往會(huì)選擇比較劣質(zhì)的材料代替那些質(zhì)量比較好但價(jià)格比較高的材料，這樣情況下建設(shè)出來(lái)的房屋毋庸置疑是不好的。②施工時(shí)的天氣狀況，天氣狀況也會(huì)影響到施工質(zhì)量，試想一下，如果在施工的當(dāng)天下了雨，那么建筑的混凝土在摻了水的情況下質(zhì)量就會(huì)大大下降，從而影響房屋質(zhì)量。③地質(zhì)狀況，如果建筑選址選的不好，出現(xiàn)地基下沉的話(huà)，也會(huì)對(duì)建筑房屋的質(zhì)量造成影響。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件，多組定量資料的比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson積矩相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1四組大鼠的皮瓣存活率比較四組大鼠的皮瓣存活率經(jīng)方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=8.732，P<0.05)；兩兩比較顯示，對(duì)照〔(94.23±2.87)%〕、抑制劑組〔(87.71±2.99)%〕的皮瓣存活率高于缺血再灌注〔(55.82±3.36)%〕、生理鹽水組〔(51.35±3.20)%〕(P<0.05)，對(duì)照、抑制劑兩組之間的皮瓣存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，缺血再灌注、生理鹽水兩組之間的皮瓣存活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.2四組大鼠的血清TNF-α、IL-10濃度比較四組大鼠的血清TNF-α濃度經(jīng)方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=12.038，P<0.05)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)照、抑制劑組的血清TNF-α濃度〔(149.39±15.82)、(160.12±16.85)ng/L〕低于缺血再灌注、生理鹽水兩組〔(235.65±16.98)、(249.01±17.00)ng/L〕(P<0.05)，對(duì)照、抑制劑組，缺血再灌注、生理鹽水組之間的血清TNF-α濃度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。四組大鼠的血清IL-10濃度經(jīng)方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=10.167，P<0.05)，兩兩比較顯示，抑制劑組〔(75.38±5.26)ng/L〕的血清IL-10濃度高于對(duì)照、缺血再灌注、生理鹽水組〔(52.77±5.85)、(54.91±6.03)、(52.14±6.70)ng/L〕(P<0.05)，對(duì)照、缺血再灌注、生理鹽水三組的血清IL-10濃度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

2.3四組大鼠的P38MAPK、P-P38MAPK評(píng)分比較四組大鼠的P38MAPK、P-P38MAPK評(píng)分經(jīng)方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=11.982、10.726，P<0.05)，兩兩比較發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注、生理鹽水、抑制劑組的P38MAPK、P-P38MAPK評(píng)分高于對(duì)照組，缺血再灌注、生理鹽水組的P38MAPK、P-P38MAPK評(píng)分高于抑制劑組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別nP38MAPK(分)P-P38MAPK(分)對(duì)照組122.26±0.931.23±0.57缺血再灌注組125.31±1.041)5.46±0.891)生理鹽水組124.98±0.991)5.01±0.631)抑制劑組123.37±1.031)2)1.96±0.701)2)

與對(duì)照組比較:1)P<0.05;與缺血再灌注、生理鹽水組比較:2)P<0.05

2.4皮瓣存活率、P38MAPK、P-P38MAPK評(píng)分與TNF-α、IL-10濃度的相關(guān)性分析皮瓣存活率與TNF-α呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.582，P<0.05)，P38MAPK、P-P38MAPK評(píng)分與TNF-α均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.608、0.775，P<0.05)，皮瓣存活率、P38MAPK、P-P38MAPK評(píng)分與IL-10均無(wú)相關(guān)關(guān)系(r=0.297、-0.137、-0.316,P>0.05)。

3討論

現(xiàn)有研究表明細(xì)胞炎癥因子是造成組織損傷的重要原因之一：釋放的致炎性細(xì)胞因子增加血管的通透性及組織水腫，加重缺血損傷；同時(shí)，它還能經(jīng)血液循環(huán)到遠(yuǎn)處，導(dǎo)致組織器官形態(tài)功能的損傷及障礙〔7，8〕。TNF-α作為一種重要的促炎癥細(xì)胞因子，可與不同的炎癥介質(zhì)形成復(fù)雜的炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，從而參與組織缺血再灌注損傷〔9〕，血清IL-10作用與TNF-α相反，它是一種抗炎性細(xì)胞因子，通過(guò)拮抗炎性細(xì)胞因子而發(fā)揮抗炎作用〔10〕。P38MAPK是介導(dǎo)細(xì)胞因子和組織炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有研究證實(shí)它參與了缺血再灌注損傷的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，而P38MAPK抑制劑可通過(guò)抑制組織內(nèi)P38MAPK的表達(dá)，減少炎性因子的生成，并最終抑制過(guò)度的炎性反應(yīng)而減輕缺血再灌注損傷〔11〕。本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷后大鼠皮瓣存活率降低，而P38MAPK抑制劑有助于減輕缺血再灌注損傷，與有關(guān)研究結(jié)果〔5〕相似。結(jié)果還表明，皮瓣缺血再灌注損傷增強(qiáng)了致炎性細(xì)胞因子的作用，加劇了組織的炎癥損傷，而P38MAPK抑制劑減少了致炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。此外，研究還顯示，P38MAPK抑制劑可通過(guò)增加抗炎性細(xì)胞因子的濃度而減輕組織的炎癥損傷，繼而減輕皮瓣的缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷可能通過(guò)激活P38MAPK轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)P38MAPK和P-P38MAPK的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用〔4〕，而P38MAPK抑制劑通過(guò)抑制P38MAPK的作用可以減輕皮瓣的缺血再灌注損傷。進(jìn)一步進(jìn)行的相關(guān)性分析提示P38MAPK和P-P38MAPK的生成將促進(jìn)TNF-α的產(chǎn)生，降低皮瓣缺血再灌注損傷的存活率。與有關(guān)研究結(jié)果〔5〕一致。但本次研究未發(fā)現(xiàn)皮瓣存活率、P38MAPK、P-P38MAPK評(píng)分與IL-10存在相關(guān)性，原因可能與本研究選取的大鼠樣本量較小有關(guān)。因此，在以后相關(guān)的研究中，建議增加樣本量進(jìn)行深入研究。

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〔2015-01-19修回〕

(編輯袁左鳴)

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R62〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-7044-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.034