前哨淋巴結(jié)連續(xù)切片及免疫組化檢查在陰莖癌治療中的價值

韓　鋒　李慶文　馮振中　鄧　娟

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽　蚌埠　233000)

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前哨淋巴結(jié)連續(xù)切片及免疫組化檢查在陰莖癌治療中的價值

韓鋒李慶文馮振中1鄧娟2

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽蚌埠233000)

摘要〔〕目的探討前哨淋巴結(jié)(SLN)連續(xù)切片及免疫組化檢查在陰莖癌治療中的價值。方法回顧性分析陰莖癌41例患者臨床資料與病理資料，患者切除原發(fā)病灶后使用亞甲藍藍染，并行改良腹股溝淋巴清掃術(shù)(ILND)。結(jié)果SLN檢出39例(95.12%)，檢出SLN共有62枚，免疫組化檢查結(jié)果顯示，其中SLN陽性12例，陰性27例，SLN結(jié)果與ILND病理檢查結(jié)果相符合者12例，1例假陰性，SLN免疫組化準確率為97.44%(38/39)，假陰性率為7.69%(1/13)，靈敏度為92.31%(12/13)，兩種檢查方式差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論SLN活檢技術(shù)(SLNB)相對于預防性的淋巴結(jié)清掃術(shù)而言，具有創(chuàng)傷小、并發(fā)癥低的優(yōu)點，故對于陰莖癌手術(shù)患者治療方案的確定具有重要臨床應用價值。

關(guān)鍵詞〔〕前哨淋巴結(jié)；免疫組化；陰莖癌

1病理科2手術(shù)室

第一作者：韓鋒(1975-),男,碩士,主治醫(yī)師，主要從事泌尿系統(tǒng)疾病研究。

前哨淋巴結(jié)(SLN)最早于1977年Cabanas提出，這組淋巴結(jié)是陰莖癌患者最早發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)〔1〕。目前認為SLN是最先接受腫瘤引流的第一站區(qū)域淋巴結(jié)，同時它也最先反映腫瘤轉(zhuǎn)移情況，因而SLN是進行組織病理學檢查中最具有價值的一組淋巴結(jié)〔2〕。目前，關(guān)于SLN連續(xù)切片及免疫組化檢查在陰莖癌治療中的價值研究報道鮮見，而患者于術(shù)前、術(shù)后對于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的準確評估，對于手術(shù)淋巴結(jié)清掃方案的制定有著重要的價值，從而能夠解決一直以來所爭論的淋巴結(jié)清掃范圍問題。本研究探討SLN連續(xù)切片及免疫組化檢查在陰莖癌治療中的價值。

1資料與方法

1.1一般資料2005年4月至2013年4月我院泌尿科住院的陰莖癌患者41例，年齡52～85歲，平均(64.52±12.42)歲；腫瘤直徑0.5～3.4 cm，均為鱗狀上皮癌，其中低分化鱗癌2例，中分化鱗癌16例，高分化鱗癌23例。實際檢出SLN 39例，其臨床分期為T3期17例，T2期15例，T1期7例。其中4例接受了陰莖部分切除術(shù)，其余均行陰莖全切除術(shù)及會陰部造口術(shù)，術(shù)后隨訪6個月至7年。

1.2主要儀器與設(shè)備徠卡切片機RM2135(德國LEICA產(chǎn)品)、病理組織漂烘處理儀PHY-Ⅲ(常州中威電子儀器廠)、電熱恒溫培養(yǎng)箱WMK-L8(山東濰坊醫(yī)藥集團醫(yī)療器械廠)、低溫冰箱BCD-206(三菱重工)、雙目光學顯微鏡、彩色病理圖像分析系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)。

1.3手術(shù)及SLN穿刺定位、活檢方法患者取平臥位，待麻醉滿意后，常規(guī)消毒鋪巾，使用亞甲基藍為染料，抽取亞甲基藍10 ml，于瘤體周邊0.5～1 cm處，于12、3、6、9點4個方位順時針將染料注射于皮下及腫瘤深部組織當中，每點注射量為2～25 ml，注射范圍皮膚使用手掌輕輕揉按10 min，以利于染料的充分擴散；之后再行陰莖全切除術(shù)或陰莖部分切除術(shù)，并進行陰部造口術(shù)，30～60 min后取SLN(SLN根據(jù)術(shù)中藍染的淋巴管解剖走向進行找尋，即距離瘤體中心位置最近的第一個藍染淋巴結(jié))，送病理檢查。后行改良腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)(ILND)，術(shù)后將腹股溝淋巴結(jié)做病理切片檢查。

1.4免疫組織化學染色法①標本處理：將所有標本使用10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水后使用石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，其中一張行HE染色，其余均行免疫組化染色。②載玻片處理：將載玻片放置于重鉻酸鉀溶液中浸泡24 h后使用流水沖洗2 h，蒸餾水沖洗3次、無水乙醇沖洗1次后放置于37℃烘箱中烘干，然后將其浸泡于1:10多聚L-賴氨酸液中大約20 s后取出瀝干，置于37℃烘箱中備用。③將石蠟切片使用二甲苯、梯度酒精洗脫后清水沖洗3遍、蒸餾水沖洗2遍。④封閉：將脫蠟之后的切片放置于3%H2O2溶液中浸泡10 min(切勿超過15 min)，以阻斷內(nèi)源性的過氧化氫酶，然后用蒸餾水沖洗2遍。⑤抗原修復：將切片放入煮沸的pH6.0檸檬酸鹽緩沖液中進行抗原修復2 min，該目的是為了使抗原位點暴露。⑥待切片自然冷卻后，使用磷酸緩沖液(PBS)沖洗2遍，去除PBS，滴加一抗50 μl(陰性對照使用PBS代替一抗)，然后放置于37℃恒溫孵箱中孵育1.5 h。⑦將切片取出后使用PBS沖洗5 min，去除PBS后加聚合物增強劑，然后置于37℃孵箱中繼續(xù)孵育30 min。⑧取出切片，使用PBS沖洗5 min，去除PBS后滴加二抗，然后再置于孵箱中孵育30 min。⑨取出切片，PBS沖洗5 min，滴加新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液，顯色3～5 min，在顯微鏡下進行觀察，胞膜或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)有棕黃色的顆粒則為陽性細胞，使用自來水沖洗以終止顯色。⑩將顯色后的切片使用清水沖洗之后，浸泡于蘇木精中進行染色，然后將其放于1%鹽酸當中分化，自來水沖洗3遍后放于溫水中返藍。將復染的切片放置于水中沖洗后，使用梯度酒精沖洗后再浸泡于二甲苯中，最后用中性樹膠封片后置于通風柜中晾干。

1.5SLN評價標準參照Louisille大學對于SLN活檢技術(shù)(SLNB)的評價標準，從檢出率、靈敏度、準確率及假陰性率幾個方面進行評價〔3〕，計算方法為：①檢出率=SLN檢出的例數(shù)÷實施SLN檢測的總例數(shù)×100%；②靈敏度=SLN陽性例數(shù)÷清掃淋巴結(jié)陽性例數(shù)×100%；③準確率=(SLN真陽性例數(shù)+SLN真陰性例數(shù))÷SLN活檢總例數(shù)×100%；④假陰性率=SLN假陰性例數(shù)÷清掃去淋巴結(jié)陽性例數(shù)×100%。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行Kappa檢驗。

2結(jié)果

SLN檢出率為95.12%(39/41)，檢出SLN共有62枚，其中1枚21例，2枚13例、3枚5例。SLN陽性12例，陰性27例，棕色代表陽性腫瘤細胞，見圖1。2例未檢出SLN患者術(shù)后證實均無腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。SLN結(jié)果與ILND病理檢查結(jié)果相符合者12例，1例假陰性。SLN免疫組化準確率為97.44%(38/39)，假陰性率為7.69%(1/13)，靈敏度為92.31%(12/13)。

圖1　SLN免疫組化結(jié)果

3討論

陰莖癌是一種較為罕見的惡性腫瘤，目前其治療仍然以手術(shù)治療為主。陰莖癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要途徑是通過淋巴系統(tǒng)，其主要區(qū)域淋巴結(jié)是髂血管淋巴結(jié)及腹股溝淋巴結(jié)，機體區(qū)域淋巴結(jié)是否累及及累及的程度是影響患者手術(shù)預后的決定性因素〔3～5〕。對于陰莖癌患者的淋巴清掃術(shù)，大部分學者持有懷疑態(tài)度，認為對于淋巴清掃術(shù)的實施可能導致某些早期患者過度治療，從而帶來一定的風險，但是目前也有文獻報道表示患者于早期實施淋巴結(jié)清掃術(shù)有助于預后的改善，從而提高無病生存率〔6〕。

SLN是陰莖腫瘤通過淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移必須經(jīng)過的第一站，具有阻止腫瘤細胞從淋巴道進行擴散的功能，其功能類似于“哨兵”，其理論基礎(chǔ)為惡性腫瘤細胞的階梯式擴散〔7～10〕。SLNB是一門新興的檢測技術(shù)，目前其正逐漸成為許多實體腫瘤局部淋巴結(jié)分期標準及治療標準〔11〕。研究報道顯示〔12〕，放射性示蹤劑及染料的聯(lián)合運用能夠顯著提高患者SLN的敏感性，從而有助于其檢出率的提高，但是該方法所需設(shè)備昂貴，在臨床工作中不利于推廣運用。染料標記方法，具有廉價、操作簡單、無輻射等優(yōu)點，無須特殊設(shè)備。

假陰性率對于SLNB的推廣具有決定性作用，在國外文獻報道中SLNB的假陰性率在5%左右〔13,14〕。導致本研究假陰性率略高的原因可能與患者轉(zhuǎn)移灶體積小、位置深有關(guān)系，由于轉(zhuǎn)移灶的位置特性，到時染料未能夠擴散到此，從而導致檢查中顯色較差，因此在未來的臨床工作當中，提示應進一步注意染料的注射深度及染料的使用劑量，從而提高染料的顯色性。SLN免疫組化方法與常規(guī)病理結(jié)果相比較，兩種檢測方法相似，而SLNB相對于預防性的淋巴結(jié)清掃術(shù)而言，其具有對患者創(chuàng)傷小、檢查并發(fā)癥低等優(yōu)點，因此對于陰莖癌手術(shù)患者，可以考慮將SLNB作為首選檢測方案，根據(jù)檢測的結(jié)果，陽性患者可擇期行二期ILND，對于檢驗結(jié)果陰性的患者則可密切觀察隨訪，以避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，這樣既能夠減少過度的淋巴結(jié)清掃術(shù)的風險，同時又可以避免延誤治療。

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〔2014-09-27修回〕

(編輯苑云杰)

中圖分類號〔〕R737.2〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7025-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.026