一測多評(píng)法測定丹參中多種指標(biāo)成分的含量

張　晨　邱　實(shí)　張彥飛　貢濟(jì)宇

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林　長春　130117)

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一測多評(píng)法測定丹參中多種指標(biāo)成分的含量

張晨邱實(shí)張彥飛貢濟(jì)宇

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117)

摘要〔〕目的采用一測多評(píng)法同步測定丹參中5個(gè)主要成分的含量,為控制丹參藥材的質(zhì)量提供方法。方法用超高效液相色譜法對丹參藥材進(jìn)行分析，獲得丹參藥材的UHPLC色譜圖與相關(guān)數(shù)據(jù)；運(yùn)用一測多評(píng)方法(SSDMC)，同時(shí)對丹參藥材中5種成分進(jìn)行定量分析。結(jié)果對丹參藥材所建立的含量測定方法可在15 min內(nèi)完成對其5個(gè)指標(biāo)性成分的精確定量分析；且使用一測多評(píng)方法僅需要一個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)品，即可進(jìn)行定量分析。方法學(xué)考察結(jié)果均符合中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求。結(jié)論該研究建立了丹參藥材的UHPLC含量測定方法，從含量測定方面控制丹參藥材的質(zhì)量。該研究建立的丹參含量測定方法簡單、快速、穩(wěn)定且成本低廉。

關(guān)鍵詞〔〕一測多評(píng)法；超高效液相色譜；丹參；含量測定；中藥質(zhì)量控制

第一作者：張晨(1987-)，女，碩士，主要從事藥物分析研究。

丹參具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效，用于月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、瘡瘍腫痛、心煩不眠、心絞痛等。丹參的有效成分分為脂溶性的二萜類成分和水溶性的酚酸類成分，中藥的多成分、多功效作用特點(diǎn)，決定著單一成分難以表達(dá)中藥質(zhì)量〔1〕。近年來關(guān)于丹參水溶性成分及脂溶性成分含量測定的報(bào)道較多。但是這種多成分定量方法存在著對照品消耗量大，而且操作復(fù)雜、繁瑣的缺陷。對照品供應(yīng)短缺限制了這些方法在科研、實(shí)際生產(chǎn)、市場監(jiān)督中的應(yīng)用?！耙粶y多評(píng)”方法的出現(xiàn)，在一定程度上解決了之前所遇到的難題。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用此方法展開丹參多指標(biāo)多類成分質(zhì)量控制的研究設(shè)想。即只測定其中1個(gè)脂溶性成分“丹參酮ⅡA”，通過建立該成分與其他成分的校正因子，同時(shí)計(jì)算3個(gè)脂溶性與3個(gè)水溶性成分的含量〔2～5〕。

1儀器與試劑

超高效液相色譜系統(tǒng)：Agilent 1290美國安捷倫科技公司〔配置高性能自動(dòng)進(jìn)樣器(G4226A)，二元泵(G4220A)，柱溫箱(G1316C)，可變波長檢測器(DAD G4212A)，Agilent ChemStationB.04.03版色譜工作站〕；BRANSON B3500S-DTH超聲波清洗儀，荷蘭必能信有限公司；Sartorius CP124S電子天平，北京賽多利斯有限公司；電子天平：Sartorius BT25S 北京賽多利斯有限公司。乙腈，磷酸為色譜純；丹參藥材購買于山東平邑；迷迭香酸對照品，紫草酸對照品購買于上海友思生物技術(shù)公司；丹酚酸B對照品：上海詩丹德生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：STA-00511002)；丹參酮ⅡA對照品(批號(hào)：110766-200619)，隱丹參酮對照品(批號(hào)：110852-200806)，丹參酮Ⅰ對照品(批號(hào)：110867-200406)，均購買于中國藥品生物制品檢定所，超純水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX Extend C18(2.1×100 mm，1.8 μm)；Agilent 1290 online-filter。流動(dòng)相：乙腈(A)-0.05%磷酸(v/v)(B)；流速：0.4 ml/min；檢測波長：270 nm(4 nm)(參比波長:無)；進(jìn)樣體積：2 μl；柱溫：25℃；采樣頻率：40 Hz。上述色譜條件下,各組分分離度良好,見表1，圖1。

表1梯度程序

時(shí)間(min)A(%)B(%)洗脫0~516~2784~73線性梯度5~627~6073~40線性梯度6~1260~6240~38線性梯度12~1562~7038~30線性梯度

1：迷迭香酸;2：紫草酸;3：丹酚酸B;4：隱丹參酮;5：丹參酮I;6：丹參酮ⅡA;7：未知峰 (1～6為所測成分)圖1　丹參樣品色譜圖

2.2檢測波長的選擇丹酚酸B與丹參酮ⅡA含量較高，且含量穩(wěn)定，都可作為一測多評(píng)方法的對照品。但考慮到丹酚酸B對照品價(jià)格昂貴，且熱穩(wěn)定性差，所以選取價(jià)格低廉，且穩(wěn)定性好，色譜峰左右均無雜質(zhì)峰的丹參酮ⅡA作為一測對照品，選取丹參酮ⅡA的最大吸收波長270 nm作為檢測波長。

2.3對照品溶液的制備對照品貯備液的配制：精密稱取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ對照品及丹參酮ⅡA對照品適量，精密稱定，置10 ml棕色量瓶中，加甲醇制成每1 ml含迷迭香酸0.038 5 mg，含紫草酸0.076 0 mg，含丹酚酸B 0.903 0 mg，含隱丹參酮0.042 5 mg，丹參酮Ⅰ0.019 6 mg，丹參酮ⅡA 0.053 9 mg的溶液，即得。

2.4供試品溶液的制備取本品粉末(過五號(hào)篩)約0.15 g，精密稱定，置50 ml離心管中，精密加入甲醇15 ml，搖勻，超聲10 min，4 000 r/min離心5 min，傾出上清液至50 ml量瓶，藥渣繼續(xù)加入甲醇10 m，搖勻，超聲10 min，4 000 r/min離心5 min，傾出上清液至同一50 ml量瓶，重復(fù)提取3次；加甲醇溶液至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，棄去2 ml初濾液，即得。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1線性及線性范圍對照品溶液的制備：精密量取0.05、 0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml對照品貯備液，置于5 ml量瓶中，加甲醇溶劑稀釋至刻度。分別精密吸取各對照品溶液各2 μl，注入超高效液相色譜儀，按確立的色譜條件進(jìn)行測定，記錄各峰峰面積。以對照品濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，以最小二乘法進(jìn)行線性回歸。見表2。

表25個(gè)指標(biāo)成分的線性及線性范圍

名稱R線性范圍(μg)殘差平方和F(校正因子)迷迭香酸0.99990.00770~0.03851.3725.64紫草酸0.99990.00152~0.07602.8317.44丹酚酸B0.99990.0181~0.903560.2626.93隱丹參酮0.99990.000849~0.042529.6831.15丹參酮Ⅰ0.99990.000391~0.01964.8701.43丹參酮ⅡA1.00000.00108~0.053930.5651.00

2.5.2精密度實(shí)驗(yàn)按供試品溶液制備方法，每天制備3份供試品溶液，連續(xù)分析3 d，得出迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA的日間精密度RSD為1.02%、0.87%、0.85%、0.89%、0.98%和0.75%，且外標(biāo)法與一測多評(píng)法的重復(fù)性精密度RSD一致，表明儀器精密度良好。

按供試品溶液制備方法，分別采用不同安捷倫超高效液相色譜系統(tǒng)，每個(gè)條件分析3份供試品溶液，得出迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA的日間精密度RSD為1.02%、0.87%、0.85%、0.89%、0.98%和0.75%，且外標(biāo)法與一測多評(píng)法的重復(fù)性精密度RSD一致，表明儀器精密度良好。

2.5.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)供試品溶液在室溫條件下放置 0、4、8、12、24 h后，迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA的峰面積的RSD分別為1.32%、0.60%、0.62%、1.71%、1.14%和0.73%，表明處理后的樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4重復(fù)性試驗(yàn)采用3個(gè)不同濃度(高、中、低)，每個(gè)濃度各分別制備3份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定，得出迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA重復(fù)性的平均RSD分別為1.44%、0.59%、0.62%、0.87%、0.72%和0.65%，且外標(biāo)法與一測多評(píng)法的重復(fù)性RSD一致，表明該方法的重復(fù)性好。

2.5.5加樣回收率按供試品溶液制備方法，制備9份供試品。稱取0.075 g丹參粉末，精密稱定，置50 ml具塞錐形瓶中，分別稱取2.26、4.52、6.78 mg丹酚酸B相當(dāng)于供試品溶液中丹酚酸B含量的50%、100%、150%，分別精密加入相當(dāng)于供試品溶液中迷迭香酸、紫草酸、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮ⅡA含量50%、100%和150%相應(yīng)的混合對照品溶液15 ml，按供試品溶液制備方法制備，每個(gè)濃度制備3份，共9份供試品溶液。分別吸取2 μl注入超高效液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量。見表3。

表3加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

名稱水平外標(biāo)法(%)一測多評(píng)(%)RSD(%)迷迭香酸低97.5695.991.42中97.3196.271.41高99.0598.180.59紫草酸低99.50100.621.24中100.29101.050.68高100.90101.530.14丹酚酸B低99.2695.280.23中100.7198.110.98高101.9199.710.79隱丹參酮低98.9198.381.49中101.36101.000.67高100.87100.570.61丹參酮Ⅰ低89.2157.180.91中83.1763.171.08高85.0368.720.50丹參酮ⅡA低96.9596.951.20中100.93100.930.46高100.75100.750.53

2.5.6校正因子計(jì)算采用獨(dú)立一次配制的8個(gè)系列混合對照品溶液的峰面積和相應(yīng)濃度計(jì)算一測多評(píng)法中的校正因子，采用丹參酮ⅡA作為一測對照品(SSDMC)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中算得各對照品溶液斜率，校正因子通過斜率值算出，公式如下：Fi=SlopeⅡA/Slopei,Fi：校正因子(迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ)，SlopeⅡA：斜率值(丹參酮IIA-SSDMC)。Slopei：斜率值(迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ)。

2.6丹參含量測定見表4。

表4藥材含量測定試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

名稱外標(biāo)法水平稱樣量(g)含量(%)RSD(%)一測多評(píng)法水平稱樣量(g)含量(%)RSD(%)迷迭香酸低0.07530.2661.52低0.07530.2681.52中0.14990.2590.80中0.14990.2610.80高0.22450.2571.99高0.22450.2591.99平均值0.14990.2611.44平均值0.14990.2631.44紫草酸低0.07530.4630.25低0.07530.4700.25中0.14990.4600.06中0.14990.4670.06高0.22450.4551.46高0.22450.4631.46

續(xù)表4藥材含量測定試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

名稱外標(biāo)法水平稱樣量(g)含量(%)RSD(%)一測多評(píng)法水平稱樣量(g)含量(%)RSD(%)平均值0.14990.4590.59平均值0.14990.4670.59丹酚酸B低0.07536.0900.31低0.07536.0220.31中0.14996.0200.17中0.14995.9540.17高0.22455.9681.40高0.22455.9021.40平均值0.14996.0260.62平均值0.14995.9600.62隱丹參酮低0.07530.2530.60低0.07530.2550.60中0.14990.2550.82中0.14990.2570.82高0.22450.2551.20高0.22450.2561.20平均值0.14990.2540.87平均值0.14990.2560.87丹參酮Ⅰ低0.07530.1250.63低0.07530.1140.63中0.14990.1330.40中0.14990.1210.40高0.22450.1371.14高0.22450.1251.14平均值0.14990.1320.72平均值0.14990.1200.72丹參酮ⅡA低0.07530.3290.53低0.07530.3290.53中0.14990.3320.35中0.14990.3320.35高0.22450.3321.09高0.22450.3321.09平均值0.14990.3310.65平均值0.14990.3310.65總含量低0.07537.5260.28低0.07537.4590.28中0.14997.4590.18中0.14997.3920.18高0.22457.4041.39高0.22457.3371.39平均值0.14997.4630.62平均值0.14997.3960.62

3討論

有研究者對試驗(yàn)條件分別進(jìn)行了考察：丹參酮Ⅰ對照品很難溶解于甲醇水溶液中，所以為后期實(shí)驗(yàn)考慮，采用甲醇作為提取溶劑；丹酚酸B成分在高溫下不穩(wěn)定，會(huì)產(chǎn)生一定程度的降解，所以選擇超聲提取法為供試品提取方法；在此基礎(chǔ)上分別考察了提取溶劑體積，提取次數(shù)以及提取時(shí)間；流動(dòng)相酸度流動(dòng)相酸度可以在0.04%～0.06%調(diào)節(jié)，系統(tǒng)適用性參數(shù)受流動(dòng)相酸度影響很小；降低流動(dòng)相中乙腈比例，可以改善部分分離度。酚酸類成分在調(diào)整乙腈比例時(shí)，相對保留時(shí)間波動(dòng)較大〔6～8〕超過2.0%；但含量合計(jì)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0%，因此建議流動(dòng)相中乙腈比例不宜變動(dòng)過大；檢測波長變動(dòng)對相對保留時(shí)間，系統(tǒng)適用性參數(shù)影響很??；對一測多評(píng)含量影響較大。因此一測多評(píng)法中，應(yīng)嚴(yán)格控制檢測波長為270 nm；流速對含量影響較小，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0%。對系統(tǒng)適用性參數(shù)，降低與升高流速可以提高理論板數(shù)。流速對相對保留時(shí)間影響較大，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差超過2.0%。因此一測多評(píng)法中，應(yīng)當(dāng)控制流速；柱溫對相對保留時(shí)間有較大影響，RSD較大；對含量無影響，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0%。

對于一測多評(píng)法，檢測波長，流動(dòng)相比例，柱溫和流速應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定一致。流動(dòng)相酸度，進(jìn)樣體積、梯度時(shí)間可以適當(dāng)調(diào)整，以改善系統(tǒng)適用性參數(shù)〔9〕。

基于耐用性結(jié)果：系統(tǒng)適用性參數(shù)應(yīng)確定為重復(fù)進(jìn)樣的RSD小于2.0%；迷迭香酸與紫草酸，隱丹參酮與其前一個(gè)雜質(zhì)峰，隱丹參酮與丹參酮Ⅰ的分離度不小于1.5；對稱因子大于0.5，小于1.5；丹參酮ⅡA理論板數(shù)應(yīng)大于70 000。

將“一測多評(píng)”法用于含迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA成分的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)，通過大量的實(shí)驗(yàn)建立了6種指標(biāo)性成分間的相對校正因子，對“一測多評(píng)”法的藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方式進(jìn)行了探索性研究，結(jié)果證明采用“一測多評(píng)”法建立主要成分之間的相對校正因子對藥材質(zhì)量進(jìn)行準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的控制是可行的。

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〔2015-02-11修回〕

(編輯曲莉)

通訊作者：貢濟(jì)宇(1960-)，女，教授，主要從事藥物分析研究。

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20130727020YY)

中圖分類號(hào)〔〕R917〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-7015-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.022