支氣管哮喘大鼠肺組織中Wnt5a/JNK 信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)

張曉霞　許　濤

(武漢市普愛(ài)醫(yī)院，湖北　武漢　430030)

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支氣管哮喘大鼠肺組織中Wnt5a/JNK 信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)

張曉霞許濤

(武漢市普愛(ài)醫(yī)院，湖北武漢430030)

摘要〔〕目的對(duì)支氣管哮喘大鼠肺組織 Wnt5a/JNK 信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)進(jìn)行研究。方法將36只健康清潔級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，每組18只，模型組制備大鼠哮喘模型，采用HE染色法觀察兩組氣道病理生理變化，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR對(duì)兩組肺組織及血液中 Wnt5a mRNA的表達(dá)進(jìn)行研究，通過(guò)Western印跡法對(duì)肺組織中磷酸化的 c-Jun和c-JunN 端激酶蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果在激發(fā)后，模型組出現(xiàn)呼吸困難、大小便失禁、皮膚發(fā)紺等癥狀；隨著激發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組大鼠無(wú)明顯異常。大體觀察，模型組雙肺增大明顯，肺組織表明出現(xiàn)形狀不規(guī)則的充血區(qū)；對(duì)照組肺組織呈現(xiàn)正常的粉紅色，無(wú)明顯出血點(diǎn)；光鏡下發(fā)現(xiàn)模型組支氣管呈管腔狹窄，黏膜皺褶較多，呈增厚狀態(tài)，氣管及血管可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道壁增厚，說(shuō)明哮喘模型造模成功；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Wnt5a的融解曲線(xiàn)呈現(xiàn)單峰狀態(tài)，而在擴(kuò)增曲線(xiàn)中顯示Ct的間隔值相對(duì)較均勻，說(shuō)明Wnt5a熒光定量PCR檢測(cè)擴(kuò)增曲線(xiàn)相對(duì)比較特異，相對(duì)比較理想。與對(duì)照組相比，模型組肺組織及外周血單核細(xì)胞中Wnt5a mRNA的表達(dá)量均增加明顯(P<0.05)；模型組p-JNK、p-c-Jun 蛋白的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論Wnt5a /JNK 信號(hào)通路的相關(guān)分子在哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明Wnt5a /JNK 信號(hào)通路在哮喘的發(fā)生過(guò)程中可能被激活。

關(guān)鍵詞〔〕哮喘；Wnt5a/JNK信號(hào)通路

第一作者：張曉霞(1984-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事呼吸病學(xué)研究。

支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥，主要特點(diǎn)是氣道高反應(yīng)性、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及氣道重塑〔1〕。Wnt 家族是一類(lèi)分泌性糖蛋白，具有高度保守的特點(diǎn)，Wnt 信號(hào)通路具有在進(jìn)化上高度保守、生物效應(yīng)較為廣泛的特點(diǎn)，主要通過(guò)與多細(xì)胞動(dòng)物的不同受體結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用〔2〕。有學(xué)者〔3〕通過(guò)基因分析的方式對(duì)Wnt 通路與哮喘的相關(guān)性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，哮喘是由多種炎癥因子和細(xì)胞參與的，以氣道高反應(yīng)和重建為特點(diǎn)的慢性炎癥性疾病，信號(hào)通路在哮喘的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。有學(xué)者〔4〕研究顯示激活的Wnt5a/c-JunN 端激酶(JNK)信號(hào)通路能夠?qū)е轮袠猩窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥反應(yīng)，哮喘本身也是一種慢性氣道炎癥，本研究觀察Wnt5a/JNK 信號(hào)通路相關(guān)分子在哮喘SD大鼠中的表達(dá)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物與試劑健康清潔級(jí)SD大鼠36只，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，飼養(yǎng)環(huán)境室溫恒定，保持濕度55%～60%，光照12 h/d，體重250～300 g，隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，每組18只。RNA提取試劑盒、卵白蛋白(OVA)特殊飼料、氫氧化鋁凝膠購(gòu)自Sigma公司，兔抗大鼠磷酸化的JNK(p-JNK)抗體、兔抗大鼠磷酸化的c-Jun(p-c-Jun)抗體由Cell Signaling 公司生產(chǎn)。

1.2制備SD大鼠哮喘模型〔5〕將氫氧化鋁凝膠、OVA特殊飼料及生理鹽水按照比例1 g∶1 g∶1 ml的比例調(diào)制哮喘致敏液，并充分混勻。將混合液皮下注射至SD大鼠的腹部、雙側(cè)腹股溝、腹腔及前足跖部位，注射時(shí)間為第1、8天，每個(gè)部位注射0.2 ml，第15天配制霧化吸入液(OVA用生理鹽水稀釋?zhuān)瑵舛葹?0 g/L)，在密閉的有機(jī)玻璃容器中，通過(guò)空氣壓縮霧化器給予霧化吸入激發(fā)，每天霧化激發(fā)1次，每次30 min，連續(xù)激發(fā)7 d。對(duì)照組在相同時(shí)間和條件下，給予高壓滅菌生理鹽水代替致敏液和激發(fā)液進(jìn)行致敏和激發(fā)過(guò)程。

1.3分離提取單核細(xì)胞完成致敏和激發(fā)過(guò)程后，將大鼠麻醉，取其腹主動(dòng)脈血5 ml并加入等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)，充分混合均勻，取1支離心管，在離心管中加入5 ml淋巴細(xì)胞分離液，將混合液緩緩倒入裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心20 min(2 000 r/min)，離心后用吸管將白膜層(淋巴細(xì)胞層)移入到新的離心管中，加入PBS液反復(fù)離心、洗滌2遍，所得沉淀即單核細(xì)胞。

1.4肺組織標(biāo)本病理學(xué)觀察打開(kāi)麻醉SD大鼠胸腔，大體觀察肺臟外觀，取適量新鮮肺組織，用生理鹽水漂洗后濾紙吸干，用4%多聚甲醛固定7 d后，脫水、包埋、切片后行HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察肺組織的病理變化。

1.5熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肺組織和單核細(xì)胞Wnt5a mRNA 的表達(dá)①根據(jù)基因庫(kù)提供的已知基因序列，采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)Wnt5a引物，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，由上海英駿生物工程公司合成。見(jiàn)表1。②根據(jù)RT-PCR試劑盒檢測(cè)步驟提取肺組織及外周血總RNA，采用熒光定量?jī)x進(jìn)行擴(kuò)增肺組織及外周血中Wnt5a mRNA，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃退火和延長(zhǎng)5 s，60℃ 20 s，循環(huán)45次。PCR反應(yīng)結(jié)束后，制定最佳閾值線(xiàn)，找出Ct值，設(shè)定正常對(duì)照組基因表達(dá)為1，獲得其他各組 Wnt5a 表達(dá)的相對(duì)值。③采用雙辛丁酸(BCA)法提取SD大鼠肺組織總蛋白，取50 g 蛋白進(jìn)行上樣，電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在脫脂奶粉中室溫條件下封閉2 h，加入兔抗 p-c-Jun抗體(1∶1 000)和兔抗 p-JNK 抗體(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，PBS充分洗滌后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(1∶5 000)，室溫下孵育1 h，辣根過(guò)氧化物酶(DAB)法進(jìn)行顯色，用ImageJ圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度值分析，結(jié)果用檢測(cè)蛋白的吸光度值/內(nèi)參蛋白的吸光度值來(lái)表示表示。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

表1熒光-PCR基因引物序列及產(chǎn)物堿基數(shù)

引物序列產(chǎn)物堿基數(shù)Wnt5a上游5'-CATAGGAGCACAGCCTCTCTG-3'126bp 下游5'-CACTCTTTGATGCCCGTCTT-3'GAPDH上游5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'252bp 下游5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'

2結(jié)果

2.1兩組致敏和激發(fā)后出現(xiàn)的癥狀及病理學(xué)觀察激發(fā)后，模型組出現(xiàn)呼吸困難、大小便失禁、皮膚發(fā)紺等癥狀。隨著激發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組無(wú)明顯異常。模型組雙肺增大明顯，肺組織表明出現(xiàn)形狀不規(guī)則的充血區(qū)；對(duì)照組肺組織呈現(xiàn)正常的粉紅色，無(wú)明顯出血點(diǎn)；光鏡下發(fā)現(xiàn)模型組支氣管呈管腔狹窄，黏膜皺褶較多，呈增厚狀態(tài)，氣管及血管可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道壁增厚，說(shuō)明哮喘模型造模成功。

2.2兩組肺組織及外周血單核細(xì)胞中Wnt5a mRNA的表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Wnt5a的融解曲線(xiàn)呈現(xiàn)單峰狀態(tài)，而在擴(kuò)增曲線(xiàn)中顯示Ct的間隔值相對(duì)較均勻，說(shuō)明Wnt5a熒光定量PCR檢測(cè)擴(kuò)增曲線(xiàn)相對(duì)比較特異，相對(duì)比較理想。與對(duì)照組相比，模型組肺組織及外周血單核細(xì)胞中Wnt5a mRNA的表達(dá)量均增加明顯(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.3兩組肺組織 p-JNK、p-c-Jun 蛋白的表達(dá)模型組p-JNK、p-c-Jun 蛋白的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表3，圖1。

組別肺組織外周血單核細(xì)胞模型組2.55±1.364.52±1.86對(duì)照組1.03±0.730.97±0.46t/P值4.178/0.00067.861/<0.01

組別p-JNKp-c-Jun模型組1.35±0.111.42±0.09對(duì)照組0.81±0.080.78±0.07t/P值15.826/<0.0123.815/<0.01

圖1　兩組肺組織 p-JNK、p-c-Jun 蛋白的表達(dá)

3討論

支氣管哮喘主要的病理生理變化是慢性氣道炎癥，哮喘發(fā)生過(guò)程中肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等細(xì)胞存在于支氣管上皮細(xì)胞損傷和損傷后修復(fù)的病理生理過(guò)程〔6〕。哮喘目前主要的治療方式是以激素治療為主，而采用激素治療容易導(dǎo)致患兒生長(zhǎng)延遲，進(jìn)而影響到患者成年后的身高〔7〕。學(xué)者〔8，9〕研究顯示哮喘患者 Wnt 信號(hào)通路會(huì)明顯發(fā)生變化，表明哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程可能與Wnt 信號(hào)通路有明顯的相關(guān)性。

研究〔10〕顯示在各種炎癥性疾病中如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎中Wnt5a表達(dá)明顯增加，表明Wnt5a在炎性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。有學(xué)者〔11〕研究顯示W(wǎng)nt5a在哮喘小鼠肺組織中異常高表達(dá)。有學(xué)者〔12〕研究顯示W(wǎng)nt5a主要是通過(guò)激活JNK而在Wnt 信號(hào)通路中發(fā)揮作用。JNK是一種蛋白激酶，在傳遞過(guò)程中具有高度保守的特點(diǎn)，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，JNK在細(xì)胞的增殖、分化、生長(zhǎng)及凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，與細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)有明顯的關(guān)系。有學(xué)者通過(guò)加入JNK性抑制劑SP600125 進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)加入后哮喘大鼠肺嗜酸性粒細(xì)胞及IgE 和Th2 型細(xì)胞因子的表達(dá)明顯減少，哮喘大鼠氣道內(nèi)生成的黏液也明顯減少〔13〕，說(shuō)明JNK在哮喘的發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程中起著重要的作用。本研究結(jié)果與學(xué)者〔13〕的研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明支氣管哮喘大鼠肺組織中Wnt5a/JNK 信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)均增加，說(shuō)明哮喘發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Wnt5a/JNK 信號(hào)通路有效地激活。

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〔2014-09-17修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：許濤(1971-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事重癥醫(yī)學(xué)與神經(jīng)科學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：武漢市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目(No.wx14c64)

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R392.3〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-7007-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.018