苯并二氫吡喃衍生物抗去勢雌鼠骨質(zhì)疏松的作用

侯　進　熊曉云　彌　曼　曾菊絨　胥曉麗

(西安醫(yī)學院，陜西　西安　710068)

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苯并二氫吡喃衍生物抗去勢雌鼠骨質(zhì)疏松的作用

侯進熊曉云1彌曼曾菊絨胥曉麗

(西安醫(yī)學院，陜西西安710068)

摘要〔〕目的探討苯并二氫吡喃衍生物替代xy9902對去勢雌鼠骨質(zhì)疏松的治療作用及其機制。方法切除雌性SD大鼠雙側(cè)卵巢，制備大鼠骨質(zhì)疏松模型，用化合物xy9902灌胃給藥，觀察xy9902對去勢雌鼠骨密度的影響；同時檢測大鼠體內(nèi)血清鈣、血清磷及堿性磷酸酶、白細胞介素(IL)-6等生化指標。結(jié)果去勢后大鼠骨密度下降，使用灌胃3個月后，能明顯抑制去勢雌鼠骨密度的下降，對血鈣、血磷沒有明顯影響，降低血中ALP含量，抑制IL-6分泌。結(jié)論化合物xy9902通過與去勢雌鼠體內(nèi)雌激素受體結(jié)合，影響去勢大鼠骨代謝，增強去勢雌鼠骨密度，抗骨質(zhì)疏松。

關(guān)鍵詞〔〕MC3T3-E1細胞；雌激素受體(ER)；增殖；分化

1西安利君制藥有限責任公司

第一作者：侯進(1973-)，女，博士，副教授，主要從事腫瘤藥理學研究。

對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的防治中，雌激素替代療法(ERT)存在對子宮和乳腺嚴重的致癌危險性，限制了其臨床的長期應用〔1,2〕。選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑raloxifene，雖能夠有效地防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，對子宮和乳腺亦無副作用，但存在血栓形成、惡心、潮熱、頭痛、藥疹、腹痛、視力模糊、瘙癢以及乳房腫痛等副作用。豆類膳食中的genistein可預防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生，引起了科學家對植物雌激素的研究興趣。研究表明，genistein對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的治療效果遠遠弱于雌激素和raloxifene，不能滿足用藥需要〔3，4〕。xy9902是以genistein結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，根據(jù)電子等排原理合成的新化合物。初步實驗表明xy9902對成骨細胞有增殖作用，其作用可能與對雌激素受體(ER)的激動作用有關(guān)，提示xy9902可能是治療骨質(zhì)疏松潛在的藥物〔5～7〕。本文探討動物模型中xy9902的抗骨質(zhì)疏松作用。

1材料和方法

1.1材料白細胞介素(IL)-6酶聯(lián)蛋白免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自第四軍醫(yī)大學免疫教研室，ALP試劑盒為南京建成生物科技研究所產(chǎn)品。

1.2動物與分組雌性健康SD大鼠50只，清潔級，體重(180±20)g，由交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(陜)2010-002。將50只大鼠隨機分為五組，假手術(shù)組、模型組、雌激素組、xy9902高、低劑量組，每組10只。假手術(shù)組、模型組均給予蒸餾水10 ml/kg，給藥組分別給予小劑量xy9902 3 mg/kg和大劑量xy9902 7 mg/kg，genistein組給予genistein 6 mg/kg，全部灌胃給藥，1次/d，90 d后取大鼠腰椎和兩側(cè)股骨，摘眼球取血，離心分離血清，取上清液置于-20℃冰箱保存待測。

1.3骨密度(BMD)的測定取大鼠腰椎和兩側(cè)股骨，采用美國Hologic公司的雙能X線骨礦含量測定儀測定腰椎和雙側(cè)股骨頸BMD。

1.4血清堿性磷酸酶(ALP)、鈣(Ca)、磷(P)、IL-6含量測定灌胃90 d后取血查血清Ca、血清P的含量。血清ALP含量用試劑盒測定，Ca、P 含量測定用Olympus AU2800全自動生化分析儀測定，用ELISA檢測IL-6。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS10.0軟件進行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1xy9902對大鼠BMD的影響模型組在切除卵巢后8 w，可見腰椎及股骨的BMD明顯降低，與切除卵巢前BMD相比較差異顯著(P<0.01，P<0.05)。給藥組經(jīng)過藥物治療90 d后，腰椎及股骨的BMD可見明顯升高，與去勢模型組有顯著差異(小劑量組P<0.05，大劑量組P<0.01)。見表1。

部位股骨腰椎假手術(shù)組66.6±15.355.3±14.6模型組46.6±11.22)38.8±13.91)genistein組64.7±16.23)55.6±16.93)小劑量xy9902組65.7±18.33)49.9±10.83)大劑量xy9902組68.1±13.44)56.8±11.34)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

2.2xy9902對大鼠血液生化指標的影響治療90 d后的各組大鼠血清鈣含量及血磷含量組間比較差異均無顯著性(P>0.05)。模型組在切除卵巢后8 w，血中ALP升高，與切除卵巢前相比差異顯著(P<0.01)，xy9902藥物治療90 d后，ALP可見明顯降低，大小劑量xy9902組相對去卵巢大鼠組分別降低ALP53%和42%，與去勢模型組相比有顯著差異(P<0.01)。去卵巢大鼠xy9902組血清IL-6活性明顯升高，與假手術(shù)組相比有顯著差異(P<0.05)，小劑量和大劑量xy9902治療90 d后，血清IL-6明顯降低，與模型組比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)。見表2。

組別Ca(mol/L)P(mol/L)ALP(U/L)IL-6(pg/ml)假手術(shù)組2.6±0.821.7±0.7232.8±12.215.9±5.4模型組2.4±0.251.4±0.3865.1±17.42)26.3±9.851)genistein組2.5±0.481.4±0.3937.8±16.74)17.23±5.43)小劑量xy9902組2.7±0.711.4±0.2237.2±16.814)16.5±5.03)大劑量xy9902組3.1±0.551.5±0.3130.6±13.84)14.3±5.84)

3討論

絕經(jīng)后婦女的卵巢功能衰退，血中雌激素水平降低。SD 雌性大鼠去卵巢后其體內(nèi)雌激素水平明顯下降，術(shù)后8 w大鼠的腰椎和股骨的BMD明顯降低，為研究老年骨質(zhì)疏松提供了較好的動物模型。同時也說明了雌激素水平的降低是骨質(zhì)疏松重要原因之一，補充雌激素是預防治療老年婦女骨質(zhì)疏松的重要手段。

BMD是評價骨強度的指標，是確定骨質(zhì)疏松，預測骨折危險性的重要依據(jù)。BMD測量無創(chuàng)傷，簡單易行。實驗結(jié)果顯示，手術(shù)組大鼠在去卵巢后骨密度均顯著低于正常對照組，表現(xiàn)為骨強度下降。攝取xy9902后的大鼠的BMD比陰性對照組顯著升高，也高于陽性對照組，說明xy9902增加了骨強度，其作用強于genistein。本課題組體外實驗證實xy9902與雌激素受體ER 有較強親和力，能促進小鼠成骨細胞MC3T3-E1增殖及分化，其促增殖及分化作用強于genistein。進一步證實了xy9902促進成骨細胞增殖，增強BMD的作用。

ALP是反映成骨細胞活性增加的重要標志。本實驗中去卵巢大鼠由于體內(nèi)雌激素不足，導致骨吸收強于骨形成，代償性地骨生成增強，導致血中ALP增加，攝取xy9902后，代償性的骨吸收被抑制，降低了骨質(zhì)疏松大鼠血液ALP。證實了xy9902增強成骨細胞活性，具有抗骨質(zhì)疏松作用。

IL-6是一種來源廣泛的多功能細胞因子。婦女絕經(jīng)期雌激素水平下降，促使骨基質(zhì)細胞分泌IL-6增加，IL-6進一步刺激破骨前體細胞分化為成熟的破骨細胞，促進骨吸收。IL-6和雌激素對骨質(zhì)的代謝作用正好相反，雌激素可減少破骨細胞的前體細胞形成，同時可抑制破骨細胞的活性，從而抑制骨質(zhì)的吸收；IL-6可刺激破骨細胞前體細胞的生成和分化，同時可激發(fā)破骨細胞的活性，從而促進骨質(zhì)的吸收。目前，IL-6的水平普遍用于評價藥物對破骨細胞的間接作用。在本實驗中，去卵巢大鼠血清中IL-6含量顯著升高，表明去卵巢后，大鼠破骨細胞活性增強，xy9902明顯抑制IL-6分泌，說明其抑制了破骨細胞的活性。

xy9902能顯著增強去卵巢大鼠BMD，對抗去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松，是一個潛在的抗骨質(zhì)疏松藥物。ER在成骨細胞和破骨細胞上均有分布，結(jié)合前期實驗結(jié)果xy9902 與ER有較強親和力，能夠促進成骨細胞增殖，可確定xy9902的抗去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松是通過結(jié)合ER發(fā)揮作用的〔6，7〕。

參考文獻4

1Brzezinski A，Debi A.Phytoestrogens：the natural selective estrogen receptor modulators〔J〕.Eur J Obst Gynecol Reprod Biol，1999；85：47-51.

2Delmas PD，Bjarnason NH，Mitlak BH,etal.Effects of raloxifene on bone mineral density，serum cholesterol concentrations，and uterine endometrium in postmenopausal women〔J〕.New Engl J Med，1997；337：1641-7.

3Perez P，Pulgar R，Olea-Serrano F,etal.The estrogenicity of bisphenol A-related diphenylalkanes with various substituents at the central carbon and the hydroxy groups〔J〕.Environ Health Perspect，1998；106(3)：298-305.

4Arcaro KF，O′Keefe PW，Yang Y,etal.Antiestrogenicity of environmental polycyclic aromatic hydrocarbons in human breast cancer cells〔J〕.Toxicology，1999；133：115-27.

5熊曉云，陳亞瓊，鄒勇，等.苯并二氫吡喃衍生物抗骨質(zhì)疏松活性的構(gòu)效關(guān)系研究〔J〕.中國藥理學通報，2001；17(5)：518-21.

6侯進，熊曉云，彌曼，等.xy9902對MC3T3-E1細胞的增殖和分化作用〔J〕.中國藥理學通報，2006；22(5)：529-32.

7侯進，熊曉云，彌曼，等.苯并二氫吡喃衍生物xy9902對乳腺癌細胞增殖的影響〔J〕.中國藥理學與治療學，2006；11(5)：565-8.

〔2014-08-11修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：陜西省教育廳專項科研項目(2010JK805)；西安醫(yī)學院博士科研啟動基金(2011DOC04)

中圖分類號〔〕R68〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-6996-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.013