心外膜脂肪細胞核因子-κB信號途徑抑制在抗動脈粥樣硬化中的作用

邢　杰

(海南省人民醫(yī)院心臟外科，海南　海口　570311)

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心外膜脂肪細胞核因子-κB信號途徑抑制在抗動脈粥樣硬化中的作用

邢杰

(海南省人民醫(yī)院心臟外科，海南?？?70311)

摘要〔〕目的研究心外膜脂肪細胞核因子(NF)-κB信號途徑抑制在抗動脈粥樣硬化中的作用。方法建立泡沫細胞模型，分為空白組，轉染試劑組，siRNA干擾組，高脂組，高脂+SRT1720組，高脂+SRT1720+siRNA干擾組。采用油紅O染色判斷模型的建立，采用Western印跡方法進行蛋白表達的分析。結果建立模型成功；與高脂組比較，高脂+SRT1720組SIRT1蛋白表達量升高顯著，NF-κB及其下游靶分子腫瘤壞死因子(TNF)-α蛋白表達量下降顯著(P<0.05)。與高脂+SRT1720組比較，高脂+SRT1720+siRNA干擾組SIRT 1蛋白表達量下降顯著，NF-κB及其下游靶分子TNF-α蛋白表達量升高顯著(均P<0.05)。結論泡沫細胞中SIRT1 是 NF-κB信號通路的上游，通過抑制心外膜脂肪組織NF-κB炎癥信號途徑，參與調節(jié)泡沫細胞從動脈粥樣硬化斑塊中移出，可為防治冠狀動脈粥樣硬化的治療提供新的手段。

關鍵詞〔〕NF-κB信號途徑；心外膜脂肪細胞；抗動脈粥樣硬化；沉默信息調節(jié)因子(SIRT)1

第一作者：邢杰(1965-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事先天性心臟病、心臟瓣膜病，冠心病及大血管病研究。

心外膜脂肪一般來講是指在心外膜及心肌外表面間的脂肪組織，在人類的心臟外膜覆蓋。與其他白色脂肪組織不一樣，心外膜脂肪組織的生理功能多樣，作為多種炎性介質的來源，其不僅能夠作為脂質的儲存庫，還發(fā)揮內分泌的作用，通過分泌趨化因子、細胞因子、激素等來維持機體的正常功能〔1,2〕。動脈粥樣硬化(AS)是一個炎癥反應性的慢性病程，患者血管中的單核細胞在各種黏附分子的作用下附著在血管內壁，使得單核細胞趨化因子(MCP)-1與其受體2相結合，加速單核細胞轉化為巨噬細胞的速度，最終導致巨噬細胞過多地集聚在動脈粥樣斑塊的中心，并發(fā)展為凋亡而引發(fā)壞死脂核〔3,4〕。冠狀動脈粥樣硬化患者心外膜脂肪致炎因子分泌水平升高，抗炎因子分泌水平降低，過多分泌的致炎因子利用內分泌、旁分泌通路來作用于心肌及冠狀動脈，加速冠狀動脈病變的形成及發(fā)展〔5〕。因此從炎癥信號途徑出發(fā)，探討通過調控心外膜脂肪的炎癥來防治冠狀動脈粥樣硬化意義重大。本研究探討心外膜脂肪細胞核因子(NF)-κB信號途徑抑制在抗AS中的作用。

1資料與方法

1.1儀器與試劑熒光顯微鏡(北京中儀光科科技發(fā)展有限公司)、全自動生化分析儀(日本OLYMPUS)。人單核細胞株U937購自美國Sciencell，沉默信息調節(jié)因子(SIRT)1激動劑、RPMI1640細胞培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國GIBCO公司。 NF-κB，腫瘤壞死因子(TNF)-α購自美國Santa Cruz公司。

1.2建立泡沫細胞模型 在含有10%胎牛血清的高糖(約5.0 g/L) RPMI1640培養(yǎng)基中對人單核細胞系U937細胞進行培養(yǎng)，于5%CO2、37℃條件下的培養(yǎng)箱中放置12 h，加入鏈霉素(100 U/ml)和青霉素(100 mg/ml)，孵育12 h，進行巨噬細胞的誘導分化。另取對數生長期細胞，調整濃度至1×106個/ml，接種于6孔板上，每孔約1.5 ml，加終濃度為0.2 mmol/L的軟脂酸鈉、終濃度為0.08 g/L的ox-LDL，共同孵育24 h，建立誘導的泡沫細胞模型。

1.3實驗分組分為空白組，轉染試劑組，siRNA干擾組，高脂組，高脂+SRT1720組，高脂+SRT1720+siRNA干擾組?？瞻捉M細胞干預為于含高糖(約5.0 g/L) RPMI1640培養(yǎng)基中進行常規(guī)培養(yǎng)；轉染試劑組是在空白組+5 μl的轉染試劑；干擾組為轉染試劑組+6 μmol/L的SIRT1干擾siRNA；高脂組為空白組+0.2 mmol/L的軟脂酸鈉+0.08 g/L的ox-LDL；高脂+SRT1720組為高脂組+5 μmol/L的SIRT1激動劑SRT1720；高脂+SRT1720+干擾組為高脂+SRT1720+6 μmol/L的SIRT1干擾siRNA。siRNA干擾操作過程參考說明書。

1.4油紅O染色參照“1.2.1”中操作步驟，在細胞誘導為巨噬細胞的基礎上進行細胞玻片制片，采用4%的多聚甲醛固定，行油紅O染色。

1.5Western印跡分析蛋白表達采用4℃磷酸鹽緩沖液洗細胞兩次，1 min/次，加入放射免疫沉淀法(RIPA)細胞裂解液后，刮取相應細胞進行冰上裂解，約半小時后震蕩，每5 min進行1次，后給予針頭抽吸，每次1 ml左右，重復10次，4℃下12 000 r/min離心，離心30 min，吸上清液，采用二辛可寧酸(BCA)法測蛋白的濃度。并給予十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳試驗，10%脫脂牛奶封閉60 min，抗體SIRT1以1∶500、NF-κB以1∶1 000、TNF-α以1∶500的比例在Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween(TBST)中進行稀釋，4℃下孕育24 h，TBST洗滌，共計3次，每次15 min；二抗以1∶5 000的比例，室溫下放置1 h，TBST洗滌，共計3次，每次15 min。電化學發(fā)光(ECL)液發(fā)光，暗室中曝光，X線顯影，采用Quantity One圖像分析系統進行分析。

1.6統計學方法采用SPSS20.0統計軟件進行t、χ2檢驗。

2結果

2.1U937巨噬細胞源性泡沫細胞模型的建立采用 PMA誘導U937單核細胞，24 h后發(fā)現，誘導下的細胞形態(tài)出現明顯變化，大部分細胞呈梭形并緊貼壁生長，部分分化良好者出現偽足，此時提示單核細胞已分化為巨噬細胞，見圖1。另在顯微鏡下觀察，由于軟脂酸鈉及ox-LDL的作用，大部分細胞的細胞質內出現明顯的紅色脂質顆粒，與既定的泡沫細胞形態(tài)特點較為一致，見圖2，提示建立模型成功。

2.2干擾siRNA對SIRT1的表達影響Western印跡檢測表明，siRNA可明顯降低SIRT1蛋白的表達水平，見圖3。

2.3泡沫細胞模型中NF-κB信號途徑及相關因子的Western印跡結果與高脂組比較，高脂+SRT1720組SIRT1蛋白表達量升高顯著，NF-κB及其下游靶分子TNF-α蛋白表達量下降顯著(均P<0.05 )。與高脂+SRT1720組比較，高脂+SRT1720+siRNA干擾組SIRT 1蛋白表達量下降顯著，NF-κB及其下游靶分子TNF-α蛋白表達量升高顯著(均P<0.05 )。見圖4。

圖1　巨噬細胞(×200)

圖2　泡沫細胞(箭頭處為典型改變，×200)

圖3　干擾siRNA對SIRT1的表達影響

圖4　泡沫細胞模型中NF-κB信號途徑及相關因子的Western印跡結果

3討論

AS是在遺傳、環(huán)境等多種因素共同作用下所出現的一種慢性炎癥反應性疾病，其發(fā)生的具體機制尚無統一的定論，多數觀點認為其發(fā)生發(fā)展與內皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞、泡沫細胞及炎癥反應的關系較為密切〔6,7〕。相關文獻報道指出，內臟脂肪組織的功能不單局限于儲存能量，還能夠發(fā)揮內分泌的作用，通過分泌多種脂肪細胞因子來參與并促進AS發(fā)生及發(fā)展〔8〕。心外膜脂肪作為一個具有免疫活性的器官，參與冠脈周圍炎癥的發(fā)生。作為內臟脂肪組織的一部分，心外膜脂肪組織鄰近冠脈，屬于棕色脂肪的一部分，通過自身分解為游離脂肪酸為心臟供能，調節(jié)心臟溫度，保護心臟自主神經起保護作用〔9,10〕。

Motoyama等〔11〕通過比較冠狀動脈疾病(CAD)和非CAD(NCAD)患者的心外膜脂肪與腿部脂肪組織，證實了在CAD患者的心外膜脂肪中 NF-κB、TNF-α的表達明顯升高 。Hung等〔12〕，心外膜脂肪中的炎性反應在很大程度上是通過脂多糖(LPS)與巨噬細胞表面的Toll樣受體(TLR)-2或 4結合，利用NF-κB和JNK信號傳導通路來參與AS過程。NF-κB 作為機體較為重要的一種核轉錄因子，其能夠與κB位點的基因啟動子特異性結合，加速基因啟動子的轉錄表達，通過誘導其活化，來達到調控轉錄因子、炎癥細胞因子、黏附因子的目的，參與炎性反應〔13〕。目前關于NF-κB 作為多種疾病治療的分子靶點已引起學術界的廣泛關注〔14,15〕。AS過程的產生也是炎癥反應發(fā)生的過程，本研究結果表明，在泡沫模型細胞中 NF-κB炎癥信號通路受到SIRT1的調控，SIRT1是 NF-κB信號的上游，推測，SIRT1可能通過脫乙?；疦F-κB來降低或阻止其促炎癥反應信號的傳導，來緩解AS斑塊形成或促進其消退。既有文獻〔15〕報道，在內皮細胞中SIRT1能夠利用對NF-κB信號通路的關鍵步驟的干擾來實現抗炎癥反應過程。動物試驗也顯示，敲除NF-κB的亞基P50可以明顯縮小其斑塊，且降低斑塊內的泡沫細胞〔16〕。本研究結果提示機體通過調控NF-κB信號通路的活性，泡沫細胞中的炎癥信號受到調節(jié)，進而影響AS斑塊的形成及消退 。

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〔2014-12-19修回〕

(編輯苑云杰)

基金項目：海南省應用技術研發(fā)與示范推廣專項項目(No.ZDXM2015074)

中圖分類號〔〕R446.1〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-6981-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.007