右歸丸對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因甲基化的影響

楊　鋒　潘　樂(lè)　馬秋濤　張　濤　楊利學(xué)　李彥民

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，陜西　咸陽(yáng)　712083)

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右歸丸對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因甲基化的影響

楊鋒潘樂(lè)馬秋濤張濤楊利學(xué)李彥民

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，陜西咸陽(yáng)712083)

摘要〔〕目的探討右歸丸含藥血清對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因表達(dá)及其甲基化影響。方法制備右歸丸含藥血清備用。無(wú)菌條件下，取SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，貼壁法培養(yǎng)，傳代。第二代貼壁細(xì)胞分組：(1)對(duì)照組：用含10%鹽水的DMEM培養(yǎng)；(2)成脂誘導(dǎo)組：用成脂誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3)右歸丸組：10%右歸丸含藥血清加成脂誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基；分別干預(yù)3 d后用RT-PCR及甲基化特異性PCR法檢測(cè)PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)和甲基化狀態(tài)。結(jié)果右歸丸組PPARγ和C/EBPα的表達(dá)明顯低于其他各組(P<0.05)。右歸丸組PPARγ和C/EBPα甲基化上調(diào)，組間比較差異顯著(P<0.05)。結(jié)論右歸丸含藥血清可通過(guò)去甲基化的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。

關(guān)鍵詞〔〕補(bǔ)腎藥；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成脂分化；甲基化

第一作者：楊鋒(1977-)，男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治骨與關(guān)節(jié)退行性疾病研究。

DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳修飾途徑之一，可造成基因的失活。表觀遺傳修飾是在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，通過(guò)甲基化、乙酰化等手段最終導(dǎo)致可遺傳的表型變化〔1〕。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)中DNA序列沒(méi)有改變，但是可以分化成不同功能的細(xì)胞。表觀遺傳調(diào)控BMSCs分化已經(jīng)成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿領(lǐng)域〔2，3〕。本文通過(guò)研究補(bǔ)腎名方右歸丸對(duì)BMSCs成脂分化相關(guān)基因甲基化的影響，旨在一定程度上闡明中醫(yī)“腎主骨、生髓”理論的科學(xué)內(nèi)涵。

1材料與方法

1.1動(dòng)物、儀器及試劑選4周齡SD大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量(180±20)g，雌雄各半，飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)室，實(shí)驗(yàn)大鼠均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus)，AE21倒置顯微鏡(Olympus)，流式細(xì)胞儀(Bechman Epicx)，熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI 7300)，紫外分光光度儀UV-2300，臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf)，基因組DNA抽提試劑盒(QIAGEN)，甲基化修飾試劑盒(QIAGEN)，PCR試劑盒(上海捷蘭)，隨機(jī)引物(華大基因)。

1.2方法

1.2.1中藥含藥血清的制備右歸丸處方組成：熟地24 g、山萸肉9 g、枸杞子9 g、當(dāng)歸9 g、菟絲子12 g、鹿角膠12 g、山藥12 g、杜仲12 g、附子6 g、肉桂6 g。分別加水煎制，并根據(jù)“人與動(dòng)物體表面積折算等效劑量比率表”計(jì)算臨床等效劑量，2次/d，灌胃給藥，1 ml/次，連續(xù)灌胃3 d，第3天下午灌胃后1 h，給予大鼠麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血、1 500 r/min 10 min離心后抽濾、56℃滅活、-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組對(duì)照組：L-DMEM，10%胎牛血清，1%青、鏈霉素。成脂誘導(dǎo)組：L-DMEM，20%空白血清，1%青、鏈霉素，成脂誘導(dǎo)劑(10～6 mol/L地塞米松，0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，100 μmol/L吲哚美辛，胰島素10 mg/L)。右歸丸組：成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液加10%右歸丸含藥血清。

1.2.3BMSCs的分離、培養(yǎng)SD大鼠經(jīng)腹腔氯胺酮麻醉后處死，75%酒精浸泡5 min，無(wú)菌條件下取出雙側(cè)股骨和脛骨，咬骨鉗修剪骨端，暴露髓腔，5 ml注射器吸取含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗髓腔，直到骨質(zhì)外觀微微透亮。10 cm培養(yǎng)皿收集骨髓沖洗液，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。每3 d換液1次。第4 代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示細(xì)胞均一性較好，其中CD34、CD45表達(dá)呈陰性，而CD90 、CD105 表達(dá)呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率分別為93.136%和93.182%，提示培養(yǎng)所得細(xì)胞為主要是BMSCs，非造血性細(xì)胞。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板作有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，以備實(shí)驗(yàn)之用。

1.2.4RT-PCR 檢測(cè)成脂及成脂相關(guān)基因表達(dá)誘導(dǎo)分化第14天，按照試劑盒說(shuō)明提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PPARγ、C/EBPα的mRNA表達(dá)。各基因引物序列：GAPDH正義：5′-AATGATCCGTTGTGGATCTGA-3′，反義：5′-CCTGCTTCACCACCTTCT-3′；PPARγ正義：5′-CCAGAAAG CGATTCCTTCAC-3′，反義：5′-CACGTTAGTTTCACCTCGGA-3′；C/EBPα正義：5′-AAGAAGTCGGTGGACAAGAACAG-3′，反義：5′-TGCGCACCGCGATGT-3′。按RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)操作。反應(yīng)條件：(1)37℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；(2)94℃滅活RNA酶2 min；(3)94℃解鏈30 s；(4)55℃退火30 s；(5)72℃延伸45 s；(6)第(3)～(5)步再重復(fù)30次；(7)72℃延伸7 min。

1.2.5甲基化特異性 PCR(MSP)法檢測(cè)相關(guān)基因甲基化狀態(tài)按照試劑盒說(shuō)明提取各組細(xì)胞DNA，加入亞硫酸鹽混合液修飾，純化，PCR反應(yīng)。甲基化引物由Methyl Primer Express v1.0設(shè)計(jì)，由華大基因合成，引物序列：PPARγ-甲基化(M)正義：TTGGAAAGTCGTATTTTGATAGGAC，反義：CGAACCAAATTACTTAAACGATCAC；PPARγ-非甲基化(NM)正義：GGTTGGAAAGTTGTATTTTGATAGGAT，反義：CAAACCAAATTACTTAAACAATCACCA；C/EBPα-M正義：TTAAAGGAGGGGCGTTTAATTAC，反義：CCACTAACTCCTACGCTACTAAACG；C/EBPα-NM

正義：TTTAAAGGAGGGGTGTTTAATTAT，反義：CCCACTAACTCCTACACTACTAAACA。PCR產(chǎn)物電泳條件：TBE緩沖液，1.2%的瓊脂糖，電壓180 V，電泳時(shí)間50 min。用天能GIS1600凝膠成像系統(tǒng)分析凈光密度，求甲基化率〔M光密度/(M光密度+NM光密度)〕。

1.3統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料用單因素方差分析或非參數(shù)方法檢驗(yàn)。兩樣本率的比較用χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，右歸丸組的PPARγ和C/EBPα表達(dá)明顯高于其他各組(P<0.05)。干預(yù)14d后，甲基化電泳顯示，右歸丸組甲基化率低于其他各組(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1，圖2。

組別基因表達(dá)PPARγC/EBPα基因甲基化率PPARγC/EBPα對(duì)照組1.00±0.451.00±0.5518.6610.97成脂誘導(dǎo)組0.92±0.272.80±0.2125.0917.09右歸丸組0.56±0.231)0.63±0.361)34.501)18.661)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

圖1　PPARγ甲基化電泳圖

圖2　C/EBPα甲基化電泳圖

3討論

“腎主骨”、“腎生骨髓”見(jiàn)于《素問(wèn)·宣明五氣篇》。其病理、生理含義為：腎中精氣充盈，則骨髓生化有源，骨才能得到骨髓更好的滋養(yǎng)，骨骼才會(huì)強(qiáng)健有力。腎氣衰微，腎精虛少，骨髓化生乏源，不能營(yíng)養(yǎng)骨骼，則骨髓空虛，發(fā)為骨痿。骨質(zhì)疏松屬于骨痿范疇。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示〔4,5〕，骨質(zhì)疏松患者BMSCs的成骨分化能力明顯下調(diào)，成脂分化方向的能力明顯增強(qiáng)。BMSCs分化失衡，偏向成脂方向分化，所以產(chǎn)生了骨形成的減少與骨髓中脂肪組織的增加，這是骨質(zhì)疏松、骨壞死等疾病的主要形成原因之一，也與中醫(yī)骨痿的病理機(jī)制——“骨髓空虛”有著某種意義上的契合。如何降低BMSCs成脂分化過(guò)程中相關(guān)基因表達(dá)將開(kāi)辟骨質(zhì)疏松等代謝性骨疾病新的思路。干細(xì)胞具有先天之精的屬性，腎所藏之精可相應(yīng)于胚胎干細(xì)胞以及其他成體干細(xì)胞(如：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等)〔6〕。中醫(yī)在“腎藏精” 理論指導(dǎo)下的補(bǔ)腎藥物能否調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化正是本研究的主旨所在。右歸丸出自張景岳的《景岳全書(shū)·新方八陣》，為補(bǔ)腎填精的名方。具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)，填精補(bǔ)髓之功效。故本研究選擇右歸丸作為補(bǔ)腎法的研究切入點(diǎn)。

表觀遺傳機(jī)制在干細(xì)胞定向分化中起著重要的作用。其中，DNA甲基化是基因轉(zhuǎn)錄水平表觀遺傳學(xué)調(diào)控的主要方式，其在干細(xì)胞分化過(guò)程中起著重要的作用。DNA甲基化等表觀遺傳修飾是一種不涉及序列改變的基因表達(dá)調(diào)控方式，指DNA在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶。甲基化達(dá)到一定程度時(shí)會(huì)DNA結(jié)構(gòu)收縮，螺旋加深，而不利于轉(zhuǎn)錄的起始，導(dǎo)致基因失活。相反地，去甲基化則可上調(diào)基因表達(dá)。

PPARγ通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，在脂肪形成、糖脂代謝，以及在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，是脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的關(guān)鍵因子〔7〕。C/EBPα也是干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子之一。脂肪細(xì)胞特異性表達(dá)基因調(diào)控區(qū)內(nèi)的增強(qiáng)子CCAAT重復(fù)序列的位點(diǎn)突變后，這些基因的調(diào)控區(qū)就不能誘導(dǎo)成脂相關(guān)基因的表達(dá)。而抑制C/EBPα的表達(dá)則可激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路刺激成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子而促進(jìn)成骨〔8〕。本研究有效證明了補(bǔ)腎中藥具有抑制BMSCs脂向轉(zhuǎn)化的功能。PPARγ和C/EBPα甲基化上調(diào)，右歸丸組優(yōu)于其他各組，其甲基化的水平直接影響著成脂化的發(fā)展變化。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明補(bǔ)腎中藥右歸丸含藥血清可以明顯增高PPARγ和C/EBPα基因甲基化的水平。

綜上所述，右歸丸干預(yù)BMSCs成脂過(guò)程中PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)明顯下調(diào)，且其DNA甲基化水平增高。一定程度上說(shuō)明補(bǔ)腎中藥右歸丸可以通過(guò)上調(diào)成脂基因甲基化率，抑制基因的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成脂方向分化，從抑制骨髓脂肪化來(lái)達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的，為中醫(yī)“腎主骨、生髓”理論的深入研究探索了新的思路。

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〔2015-01-30修回〕

(編輯袁左鳴)

Effect of Yougui Pill(YGP)on gene methylation related adipogenesis differentiation of mysenchymal stem cells

YANG Feng,PAN Le,MA Qiu-Tao,etal.

The Affiliated Hospital of Shaanxi University of TCM,Xi'an 712083,Shaanxi,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of serum contained Yougui pill for adipogenic marker and methylation.MethodsUnder aseptic condition,bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from the femur and tibia of SD rats.The second generation of adherent cells were divided into normal control,bone induction,Yougui pill groups.PPARγand C/EBPα gene expressions and methylation status were measured by RT-PCR and methylation specific PCR assay after 1 days.ResultsPPARγand C/EBPαmRNA expressions of Yougui pill group were obviously lower than those of other groups(P<0.05).The methylations of PPARγand C/EBPαwere up-regulated(P<0.05).ConclusionsThe serum containing Yougui pills could inhibit adipogensis differentiating of bone marrow mesenchymal stem cells by demethylation mechanism.

【Key words】Kidney tonic formula;Yougui pill;BMSCs;Adipogenesis;Methylation

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81102610，81473711)；陜西省中醫(yī)管理局科研課題(13-JC014)；陜西省科技研究發(fā)展計(jì)劃(2015SF072)

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R2-03〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)24-6979-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.006