ZFN,TALEN,CRISPR/Cas9和NgAgo/gDNA四代基因編輯系統(tǒng)及其在農(nóng)業(yè)和林業(yè)上的應(yīng)用展望

趙華東漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校

ZFN,TALEN,CRISPR/Cas9和NgAgo/gDNA四代基因編輯系統(tǒng)及其在農(nóng)業(yè)和林業(yè)上的應(yīng)用展望

趙華東
漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校

基因編輯技術(shù)是當(dāng)前生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的科學(xué)前沿，本文力求用最淺顯語言講述基因編輯技術(shù)及四代[1-4]基因編輯系統(tǒng)。文后列舉課題，以咨參考。

基因編輯；技術(shù)

在今年的5月2日，科學(xué)家韓春雨與合作者在《自然·生物技術(shù)》發(fā)表的一篇論文[5]，標(biāo)志著一種名為NgAgo-gDNA的基因編輯系統(tǒng)的誕生。有人稱NgAgo-gDNA系統(tǒng)為第四代基因編輯系統(tǒng)。接下來我們就看一看四代基因編輯系統(tǒng)的來龍去脈。

1 從分子水平上改變生物體性狀的技術(shù)

生命體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特征，如ABO血型，都稱為性狀。性狀都是由基因決定的，基因的成分就是DNA。我們編輯基因就能改變生物體外在的性狀，這就是基因編輯。通過基因組編輯技術(shù)能實現(xiàn)三種目的：基因敲除、特異突變和定點轉(zhuǎn)基因。

2 所有基因編輯系統(tǒng)的一般作用模式

不論是第一代鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）系統(tǒng)[1]和第二代類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）系統(tǒng)[2]，還是第三代CRⅠSPR∕Cas9系統(tǒng)[3,4]，還有被稱為第四代的NgAgo-gDNA系統(tǒng)[5]都有相通的一般作用模式：

（1）這些系統(tǒng)都有一個特異性“抓手”，用以識別和抓住目標(biāo)基因的特異性DNA序列：①ZFN系統(tǒng)的抓手由鋅指蛋白充當(dāng)；②TALEN系統(tǒng)的抓手是激活因子樣效應(yīng)物；③對于CRⅠSPR∕Cas9系統(tǒng)來說，抓手是一段單鏈RNA序列；④NgAgo-gDNA系統(tǒng)的抓手是一段5’端磷酸化的單鏈DNA。

（2）這些系統(tǒng)都有剪切DNA的“剪刀”：①第一代的剪刀是非特異性核酸內(nèi)切酶；②第二代的剪刀是切斷DNA雙鏈的核酸酶；③第三代的剪刀是Cas9；④而NgAgo-gDNA系統(tǒng)的剪刀是NgAgo，適合在人體細(xì)胞中進行基因組編輯。

（3）目標(biāo)的達成都依賴生物體的DNA損傷修復(fù)的應(yīng)答機制。

3 四代基因編輯系統(tǒng)的比較

第一代ZFN系統(tǒng)[1]，技術(shù)上較難，①需高投入設(shè)計ZFN；②過量ZFN對細(xì)胞有損傷；③精確程度和后果較難預(yù)料；④ZFN的脫靶切割會導(dǎo)致細(xì)胞毒性，在基因治療的領(lǐng)域出現(xiàn)了應(yīng)用局限。

第二代TALEN系統(tǒng)[2]，技術(shù)上較易，①可設(shè)計性強，不受上下游序列影響；②與基因組的特異性結(jié)合受鄰近序列的影響；③仍有一定細(xì)胞毒性，模塊組裝過程繁瑣。

第三代CRⅠSPR∕Cas9系統(tǒng)[3,4]，技術(shù)上容易，①天然存在的系統(tǒng)，識別的精度高；②更為簡單和廉價，具有效率性和簡易性；③降低了脫靶幾率，減低了細(xì)胞毒性；④Cas9基因組的靶點選擇受到PAM區(qū)和富含GC區(qū)的限制；⑤RNA易于形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)而帶來的失效或者脫靶效應(yīng)。

第四代NgAgo-gDNA系統(tǒng)[5]，較之以前更為先進，技術(shù)優(yōu)勢明顯，①向?qū)гO(shè)計制作簡便，無需構(gòu)建表達載體；②對基因組任何位置都能有效引入雙鏈斷裂；③由于向?qū)Ш怂崾荄NA，大幅降低了失效和脫靶率，對游離于細(xì)胞核的DNA具有更高的切割效率；④NgAgo結(jié)合24個堿基的gDNA，這比Cas9的gRNA19個堿基要長5個堿基，理論上其精確性要提高1024倍；⑤已經(jīng)證實NgAgogDNA能夠?qū)Σ溉閯游锘蚪M進行高效地編輯；⑥可用于微生物、植物和動物的精準(zhǔn)基因改造，在多方面具有重要應(yīng)用價值。

4 基因編輯在農(nóng)業(yè)和林業(yè)上亟待解決的重大課題舉例

例1：有“行道樹之王”之稱的喬木——懸鈴木，極大地改善了城市的生態(tài)環(huán)境，是一種非常優(yōu)良的綠化樹種。但是懸鈴木有兩個比較突出的缺點——其一是球果飛絮，其二是花粉過敏，這些幾乎成了城市公害[6,7,8]。如果篩選出產(chǎn)生球果的關(guān)鍵基因，用基因編輯技術(shù)給予基因敲除，培育出不產(chǎn)生球果和花粉的懸鈴木，就能夠極大地造福社會。

例2：楊樹給人們帶了可觀的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益。但是楊樹一個很大的缺點[9,10]——產(chǎn)生了大量的楊絮，污染空氣，造成了糧食減產(chǎn)、樹木生長遲緩。圍繞著楊絮治理的種種辦法，效果卻不令人滿意。如果我們能從楊樹的基因組中篩選出楊樹開花的關(guān)鍵性基因，用基因編輯技術(shù)給予敲除，培育出不產(chǎn)生楊絮的品種，就能夠一勞永逸地解決這個困擾性的問題。因此可以說，基因編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)和林業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用前景。

[1]Bibikova M,et al.Targeted chromosomal[J].Genetics,2002, 161(3):1169-75.

[2]Hockemeyer,Det al.Genetic engineering[J].Nature Biotechnology,2011,29(8):731-4.

[3]Jinek M,et al.A Programmable[J].Science,2012,337(6096): 816-21.

[4]Cong L,et al.Multiplex genome engineering using CRⅠSPR∕Cas systems[J].Science,2013,339(6121):819-23.

[5]Gao F,et al.DNA-guided[J].Nature biotechnology,2016.

[6]唐曉嵐等.南京2種常見行道樹致敏性及其控制措施[J].吉首大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2014,35(3):69-73.

[7]劉健.怎樣使二球懸鈴木果絮不污染環(huán)境[J].中國花卉盆景, 2007(12):33-33.

[8]王愛霞,方炎明.二球懸鈴木不同器官對空氣中Cu、Ni、Pb和Zn的累積作用[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報,2015(2):67-72.

[9]李萍.皖北楊絮的危害及防控[J].農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究,2014(11): 18-19.

[10]程心杰.楊絮的危害及解決措施[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2014 (16):155-156.