免標(biāo)記法快速檢測牛奶中卡那霉素的研究

王承克，陳　丹,陸　峰，張俊俊

(江蘇大學(xué)　食品與生物工程學(xué)院,江蘇　鎮(zhèn)江　212032)

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免標(biāo)記法快速檢測牛奶中卡那霉素的研究

王承克*，陳丹,陸峰，張俊俊

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,江蘇鎮(zhèn)江212032)

卡那霉素(Kanamycin)是一種被廣泛使用的氨基糖苷類抗生素，主要通過與細菌的30S核糖體RNA相互作用抑制其蛋白質(zhì)合成而起到殺菌作用，對常見的致病菌，如大腸桿菌、結(jié)核桿菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陰性菌有很強的抑制作用[1-2]。由于價格低廉且抗菌性廣，卡那霉素作為獸藥被廣泛使用，然而，由于操作不當(dāng)或監(jiān)管不力，實際生產(chǎn)中，卡那霉素被濫用或在飼料中被過量使用，造成其在動物源性食品中存在殘留。過量的卡那霉素給人體帶來的副作用包括腎毒性、造血系統(tǒng)毒性、過敏性等?？敲顾貙胗變河泻軓姷亩拘?，會導(dǎo)致嬰幼兒耳蝸細胞凋亡，嚴重者會導(dǎo)致聽力喪失。因此，動物源性食品中卡那霉素殘留的快速定量檢測對于保障食品安全非常重要。

目前，常見的卡那霉素檢測方法包括高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、微生物檢測法以及酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)等[3-7]，盡管這些方法能夠靈敏檢測食品中的卡那霉素，但由于所用儀器昂貴，耗時較長，且操作繁瑣，限制了其實際應(yīng)用。因此，建立一種快速、靈敏、便捷的食品中卡那霉素的檢測方法對于保障食品安全很有必要。

適配體(Aptamer)是一種經(jīng)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(SELEX)篩選出的能與待測分子發(fā)生特異性相互作用的DNA/RNA片段，具有合成便利、成本低、易于設(shè)計、親和力強、特異性好的優(yōu)點，被廣泛用于小分子的檢測[8-11]。另一方面，納米金(Gold nanoparticle)作為一種新型傳感器，具有容易制備、易于功能化和光學(xué)性質(zhì)好等優(yōu)點，在金屬離子、蛋白質(zhì)、小分子的檢測中受到人們的日益關(guān)注[12-15]。近年來，也有以適配體功能化納米金為探針對生物分子進行檢測的相關(guān)報道，如Chen等[5]利用共振光散射光譜對溶液中的卡那霉素進行靈敏檢測；Luo等[16]利用半胱胺功能化納米金在適配體存在時加入四環(huán)素前后溶液吸收光譜的改變，對四環(huán)素進行靈敏檢測；Chen等[17]利用納米金和熒光分子修飾的適配體的相互作用，通過測定溶液熒光光譜的改變實現(xiàn)了對卡那霉素的靈敏檢測；Peinetti等[18]通過測定納米金和適配體相互作用后加入磷酸腺苷時阻抗的變化，實現(xiàn)了磷酸腺苷的靈敏檢測。然而，由于以上研究需使用熒光光譜儀、電化學(xué)工作站等儀器，在快速簡便檢測小分子方面存在一定不足。本文發(fā)展了一種免標(biāo)記的新方法，基于適配體與卡那霉素特異性的相互作用以及納米金在分散和聚集狀態(tài)時吸收光譜的改變，采用實驗室常見的固定波長酶標(biāo)儀實現(xiàn)了牛奶中卡那霉素的高選擇性和快速靈敏檢測。

1實驗部分

1.1試劑與儀器

硫酸卡那霉素、乳糖、啶蟲脒、氯霉素、鹽酸四環(huán)素、紅霉素(Aladdin化學(xué)試劑有限公司)，赭曲霉毒素A(OTA，新加坡Pribolab公司)，二水合氯金酸(HAuCl4·2H2O，美國Sigma公司)。所用試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。根據(jù)文獻[19]選取能與卡那霉素發(fā)生相互作用的適配體(5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’)，并由上海生工生物工程股份有限公司合成純化，使用前溶于去離子水中。

Varian Cary 100紫外可見光譜儀(美國)，Multiscan MK3酶標(biāo)儀(美國熱電公司)。

1.2緩沖溶液中卡那霉素的檢測

利用文獻方法，使用檸檬酸鈉還原氯金酸溶液法制備納米金[20-21]。向100 μL納米金溶液中加入終濃度為200 nmol/L的適配體和不同濃度的卡那霉素后，再加入200 mmol/L NaCl溶液，反應(yīng)10 min，利用酶標(biāo)儀記錄溶液在630 nm處的吸光度值。

1.3牛奶中卡那霉素的檢測

取當(dāng)?shù)爻匈徶玫呐Ｄ?內(nèi)蒙古伊利乳業(yè)，產(chǎn)地馬鞍山)10 mL，加入不同濃度的硫酸卡那霉素，再逐滴加入20%乙酸溶液，調(diào)至pH 4.5，然后加熱至45 ℃，靜置10 min，13 200 r/min離心10 min，取中層液，利用“1.2”方法測定溶液在630 nm處的吸光度值[19]。

2結(jié)果與討論

2.1傳感器的設(shè)計原理

表面包覆有檸檬酸根離子的納米金由于表面帶負電荷，相互排斥，在溶液中保持分散狀態(tài)，當(dāng)加入NaCl時，由于NaCl破壞了納米金表面的雙電層，使其穩(wěn)定性大大降低，從分散狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奂癄顟B(tài)，溶液顏色由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{紫色，相應(yīng)的溶液光譜發(fā)生紅移，630 nm處的吸光度值明顯增加，如圖1所示[22]。當(dāng)適配體單鏈DNA存在時，納米金表面的檸檬酸根被取代，由于DNA側(cè)鏈磷酸基團與納米金間的非特異性相互作用，使納米金帶負電，當(dāng)加入一定濃度的NaCl時，納米金可以保持一定的穩(wěn)定性而不發(fā)生聚集，溶液顏色仍為紅色。而當(dāng)待測物卡那霉素存在時，由于適配體與卡那霉素的特異性親和作用，適配體構(gòu)型發(fā)生改變而從納米金表面脫落，此時再加入NaCl時，納米金會發(fā)生明顯聚集，溶液顏色由紅色變?yōu)樗{紫色。隨待測溶液中卡那霉素濃度的改變，納米金溶液光譜也逐漸改變[23]。基于此可以方便快捷地檢測溶液中的卡那霉素。

2.2可行性論證

為驗證實驗的可行性，在納米金探針溶液中加入適配體和不同濃度的卡那霉素，最后加入不同濃度的NaCl溶液，當(dāng)溶液中不含卡那霉素時，溶液光譜最大吸收峰位于520 nm處，而當(dāng)溶液中存在50 nmol/L卡那霉素時，溶液的最大吸收光譜明顯紅移，520 nm處的吸光度降低，而630 nm處的吸光度明顯增大(如圖1)。此現(xiàn)象說明卡那霉素與適配體的結(jié)合使納米金的穩(wěn)定性降低。基于該性質(zhì)可用于卡那霉素的檢測。為了減少測定時間，簡化操作步驟，后續(xù)實驗選取630 nm作為溶液的特征吸收波長，同時使用了能快速(1～2 s)、高通量測定溶液630 nm處吸光度值的酶標(biāo)儀。

圖1　免標(biāo)記法檢測卡那霉素原理示意圖

圖2　不同pH值對溶液在630 nm處吸光度值的影響Fig.2　Effect of pH value on absorbance of the solution at 630 nmbuffer：10 mmol/L phosphate buffer;concentration of aptamer：400 nmol/L;concentration of NaCl：250 mmol/L;error bars represent standard deviation of three experimental results

圖3　不同濃度卡那霉素存在時溶液在630 nm處吸光度值的變化Fig.3　Absorbance changes of the solution at 630 nm in the presence of different concentrations of kanamycinbuffer：10 mmol/L phosphate buffer(pH 7.5);concentration of aptamer：400 nmol/L;concentration of NaCl：250 mmol/L;error bars represent standard deviation of three experimental results

2.3實驗條件的優(yōu)化

使用免標(biāo)記法測定卡那霉素，溶液的光譜變化與適配體濃度、NaCl濃度、加入NaCl后的反應(yīng)時間以及反應(yīng)體系的pH值等密切相關(guān)。為使該傳感器獲得最佳檢測性能，分別對上述實驗條件進行優(yōu)化。

實驗結(jié)果表明，適配體濃度為400 nmol/L，NaCl濃度為250 mmol/L時，加入卡那霉素前后溶液在630 nm處的吸光度值存在最大差異，在加入NaCl 5 min后，吸光度值保持穩(wěn)定。因此，實驗選擇上述反應(yīng)條件下檢測溶液在630 nm處的吸光度值。

對體系pH值進行了優(yōu)化，pH 5.5～8.5時，溶液在630 nm處的吸光度值均比不含卡那霉素的溶液吸光度值大，且pH 7.5時存在最大差異(如圖2)。這可能是由于不同pH值時，納米金與適配體的親和力存在差異，同時不同pH值對納米金穩(wěn)定性也存在一定影響所致。后續(xù)實驗采用pH 7.5作為最佳實驗條件。

圖4　免標(biāo)記傳感器對卡那霉素的選擇性實驗Fig.4　Selectivity of the label-free sensor between kanamycin and other interfering materialsbuffer：10 mmol/L phosphate buffer(pH 7.5);concentration of aptamer：400 nmol/L;concentration of NaCl：250 mmol/L;concentrations of kanamycin,ochratoxin A,lactose,acetamiprid,chloramphenicol,erythromycin,tetracycline are 50 nmol/L,respectively;error bars represent standard deviation of three experimental results

2.4卡那霉素的檢測曲線

在最優(yōu)實驗條件下，考察了該傳感器對卡那霉素的檢測能力。圖3為納米金溶液中含有不同濃度卡那霉素時630 nm處吸光度值的變化。由圖可知，在0～50 nmol/L濃度范圍內(nèi)，溶液在630 nm處的吸光度值隨卡那霉素濃度的增加而增強，說明隨著卡那霉素濃度的增加，結(jié)合在納米金表面的適配體量逐漸減少，納米金在NaCl存在時的穩(wěn)定性也逐漸降低。圖3插圖顯示，在1～10 nmol/L濃度范圍內(nèi)，溶液在630 nm處的吸光度值與卡那霉素濃度呈線性相關(guān)，線性方程為OD630 nm=0.367 7+0.003 4ckanamycin，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.99，傳感器對卡那霉素的檢出限為1 nmol/L。

2.5方法的選擇性

考察了該傳感器對卡那霉素的選擇性，結(jié)果如圖4所示。在相同實驗條件下，當(dāng)溶液中存在50 nmol/L赭曲霉毒素A(真菌毒素)、乳糖(牛奶中重要成分)、啶蟲脒(農(nóng)藥)、氯霉素(抗生素)、紅霉素(抗生素)或四環(huán)素(抗生素)時，溶液在630 nm處的吸光度值(約為0.35)低于其對于目標(biāo)分子卡那霉素(50 nmol/L)的響應(yīng)(0.43)，表明該傳感器對卡那霉素的選擇性較高，該方法有很好的特異性。

2.6實際樣品的檢測

為驗證該傳感器的實用性，對空白牛奶樣品進行加標(biāo)回收實驗，加標(biāo)水平為1,2,5 nmol/L，在最優(yōu)化條件下采用本方法對卡那霉素進行定量分析(平行測定3次，求平均值)，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，卡那霉素的回收率為94%～96%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均低于5%，說明該傳感器能夠用于實際樣品中卡那霉素的檢測。

表1　免標(biāo)記法檢測牛奶樣品中卡那霉素的回收率結(jié)果

3結(jié)論

本文利用卡那霉素與其適配體特異性的相互作用以及納米金優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，構(gòu)建了一種快速、靈敏檢測牛奶中卡那霉素的分析方法。該方法具有較好的靈敏度和特異性，操作簡便，有望用于食品中卡那霉素的快速分析。

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摘要：發(fā)展了一種利用納米金探針免標(biāo)記法檢測卡那霉素的方法。適配體能夠使納米金在NaCl溶液中保持一定的穩(wěn)定性，且溶液呈紅色，而當(dāng)卡那霉素存在時，由于適配體與卡那霉素特異性的相互作用，使納米金的穩(wěn)定性降低，當(dāng)NaCl存在時發(fā)生聚集，溶液變?yōu)樗{紫色，根據(jù)溶液在630 nm波長處吸光度值的改變，利用具有固定波長的酶標(biāo)儀可實現(xiàn)卡那霉素的快速定量檢測。檢測線性范圍為1～10 nmol/L，檢出限為1 nmol/L，檢測過程可在5 min內(nèi)完成。該方法成功用于牛奶中卡那霉素的檢測，具有較好的選擇性和較高的靈敏度，對食品中抗生素超標(biāo)等食品安全問題的監(jiān)控具有重要意義。

關(guān)鍵詞：卡那霉素；納米金；適配體；牛奶

Rapid Detection of Kanamycin in Milk Using Label-free MethodWANG Cheng-ke*,CHEN Dan,LU Feng,ZHANG Jun-jun

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang212032,China)

Abstract：A label-free method was developed for the detection of kanamycin using gold nanoparticles(GNPs).This method was based on the fact that aptamer can make GNPs maintain monodispersed in NaCl solution and keep red color.After adding kanamycin into the solution,due to the specific interaction of aptamers with kanamycin,the stability of GNPs was reduced as the aptamer was firstly interacted with kanamycin and removed from GNPs,which induced GNPs aggregating in the presence of NaCl,and the color of the solution was changed into blue or blue-violet,correspondingly.According to the absorbance change of the solution at 630 nm,the content of kanamycin could be rapidly detected using a simple microplate reader with fixed wavelength.The linear range of kanamycin was in the range of 1-10 nmol/L,with a detection limit of 1 nmol/L.The detection process could be accomplished in 5 min.This method could be used to detect kanamycin in milk samples,with advantages of good selectivity and high sensitivity,and is of great significance to detect the excessive antibiotics addition in food.

Key words：kanamycin;gold nanoparticle;aptamer；milk

中圖分類號：O657.3；TQ460.72

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1004-4957(2015)12-1434-05

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.019

通訊作者：*王承克，博士，講師，研究方向：食品安全分析，Tel：0511-88780201，E-mail：wangck@ujs.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金(21305032)；中國博士后科研基金(2014M551522)；江蘇省博士后科研基金(1402073B)

收稿日期：2015-05-04；修回日期：2015-06-01