高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定卷煙中的甘草酸

秦艷華，莊亞東，張　華，韓開冬，石懷彬，尤曉娟，劉獻(xiàn)軍

(江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司　技術(shù)研發(fā)中心，江蘇　南京　210019)

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高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定卷煙中的甘草酸

秦艷華，莊亞東，張華，韓開冬，石懷彬，尤曉娟，劉獻(xiàn)軍*

(江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，江蘇南京210019)

甘草酸是甘草中含有的三萜類物質(zhì)，其鉀、鈣鹽是甘草的主要甜味成分，具有抗炎[1]、抗病毒[2]、抗氧化[3]、促進(jìn)脂肪代謝[4]等作用，被用作多種保健食品和藥品的原料[5-6]，同時(shí)也可用作食品添加劑[7]。甘草用作煙草制品的添加劑已有一百多年歷史，其添加方式以浸膏、甘草粉、酊劑等為主。合理控制甘草成分在卷煙中的用量，可在柔和卷煙煙氣、提調(diào)煙香、掩蓋雜氣以及降低煙氣對(duì)鼻腔、口腔及咽喉部粘膜的刺激等方面發(fā)揮重要作用。高純度的甘草酸也可用作煙草添加劑，具有較強(qiáng)的增香效果，同時(shí)還有一定的保潤(rùn)作用[8]。煙葉本身并不含甘草酸，而甘草酸在高強(qiáng)度加工過(guò)程中理化性質(zhì)穩(wěn)定(沸點(diǎn)高于1 000℃)，因此其含量的變化情況可以作為評(píng)價(jià)卷煙制絲工序加料均勻性的重要指標(biāo)之一。加香加料的均勻性是影響卷煙產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性的重要因素，目前國(guó)內(nèi)在加香加料均勻性方面開展了一些研究，如以1,2-丙二醇或乙基麥芽酚為標(biāo)記物，評(píng)價(jià)施加料液的均勻性[9-11]。但1,2-丙二醇和乙基麥芽酚的沸點(diǎn)低于300 ℃，在制絲工序高強(qiáng)度加工過(guò)程中存在較大的損耗。因此，準(zhǔn)確測(cè)定卷煙中的甘草酸含量，對(duì)煙草的品質(zhì)評(píng)價(jià)和指導(dǎo)準(zhǔn)確加料具有重要意義。

甘草酸為甘草的主要成分[12]，其測(cè)定方法的研究主要集中在醫(yī)藥、天然產(chǎn)物化學(xué)等領(lǐng)域，包括比色法[13-14]、薄層掃描法[15]、高效毛細(xì)管電泳[16]、液相色譜法[17-20]、液相色譜-質(zhì)譜法[21-22]、CdSe量子點(diǎn)熒光增敏法[23]等。田忠等[24]采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器測(cè)定了白肋煙中的甘草酸含量，但由于卷煙成分復(fù)雜，存在基質(zhì)干擾，方法的選擇性和靈敏度不高，因此難以滿足應(yīng)用甘草酸評(píng)價(jià)加料均勻性所要求的準(zhǔn)確度。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)具有高選擇性、高靈敏度的特點(diǎn),而應(yīng)用該方法分析卷煙中的甘草酸含量尚未見報(bào)道。因此，本文擬應(yīng)用HPLC-MS/MS建立卷煙中甘草酸含量的分析方法，以期為卷煙制絲工序加料均勻性評(píng)價(jià)提供必要的技術(shù)支持[12,24-25]。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

API 3200型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Applied Biosystems公司);1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；HY-5回旋振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；ME204電子天平(感量0.1 mg，瑞士Mettler Toledo公司)。

甘草酸單銨標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%，美國(guó)Sigma公司)；甲醇(色譜純,德國(guó)CNW公司)；醋酸銨(色譜純，美國(guó)Sigma公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水儀制備的超純水。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取5.0 mg甘草酸單銨鹽標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成濃度為0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，2.50 mg/L的甘草酸單銨標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3樣品前處理

煙絲樣品于40 ℃下烘干2 h，粉碎，過(guò)40目篩。稱取約0.250 0 g煙末(精確至0.1 mg)，置于50 mL三角瓶中，加入25.0 mL 甲醇-5 mmol/L醋酸銨(4∶1)萃取液，室溫下以150 r/min振蕩30 min，過(guò)濾后待測(cè)。

1.4色譜與質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)。流動(dòng)相：A為5 mmol/L醋酸銨水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～10.0 min，10%～100%B；10.0～15.0 min，100%B；15.0～15.1 min，100%～10%B；15.1～30.0 min，10%B。流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

質(zhì)譜條件：電離模式：電噴霧電離正離子檢測(cè)模式(ESI+)，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；霧化氣壓力：40 psi；輔助氣壓力：50 psi；氣簾氣壓力：10 psi；碰撞氣壓力：5 psi；離子噴射電壓：5 500 V；離子源溫度：350 ℃；去簇電壓(DP)為55 V；射入電壓(EP)為9 V；碰撞室入口電壓(CEP)為28 V；碰撞室射出電壓(CXP)為10 V；前體離子Q1([M(甘草酸)+H]+)：823m/z；定量、輔助定性產(chǎn)物離子Q3分別為452.8，647.5m/z，對(duì)應(yīng)的碰撞能量為45，26 V；標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間：10.40 min。

2結(jié)果與討論

2.1萃取溶劑的選擇

甘草酸的萃取多采用甲醇-水、乙醇-水作為提取溶劑[17-18,21,24-25]，由于甘草酸在醇中的溶解度大于在水中的溶解度[18]，故以純水為提取劑時(shí)甘草酸的提取量偏低。實(shí)驗(yàn)比較了純甲醇、80%甲醇水溶液和50%甲醇水溶液分別作為萃取溶劑時(shí)的提取效率，發(fā)現(xiàn)80%甲醇水溶液的萃取效果最好。這是因?yàn)榇?水溶液對(duì)甘草酸的溶解性較好，對(duì)粉狀樣品的穿透性較強(qiáng)，因此提取效率較高，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論相一致[26]。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將甘草酸單銨標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇，配成濃度為1 μg·mL-1的溶液。通過(guò)注射泵連續(xù)進(jìn)樣，在正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜圖全掃描，確定其準(zhǔn)分子離子[M+H]+，然后對(duì)母離子做子離子全掃描，得到碎片離子，選擇豐度較高的兩個(gè)特征碎片離子分別作為定性和定量離子。最后對(duì)去簇電壓(DP)、射入電壓(EP)、碰撞室入口電壓(CEP)、碰撞能量(CE)、碰撞室射出電壓(CXP)等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見“1.4”。

2.3色譜條件的優(yōu)化

考察了色譜柱溫度在30～40 ℃區(qū)間內(nèi)對(duì)甘草酸分離效果的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)柱溫從30 ℃升至40 ℃時(shí)，信噪比從259.5降至237.5，保留時(shí)間變短，但分離效果無(wú)明顯差別。因此，選擇30 ℃作為色譜柱的分離溫度。

從分析的選擇性及靈敏度的角度考慮，實(shí)驗(yàn)采用甲醇-水體系為流動(dòng)相，并在流動(dòng)相中添加醋酸銨，以促進(jìn)電噴霧離子源條件下化合物的離子化?？疾炝肆鲃?dòng)相中醋酸銨濃度分別為0,2,5,8 mmol/L時(shí)，甘草酸單銨的色譜峰形及其響應(yīng)情況。結(jié)果表明，不加醋酸銨時(shí)，色譜峰峰寬較寬。加入2 mmol/L醋酸銨時(shí)，可明顯改善色譜峰形且提高離子化效率。醋酸銨濃度增至5 mmol/L時(shí)，色譜峰形狀和離子化效率進(jìn)一步改善，但其濃度繼續(xù)加大時(shí)，色譜峰形的變化不明顯，且離子化效率有減小的趨勢(shì)(圖1)。因此實(shí)驗(yàn)選擇含5 mmol/L醋酸銨的甲醇-水為流動(dòng)相體系。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)等度洗脫和梯度洗脫程序進(jìn)行比較，采用甲醇-5 mmol/L醋酸銨(70∶30)等度洗脫時(shí)，甘草酸的保留時(shí)間為4.2 min，峰寬1.0 min；采用甲醇-5 mmol/L醋酸銨(50∶50)等度洗脫時(shí)，15.0 min內(nèi)不出峰；選用梯度洗脫并優(yōu)化洗脫程序后，甘草酸的保留時(shí)間增至10.4 min，峰寬0.4 min。為使化合物有較好的分離和適當(dāng)?shù)某龇鍟r(shí)間，最終選擇梯度洗脫。圖2為甘草酸單銨標(biāo)準(zhǔn)品和卷煙樣品的提取離子色譜圖。

2.4工作曲線、檢出限及定量下限

采用本方法對(duì)“1.2”中系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量，以甘草酸的峰面積(Y)對(duì)其濃度(X，mg/L)進(jìn)行回歸分析，得線性方程為Y=4.82×104X-336，r2=0.999 4。表明甘草酸在0.05～2.50 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；谌恿考皹悠份腿∪芤后w積，以3倍信噪比確定方法的檢出限(LOD)為1.4 mg/kg，10倍信噪比確定方法的定量下限(LOQ)為4.8 mg/kg。

2.5加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

取煙末樣品，分別添加濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液40，80，120 μL，即加標(biāo)水平分別為16，32，48 mg·kg-1，按照本方法進(jìn)行樣品前處理和測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次。日內(nèi)精密度通過(guò)1 d內(nèi)測(cè)定3個(gè)加標(biāo)水平下的6個(gè)平行得到，日間精密度由連續(xù)6 d(每天測(cè)定1次)測(cè)定3個(gè)加標(biāo)水平下的樣品得到，結(jié)果見表1。由表1可知，方法的加標(biāo)回收率為89.1%～105.0%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.8%～3.0%，日間RSD為3.8%～5.0%。表明方法具有較好的準(zhǔn)確度與精密度。

表1　方法的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.6HPLC與LC-MS/MS法的比較

本實(shí)驗(yàn)就方法的靈敏度和選擇性兩個(gè)方面對(duì)HPLC和LC-MS/MS進(jìn)行了比較，兩個(gè)方法所采用的色譜條件完全一致。由表2可知，LC-MS/MS方法的檢出限、定量下限低于HPLC法，且相同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 μg·mL-1)的信噪比是HPLC的300多倍，靈敏度明顯高于HPLC法。由于HPLC法(波長(zhǎng)252 nm)的選擇性較差，樣品峰受到雜質(zhì)峰的影響無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離，且所測(cè)卷煙產(chǎn)品中甘草酸的含量低(低于HPLC定量下限)，因此在同樣前處理?xiàng)l件下不能用該方法進(jìn)行定量分析。LC-MS/MS方法由于選擇性強(qiáng)，無(wú)雜質(zhì)峰干擾，可以達(dá)到基線分離。所以，相比于HPLC方法，LC-MS/MS方法更能滿足檢測(cè)要求。

表2　HPLC與LC-MS/MS法的比較

2.7實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本文所建立的方法，測(cè)定了1種市售卷煙10個(gè)批次樣品中甘草酸的含量，其檢出結(jié)果為31.19～34.17 μg/支，RSD為4.5%。該品牌卷煙中甘草酸的含量較為穩(wěn)定，加料均勻性較好。

3結(jié)論

本文建立了檢測(cè)卷煙中甘草酸含量的HPLC-MS/MS方法，通過(guò)對(duì)色譜條件的優(yōu)化，顯著提高了檢測(cè)靈敏度；利用串聯(lián)質(zhì)譜高選擇性的特點(diǎn)，有效去除了基質(zhì)成分的干擾，保證了方法的靈敏度。方法檢出限為1.4 mg/kg，加標(biāo)回收率為89.1%～105.0%，日內(nèi)RSD為0.8%～3.0%，日間RSD為3.8%～5.0%。方法的準(zhǔn)確度好，樣品通量較高，適用于卷煙產(chǎn)品中甘草酸含量的分析，尤其適用于卷煙制造過(guò)程控制的大規(guī)模樣品檢測(cè)。

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摘要：建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測(cè)定卷煙中甘草酸的分析方法。采用甲醇-5 mmol/L醋酸銨水溶液(4∶1)為萃取溶劑，經(jīng)Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)分離后，串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)，外標(biāo)法定量。甘草酸在0.05～2.50 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999 4，方法的定量下限為4.8 mg/kg；回收率為89.1%～105.0%，日內(nèi)、日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于5%。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)；卷煙；甘草酸

Determination of Glycyrrhizic Acid in Cigarette by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryQIN Yan-hua,ZHUANG Ya-dong,ZHANG Hua,HAN Kai-dong,SHI Huai-bin,YOU Xiao-juan,LIU Xian-jun*

(Research & Development Center,China Tobacco Jiangsu Industrial Co.,Ltd.,Nanjing210019,China)

Abstract：A new method was developed for the determination of glycyrrhizic acid in cigarette by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The samples were extracted with methnol-5 mmol/L NH4Ac(4∶1) under oscillation,then separated on an Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18column(2.1 mm×150 mm，3.5 μm).The glycyrrhizic acid was detected with HPLC-MS/MS under multiple reaction monitoring(MRM) mode,and quantified by the external standard method.The method had a good linearity(r2>0.999) in the concentration range of 0.05-2.50 mg/L.The recoveries of glycyrrhizic acid were in the range of 89.1%-105.0% with intra-day and inter-day relative standard deviations both not more than 5%.The limit of quantitation(LOQ) of method was 4.8 mg/kg.

Key words：high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);cigarette;glycyrrhizic acid

中圖分類號(hào)：O657.63;TS202

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-4957(2015)12-1398-05

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.012

通訊作者：*劉獻(xiàn)軍，碩士,工程師，研究方向：煙草化學(xué)分析及卷煙煙氣分析，Tel：025-86478506，E-mail：liuxj@jszygs.com

基金項(xiàng)目：中國(guó)煙草總公司增香保潤(rùn)重大專項(xiàng)“HXD對(duì)料液施加效果的影響研究”(110201301027(BR-12)

收稿日期：2015-05-14；修回日期：2015-07-20