自制羊膜提取液在兔眼準分子激光屈光性角膜切削術后的應用研究

張斌

(沈陽何氏眼科醫(yī)院，遼寧沈陽110032)

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自制羊膜提取液在兔眼準分子激光屈光性角膜切削術后的應用研究

張斌

(沈陽何氏眼科醫(yī)院，遼寧沈陽110032)

摘要目的：探討自制羊膜提取液對兔眼準分子激光屈光性角膜切削術(photorefractive keratectomy，PRK)后角膜上皮下霧狀混濁(Haze)的影響。方法：常規(guī)方法獲取新鮮健康人羊膜，保留上皮細胞，反復凍融、過濾，獲得羊膜勻漿液，室溫下保存?zhèn)溆?。選擇健康新西蘭大白兔27只，在相同條件下，雙眼行PRK，術后實驗動物隨機分為實驗組、對照組、空白組，每組9只兔，18只眼。術后雙眼給予局部抗生素眼藥水，術后48 h實驗組滴用羊膜提取液，對照組用0.1%磷酸地塞米松眼液，空白組用不含羊膜提取液的賦形劑。分別于術后1、2、4、8周記錄角膜Haze情況并按Fantes等級標準進行評分，行眼前節(jié)照相記錄Haze的形態(tài)。隨機每組選擇3只兔作為病理觀察用，分別于術后1、4、8周各處死1只，摘除眼球做病理切片檢查，觀察術區(qū)角膜、炎癥細胞及成纖維細胞情況。結果：PRK術后早期，3組動物角膜熒光素鈉染色均為陽性，但多數(shù)角膜上皮缺損均在術后3 d修復。PRK術后Haze的發(fā)生率為100%，所有術眼均在術后1周左右開始出現(xiàn)程度不同的Haze，術后4周時Haze尤其明顯，直至術后8周。實驗組和對照組角膜Haze形成程度相似，且明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：羊膜提取液具有促進兔角膜上皮修復的作用，并能減少PRK術后兔Haze的形成。

關鍵詞羊膜提取液；角膜上皮；準分子激光屈光性角膜切削術；兔

準分子激光屈光性角膜切削術(photorefractive keratectomy，PRK)所用的是氬氟(ArF)混合物產生的波長為193 nm的準分子激光，它是一種超紫外線冷激光，準確度非常高，能使組織分子氣化而周圍不產生熱效應，因而能對角膜進行精確切削且對角膜的構造不產生不良影響。PRK是角膜屈光手術的重大進展，從1983年Trokel等推出至今，因安全、高效、可預測而得到全世界廣泛應用，但是PRK術后仍然存在一些難以克服的問題，角膜上皮下霧狀混濁(Haze)是其主要并發(fā)癥之一。Haze是準分子激光術后切削區(qū)上皮和基質交界面出現(xiàn)的混濁。通常在術后10 d即可見到，3～6個月達到高峰，以后逐漸減輕[1]。病理上表現(xiàn)為浸潤的炎癥細胞、增生的成纖維細胞及排列紊亂的膠原纖維。Haze的存在，不僅影響視力，還是造成屈光回退的主要原因，影響了PRK的安全性和穩(wěn)定性，因此探索預防和治療角膜Haze的方法，成為眼科界關注的焦點。

近年來，羊膜作為一種生物組織移植材料，已廣泛應用于眼表疾病的治療，在眼表重建中發(fā)揮了重要的作用[2-3]。隨著人們對羊膜作用機制的深入研究，羊膜已被證實有抗炎、抗纖維化的作用，羊膜在眼科領域的應用得到進一步的發(fā)展，逐步向準分子激光手術的治療領域擴展。但由于羊膜保存時間短，運輸不方便，且不能隨時滿足臨床要求，限制了臨床醫(yī)生對羊膜的使用。羊膜提取液技術的應用使得羊膜可以在常溫下保存，并方便運輸及應用，但是否仍能保證臨床應用的效果需進一步驗證。

為探討羊膜提取液在PRK術后抑制Haze生成的作用，本研究采用自制羊膜提取液進行動物實驗研究，比較PRK術后應用羊膜提取液、激素和單純PRK的術后效果，為臨床提供治療的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1羊膜提取液的制備

1.1.1羊膜的來源選擇無傳染性疾病(病毒性肝炎、艾滋病、梅毒等)和全身性疾病，并行剖宮產的產婦新鮮胎盤，在無菌條件下，從胎盤上剝取羊膜，用生理鹽水沖洗干凈羊膜表面的血跡；用含抗生素的無菌生理鹽水浸泡10 min(抗生素混合液的濃度為含50 μg/ml青霉素、50 μg/ml鏈霉素、100 μg/ml新霉素和2.5 μg/ml兩性霉素B)。保留羊膜上皮層、基底膜、實質層。本研究經本院倫理委員會批準，并獲得產婦知情同意。

1.1.2羊膜提取液的制備將羊膜用生理鹽水洗凈、剪碎，加入等量生理鹽水，加入組織勻漿機在4 ℃條件下，10 000 r/min勻漿5次，每次1 min，將勻漿液置于-20 ℃快速凍存至完全凍結，然后在不高于42 ℃的條件下隔水徹底融化，如上條件反復凍融5次，按常規(guī)涂片顯微鏡觀察，證明細胞完全破碎，在1～4 ℃的條件下自然沉降10 h，吸取上清液，用3～4層無菌紗布過濾，去除沉渣和蛋白絮狀物，在4 ℃條件下，500 g離心30 min，取上清液，用過濾膜在正壓或負壓條件下過濾獲得的上清液，截留分子量大于20萬Da以上的大分子物質，使過濾液中的蛋白和多肽類物質的分子量小于20萬Da，0.22 μm微孔濾膜過濾法除菌，4 ℃條件下保存。

1.2動物實驗分組成年健康新西蘭大白兔27只(雄性，沈陽醫(yī)學院實驗動物中心提供)，體重2.0～2.5 kg。隨機分為實驗組、對照組、空白組，各9只18眼，實驗組使用羊膜提取液；對照組使用0.1%磷酸地塞米松眼液，空白組使用不含羊膜提取液的賦形劑。隨機每組選擇3只兔作為病理觀察用。

1.3手術方法實驗動物采用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉，1%愛爾卡因表面麻醉，按常規(guī)方法將兔雙眼施行PRK。輸入切削深度80 μm，光學消融直徑5.6 mm。激光能量密度120 mJ/cm2，頻率50 Hz。手術由同一熟練手術醫(yī)生完成。術后2 d內每日雙眼滴可樂必妥眼藥水6次，晚間涂紅霉素眼膏。

1.4PRK術后活體觀察指標

1.4.1Haze分別于術后第1、2、4、8周的同一時間點用裂隙燈觀察并記錄Haze情況(依據(jù)Fantes分級標準，0級：角膜完全透明無混濁；Ⅰ級：在裂隙燈下用斜照法才能發(fā)現(xiàn)輕度點狀混濁；Ⅱ級：在裂隙燈下容易發(fā)現(xiàn)角膜混濁，但不影響觀察虹膜紋理；Ⅲ級：角膜混濁，影響觀察虹膜紋理；Ⅳ級：角膜明顯混濁，不能窺見虹膜紋理)。

1.4.2并發(fā)癥術后每日觀察有無角膜上皮損傷、結膜充血、前房出血等并發(fā)癥。

1.5病理檢查分別于術后1、4、8周采用心臟內注氣每組隨機處死用于病理檢查的實驗兔1只，并迅速摘除手術眼，取手術區(qū)10 mm×10 mm范圍全層角膜組織，于10%甲醛液中固定24 h。作垂直于12點角膜表面的垂直切片，做膠原染色及HE染色，顯微鏡下觀察術區(qū)角膜上皮愈合情況、膠原聚集排列情況、炎癥細胞及成纖維細胞情況。

1.6統(tǒng)計學分析采用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Wilcoxon檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1羊膜提取液顯微鏡觀察結果羊膜提取液離心前按常規(guī)涂片顯微鏡觀察，可見細胞完全破碎，細胞碎片均勻分布。

2.2PRK術后Haze觀察結果術后8周實驗組Haze等級為Ⅰ級；對照組Haze等級為Ⅱ級；空白組Haze等級為Ⅲ級，見圖1。術眼均在PRK術后1周左右開始出現(xiàn)程度不同的Haze，其發(fā)生率為100%，術后4周時Haze尤其明顯，直至術后8周。實驗組與對照組Haze等級情況進展比較緩慢，均未出現(xiàn)Ⅲ級，空白組Haze等級情況進展比較迅速，在術后1周時未出現(xiàn)Ⅲ級，而在術后8周時，2眼進展到Ⅲ級，見表1。術后各時間點實驗組和對照組Haze等級進展情況低于空白組，除術后1周實驗組、對照組與空白組Haze等級進展情況差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)外，其余各時間點實驗組與空白組、對照組與空白組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01或0.05)。實驗組與對照組術后各時間點Haze等級情況差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

A：羊膜提取液組；B：0.1%磷酸地塞米松眼液；C：不含羊膜提取液的賦形劑組圖1　3組實驗動物術后8周裂隙燈下Haze情況

組別術后時間術后Haze等級0級Ⅰ級Ⅱ級Ⅲ級Ⅳ級實驗組1周0111002周0111004周0102008周09300對照組1周0111002周0102004周084008周08410空白組1周084002周057004周038108周001020

表2　實驗動物術后各時間點Haze情況比較

2.3并發(fā)癥PRK術后早期，3組動物角膜熒光素鈉染色均為陽性，但多數(shù)角膜上皮缺損均在術后3 d修復，且羊膜組角膜上皮愈合速度較其他2組要快。3組動物均有結膜充血，多數(shù)在術后3～5 d恢復。均未發(fā)生角膜上皮持續(xù)缺損、角膜潰瘍等并發(fā)癥。

2.4術區(qū)病理切片檢查結果術后1周，實驗組角膜上皮完整，切削邊緣上皮稍厚，角膜細胞無明顯增生，上皮下可見少量成纖維細胞，見圖2A1、2A1′；對照組角膜上皮完整，角膜細胞無明顯增生，上皮和實質層存在局限性散在裂隙，上皮下可見少量成纖維細胞，見圖2A2、2A2′；空白組角膜上皮基本完整，上皮水腫、增厚，基底膜及淺層基質厚薄不均，上皮下可見大量成纖維細胞，見圖2A3、2A3′。術后4周，實驗組角膜上皮完整，切削邊緣上皮稍厚，角膜細胞無明顯增生，上皮下可見少量成纖維細胞，見圖2B1、2B1′；對照組角膜上皮完整，角膜細胞無明顯增生，上皮和實質層存在局限性散在裂隙，上皮下可見少量成纖維細胞，見圖2B2、2B2′；空白組角膜上皮基本完整，上皮水腫、增厚，基底膜及淺層基質厚薄不均，上皮下可見大量成纖維細胞，纖維排列紊亂，見圖2B3、2B3′。術后8周，實驗組角膜上皮完整，上皮下潛在腔隙，可見中少量成纖維細胞，見圖2C1、2C1′；對照組角膜上皮完整，角膜上皮輕度水腫、增厚，基底膜不連續(xù)，厚薄不均，上皮下可見中等量成纖維細胞，見圖2C2、2C2′；空白組角膜上皮基本完整，上皮水腫、增厚，基底膜及淺層基質厚薄不均，上皮下可見大量成纖維細胞，纖維排列紊亂，可見大量瘢痕形成，見圖2C3、2C3′。

3討論

3.1PRK術后Haze形成的原因及解決辦法PRK是角膜屈光手術的重大進展，從1983年Trokel等推出至今，因安全、高效、可預測而得到全世界廣泛應用，但是PRK術后仍然存在一些難以克服的問題，角膜Haze是其主要并發(fā)癥之一。

Haze是準分子激光術后切削區(qū)上皮和基質交界面出現(xiàn)的混濁。通常在術后10 d即可見到，3～6個月達到高峰，以后逐漸減輕[1]。Haze的存在，不僅影響視力，還是造成屈光回退的主要原因，因此影響PRK的安全性和穩(wěn)定性。

PRK術后Haze形成的主要原因：(1)手術創(chuàng)傷早期引起炎癥細胞浸潤，瘢痕形成的細胞因子大量表達，細胞因子相互作用造成成纖維細胞大量增殖、瘢痕形成，這是Haze生成的最直接原因[4-6]。(2)角膜上皮的機械性損傷可引起角膜表層基質細胞凋亡，凋亡的基質細胞可在幾天內由后層及周圍的基質細胞通過增生和遷移來代償，活化的基質細胞產生大量排列紊亂的膠原，導致角膜透明度的下降，瘢痕收縮，導致Haze形成及屈光改變的病理變化[7-10]。

A1～C1、A1′～C3′：實驗組；A2～C2、A2′～C2′：對照組；A3～C3、A3′～C3′：空白組。A1～A3、A1′～A3′：術后1周；B1～B3、B1′～B3′：術后4周；C1～C3、C1′～C3′：術后8周。A1～A3、B1～B3、C1～C3：膠原染色×100，A1′～A3′、B1′～B3′、C1′～C3′為HE染色×400；箭頭所指為成纖維細胞

圖2PRK術后手術區(qū)病理組織學切片結果

針對以上原因，為了減少PRK術后Haze的形成，目前有許多藥物用于PRK術后，降低了術后Haze的發(fā)生率及其程度。如腎上腺皮質激素、非甾體抗炎藥、抗代謝藥物。PRK術后局部應用糖皮質激素是最早也是應用最普遍的治療Haze的藥物[11]，其作用機制主要是減少DNA及蛋白質合成，降低角膜細胞活性及透明質酸含量，抑制成纖維細胞增生，同時還能夠抑制磷脂酶A產生，減少前列腺素的釋放，從而抑制炎性反應，阻止Haze的形成[12]。大量臨床實踐都證實了糖皮質激素的有效性。但是，也有研究對糖皮質激素的作用提出疑義，他們認為，角膜中氨基葡萄糖占主要成分，膠原蛋白相對缺乏，糖皮質激素對術后Haze的抑制作用非常有限，并且，長期應用糖皮質激素，會引起眼壓升高、白內障等并發(fā)癥，因此，糖皮質激素的使用仍存在爭議[13]。非甾體抗炎藥能抑制環(huán)氧化酶的活性，降低前列腺素濃度，減少花生四烯酸的產生，阻止成纖維細胞的生長、增生。PRK術后應用非甾體藥物，能避免應用激素引起的并發(fā)癥。Nassaralla等[14]通過實驗證實，雙氯芬酸能明顯減輕Haze的發(fā)生。關于非甾體抗炎藥的療效，各家說法不一，有研究認為，雙氯芬酸優(yōu)于糖皮質激素；而另一些研究認為，雙氯芬酸不如糖皮質激素作用明顯，但兩藥合用，效果更佳。但其缺點是局部刺激癥狀較重?？勾x藥物通過烷基化作用抑制細胞內DNA、RNA和蛋白質的合成，它能抑制成纖維細胞的增生和分化。絲裂霉素C(MMC)是臨床上研究最多、應用最廣的抗代謝藥物[15-16]。許多研究證實，MMC能有效抑制角膜細胞和成纖維細胞的增殖，明顯減輕Haze，提高角膜的透明度[17-18]。還有一些人主張，MMC與糖皮質激素合用，療效更明顯。但MMC不良反應大，在局部和全身應用均能產生嚴重并發(fā)癥，在翼狀胬肉和青光眼濾過手術的應用中，有許多關于MMC引起角膜上皮糜爛、劇烈疼痛、角膜溶解、鞏膜軟化、白內障、青光眼、眼內炎、低眼壓及黃斑變性的報道。對于MMC在PRK術中給藥的濃度、時間、給藥方法，各家報道不一，目前大多研究者采用在術中一次性用0.02%的MMC，但其安全性有待進一步證實[19]。

3.2目前羊膜在眼科中的應用及存在的問題人體的羊膜是胎盤的最內層，是體內最厚的基底膜。眾多研究表明其具有抗炎、抗纖維增殖、抗新生血管和促進上皮化等作用，又因為其無血管和淋巴組織，具有低免疫原性的特點。羊膜已被廣泛應用于眼表疾病的治療及眼表重建、結膜囊成形等手術中[2-3]。現(xiàn)今，國內外有術者將新鮮或低溫保存羊膜用于PRK術后以期抑制Haze的形成，已經取得了肯定的效果，擴大了羊膜在眼科中的應用范疇。

目前眼科臨床中對于羊膜的應用十分普遍，每年約有近百萬的眼表疾病患者受益于羊膜的使用。但因為新鮮羊膜難以隨時獲取，尤其對于沒有婦產科室的眼病?？漆t(yī)院更是如此；而目前羊膜的保存方法主要是保護液存在下的深低溫冷藏，大多數(shù)醫(yī)療機構難以負擔昂貴的冷藏設備。此外，由于新鮮羊膜和低溫保存羊膜都難以做到完全的消毒滅菌，存在著潛在的病毒及其他微生物感染的危險。這些均在一定程度上限制了其在眼科臨床中的應用。

3.3自制羊膜提取液實驗結果分析羊膜提取液的制備技術可以在保持生物制品中有效活性成分的同時使其可以較方便的保存，本研究利用該技術制備羊膜提取液，4 ℃條件下保存用于PRK術后，進而評估其在抑制Haze方面的效果。

結果發(fā)現(xiàn)羊膜提取液蛋白質濃度高，保留了分子量相對較小的大分子物質更利于作用于術區(qū)，促進術后上皮愈合，減輕炎性反應和自由基反應。并將4 ℃條件下保存的羊膜提取液用于兔眼PRK術后，觀察其抑制Haze形成及減小Haze程度中的作用。

本實驗結果顯示PRK術后，所有術眼均在術后1周開始出現(xiàn)程度不同的Haze，其發(fā)生率為100%，術后4周時Haze尤其明顯，直至術后8周。實驗組與對照組Haze等級情況進展比較緩慢，激素與羊膜提取液在抑制術后Haze形成作用上，有相似的正向作用(各時間點比較差異均無統(tǒng)計學意義)。與空白組相比較，實驗組術后抑制Haze形成及進展速度作用明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明羊膜提取液的存在可以起到一定的抑制Haze形成的作用。PRK術后早期，3組動物角膜上皮缺損均在術后3 d修復，且實驗組角膜上皮愈合速度較其他2組快。3組動物均有結膜充血，多數(shù)結膜充血在術后3～5 d恢復，均未發(fā)生角膜上皮持續(xù)缺損、角膜潰瘍等并發(fā)癥。說明自制的羊膜提取液在有效抑制Haze的同時，無可見并發(fā)癥的發(fā)生。且實驗組術區(qū)病理檢查顯示，未發(fā)生明顯的炎癥反應。

3.4羊膜提取液在抑制Haze形成中起作用的可能機制羊膜含有Ⅳ型膠原質、層粘連蛋白、整合素等多種成分，可能促進正常上皮化，上皮細胞與基質細胞通過細胞因子的相互作用，可以抑制成纖維細胞形成。羊膜成分與上皮基底膜和Bowman膜成分極其相似，對于維持角膜正常結構和功能具有重要作用。它在促進術后上皮愈合，減輕炎性反應和自由基反應，保護角膜基質細胞免受凋亡，減少成纖維細胞增生及細胞外基質合成，減輕Haze的形成可能有作用[20-22]。

3.5本項實驗的不足及進一步的研究方向本研究的初步結果表明自制羊膜提取液應用于兔眼PRK術后可在一定時期內有效抑制Haze的發(fā)生及程度。

本項研究還存在較多不足之處，本研究僅使用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，但不能排出潛在病毒感染的風險；如用于臨床，一種較好的臨床消毒方法有待進一步探討。

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Application of Self-made Amniotic Membrane Extraction in Rabbits after Photorefractive Keratectomy

ZHANG Bin

(Shenyang He Eye Hospital,Shenyang 110032,China)

AbstractObjective:To establish the model of photorefractive keratectomy(PRK) in rabbits，and to investigate the effect of self-made amniotic membrane extraction on corneal fog opacity(Haze) after PRK．Methods:The healthy human amniotic membrane was prepared according to the routine reference, epithelial cell was reserved，and to freeze thawing repeatedly and filter to obtain amniotic membrane extraction，then stored at the room temperature．A total of 54 eyes of 27 New Zealand white rabbits were operated by PRK in the same condition．All of the rabbits were randomly divided into experimental group,control group and blank group．There were 18 eyes of 9 rabbits in each group．Antibiotic eye drops were given for each group’s rabbits after PRK．Amniotic membrane extraction were given for experimental group’s rabbits，0.1% dexamethasone phosphate eye drops were given for control group’s rabbits and diluents bases without amniotic membrane extraction were given for blank group’s rabbits 48 h later．Postoperative clinical examine was done everyday.The Haze information was measured as the Fantes standard at 1,2,4,8 weeks．And 3 rabbits were selected randomly from each group for the pathologic examination，1 rabbit was killed in each group at 1,4,8 weeks after operation and extirpated the eyeball for pathologic observation，the information of the cornea,inflammatory cells and desmocyte were observed．Results:In the earlier period after PRK，the staining of cornea with fluorescein sodium in 3 groups were positive，but most of the corneal epithelium defection were repaired at 3 days after PRK.The incidence rate of Haze was 100% after PRK，all the eyes started to appear the Haze in 1 week after opertion，especially from 4 weeks to 8 weeks were severe．The degree of Haze in experimental group and control group were obviously less than the degree of Haze in blank group after operation(P<0.05).Conclusion:Amniotic membrane extraction has the role of promoting corneal epithelium recover，and can reduce the degree of Haze after PRK in rabbits．

Key wordsamniotic membrane extraction;corneal epithelium;photorefractive keratectomy;rabbits

收稿日期2015-06-16

doi:10.3969/j.issn.1008-2344.2015.04.003

中圖分類號R779.63

文獻標識碼A

文章編號1008-2344(2015)04-0200-06