二斑葉螨抗甲氰菊酯種群解毒酶基因表達(dá)分析

楊順義,岳秀利,王進(jìn)軍,劉長(zhǎng)仲，沈慧敏*，沈一凡,郭金梅

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)省部共建教育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心，甘肅 蘭州 730070；

2.西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆蟲(chóng)學(xué)及害蟲(chóng)控制工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400716)

二斑葉螨抗甲氰菊酯種群解毒酶基因表達(dá)分析

楊順義1**,岳秀利1**,王進(jìn)軍2,劉長(zhǎng)仲1，沈慧敏1*，沈一凡1,郭金梅1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)省部共建教育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心，甘肅 蘭州 730070；

2.西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆蟲(chóng)學(xué)及害蟲(chóng)控制工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400716)

摘要：基因mRNA水平相對(duì)表達(dá)量的顯著變化是二斑葉螨對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)藥劑產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制。為了揭示二斑葉螨對(duì)甲氰菊酯抗性產(chǎn)生的解毒酶分子機(jī)理，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)方法分析二斑葉螨實(shí)驗(yàn)室敏感(SS)和田間種群(LZ-R、GN-R、WW-R、TS-R和LX-R)主要解毒酶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione s-transferases, GSTs)、細(xì)胞色素P450單加氧酶(cytocheome P450 monooxygenases, P450s) 及羧酸酯酶(carboxyl/cholinesterases, CCEs)基因mRNA水平相對(duì)表達(dá)量的差異。結(jié)果表明,二斑葉螨不同種群不同解毒酶基因的相對(duì)表達(dá)量不同。WW-R和TS-R種群中TuGSTd05以及LX-R種群中TuGSTd01和 TuGSTd06基因表達(dá)量均顯著上調(diào)，為SS種群的1.42~2.34倍，而GN-R種群中TuGSTd04，LZ-R種群中TuGSTd05 和GSTd09表達(dá)量顯著下調(diào)，為SS種群的0.41~0.70倍；P450s基因CYP406A1 和CYP4CL1表達(dá)量在LZ-R、GN-R以及WW-R種群中均顯著上調(diào)，分別為SS種群的1.80~4.88倍，此外，CYP387A1在LZ-R種群中顯著上調(diào)2.19倍，而在LX-R種群中顯著下調(diào)0.42倍；CCEs基因TuCCE-35表達(dá)量在WW-R和TS-R種群中顯著上調(diào)，分別為SS種群的2.82和3.09倍，而TuCCE-36基因在所有種群中的表達(dá)量均不顯著。二斑葉螨不同種群中解毒酶基因GSTs、P450s 和CCEs的顯著上調(diào)或下調(diào)可能與甲氰菊酯的抗性形成有關(guān)。

關(guān)鍵詞：二斑葉螨；甲氰菊酯； 解毒酶； 表達(dá)水平； qRT-PCR

DOI：10.11686/cyxb2014321http://cyxb.lzu.edu.cn

楊順義, 岳秀利, 王進(jìn)軍, 劉長(zhǎng)仲， 沈慧敏， 沈一凡, 郭金梅. 二斑葉螨抗甲氰菊酯種群解毒酶基因表達(dá)分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(8): 150-158.

Yang S Y, Yue X L, Wang J J, Liu C Z, Shen H M, Shen Y F, Guo J M. Gene expression of a detoxification enzyme inTetranychusurticaeresistant to fenpropathrin. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(8): 150-158.

收稿日期：2014-07-21；改回日期：2015-01-14

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng) (201103020)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260442)資助。

作者簡(jiǎn)介：楊順義(1972-)，男，甘肅禮縣人，副教授，碩士。E-mail：yangshy@gsau.edu.cn。岳秀利(1988-)，男，山東滕州人，碩士。E-mail：yuexiuli.01@163.com.**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

通訊作者*Corresponding author. E-mail: ndshm@gsau.edu.cn

Gene expression of a detoxification enzyme inTetranychusurticaeresistant to fenpropathrin

YANG Shun-Yi1**, YUE Xiu-Li1**, WANG Jin-Jun2, LIU Chang-Zhong1, SHEN Hui-Min1*, SHEN Yi-Fan1, GUO Jin-Mei1

1.CollegeofPrataculture,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofGrasslandEcosystemEducationMinistry,TheSino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China; 2.CollegeofPlantProtection,SouthwestUniversity,ChinaKeyLaboratoryofEntomologyandPestControlEngineering,Chongqing400716,China

Abstract:The variation of mRNA gene expression is an important pyrethroid insecticide resistance mechanism in Tetranychus urticae. To identify the molecular mechanism for producing detoxification enzymes in T. urticaein response to fenpropathrin, the mRNA expression levels of glutathione s-transferases (GSTs), cytochrome (P450s) and carboxyl/cholinesterases (CCEs) genes in laboratory fenpropathrin susceptible (SS), fenpropathrin resistant (Sp-R) and field strains (LZ-R, GN-R, WW-R, TS-R and LX-R) of T. urticae were measured using quantitative real time PCR (qRT-PCR). The results showed that relative expression levels of different detoxification enzyme genes varied with different strains of T. urticae. Compared with the SS strain, the expression levels of TuGSTd05 in the WW-R and TS-R strains, TuGSTd01 and TuGSTd06 in the LX-R strain were significantly up-regulated,1.42-2.34 times greater than the SS strain, while TuGSTd04 in the GN-Rstrain, TuGSTd05 and TuGSTd09 in the LX-R strain were significantly down-regulated, 0.41-0.70 that of the SS strain. The expression levels of P450s genes CYP406A1 and CYP4CL1 in the LZ-R, GN-R and WW-R strains were significantly up-regulated, 1.80-4.88 times that of the SS strain. The expression level of P450s genes CYP387A1 in the LZ-R strain was also significantly higher (2.19 times) than the SS strain whereas that in the LX-R strain was significantly lower (0.42 times) than the SS strain. Similarly, the expression levels of CCEs gene TuCCE-35 in the WW-R and TS-R strains was significantly higher than the SS strain. However, the gene expression levels of TuCCE-36 did not change in all strains. The significant up-regulation or down-regulation of detoxification enzyme genes (GSTs, p450s and CCEs) among different strains of T. urticae may be associated with the formation of resistance to fenpropathrin.

Key words:Tetranychus urticae; fenpropathrin; detoxification enzymes; expression level; qRT-PCR

二斑葉螨(Tetranychusurticae)是一種重要的雜食性世界害螨，除危害糧食作物、果樹(shù)、花卉、蔬菜等以外，還可危害城市綠地植物及牧草等超過(guò)140科1100多種植物[1-3]。近年來(lái)，由于農(nóng)藥的大量且不合理使用，該物種對(duì)有機(jī)磷類(lèi)、氨基甲酸酯類(lèi)、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)等多種殺蟲(chóng)、殺螨劑的抗性發(fā)展十分迅速，并且產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性和交互抗性，被認(rèn)為是節(jié)肢動(dòng)物中最易產(chǎn)生抗性的害螨之一[4]。目前，二斑葉螨是甘肅省蔬菜和農(nóng)作物上的第一大害螨，嚴(yán)重影響著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

二斑葉螨對(duì)外源化合物解毒能力的增強(qiáng)是其對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性的重要機(jī)制。參與代謝抗性的解毒酶系主要包括谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione s-transferase, GSTs)，細(xì)胞色素P450單加氧酶(cytocheome P450 monooxygenases, P450s) 及羧酸酯酶(carboxylesterases, CCEs)等。Van Leeuwen等[5-6]研究表明酯酶(esterases, ESTs)和P450s解毒能力的增強(qiáng)介導(dǎo)著田間二斑葉螨抗聯(lián)苯菊酯種群高水平的抗藥性，也可能是二斑葉螨對(duì)阿維菌素敏感性降低的重要抗性機(jī)理[7]；Van Pottelberge等[8]報(bào)道二斑葉螨抗螺螨酯種群中GSTs活性顯著增加，為敏感種群的2.5倍。在分子水平上，二斑葉螨對(duì)甲氰菊酯的靶標(biāo)抗性研究也有所報(bào)道[9-10]，而二斑葉螨基因組的成功測(cè)序[1]更是促進(jìn)了其抗性分子機(jī)制研究。Demaeght等[11]研究報(bào)道在二斑葉螨田間抗性種群中，ESTs基因TuCCE04以及P450s基因CYP392E7和CYP392E10相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，并且螺螨酯能誘導(dǎo)CYP392E10基因的高表達(dá)，而CYP392E10基因?qū)β蒡ヒ灿写x作用。本實(shí)驗(yàn)室高新菊和沈慧敏[12]以及段辛樂(lè)等[13]從生理生化方面研究表明二斑葉螨對(duì)甲氰菊酯產(chǎn)生抗性可能與解毒酶活性的增強(qiáng)有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)在對(duì)甘肅地區(qū)5個(gè)二斑葉螨不同田間種群解毒酶活性研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)已報(bào)道的與二斑葉螨或昆蟲(chóng)抗性相關(guān)的關(guān)鍵解毒酶基因[11]，選取了二斑葉螨GSTs、P450s以及CCEs中共14個(gè)基因，采用qRT-PCR的方法，從生理生化和分子水平深入探討了其mRNA水平相對(duì)表達(dá)量的變化，旨在揭示二斑葉螨對(duì)甲氰菊酯產(chǎn)生抗性過(guò)程中主要解毒酶的分子機(jī)理，為二斑葉螨對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的抗性治理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1　供試螨類(lèi)

實(shí)驗(yàn)室種群：敏感種群(susceptible strain, SS)，2007年6月采自甘肅省蘭州市興隆山國(guó)家級(jí)森林公園[12]。

田間種群：2012年8月采自甘肅省5個(gè)不同地區(qū)的二斑葉螨種群，分別為蘭州種群(LZ-R)、甘南種群(GN-R)、武威種群(WW-R)、天水種群(TS-R)以及臨夏種群(LX-R)。

二斑葉螨SS、LZ-R、GN-R、WW-R、TS-R、LX-R種群飼養(yǎng)在養(yǎng)蟲(chóng)室盆栽的豇豆(Vignaunguiculata)苗上。控制條件：溫度(26±1)℃，相對(duì)濕度(75±5)%，光照14 h，黑暗10 h。

1.2　主要的試劑

考馬斯亮藍(lán)G-250(Fluka)，牛血清蛋白(上海源聚生物科技有限公司)，1-氯-2,4-二硝基苯(上海生工生物科技有限公司)，還原性谷胱甘肽(上海生工生物科技有限公司)，α-萘酚(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)，固藍(lán)B鹽(上海源葉生物科技有限公司)，RNA提取試劑盒RNeasy?Plus Micro Kit(Qiagen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimerScript?RT Reagent Kit Perfect Real time(Takara公司)，熒光染料GoTaq?qPCR Master Mix(Promega公司)。

1.3　毒力測(cè)定方法

二斑葉螨不同種群對(duì)甲氰菊酯的毒力測(cè)定方法采用FAO[14]推薦的玻片浸漬法(slide-dip method)并加以改進(jìn)。每個(gè)處理重復(fù)3次，分別計(jì)算出各種群致死中濃度(LC50)，并以SS種群為對(duì)照，計(jì)算出LZ-R、GN-R、WW-R、TS-R和LX-R種群的抗性倍數(shù)，抗性倍數(shù)=抗性種群LC50/敏感種群LC50。

1.4　解毒酶活性分析

二斑葉螨不同種群的酶源蛋白含量測(cè)定參照Bradford[15]的方法，GSTs活性測(cè)定參照Clark等[16]的方法，P450s活性測(cè)定參照Hansen和Hodgson[17]的方法，CCEs活性測(cè)定參照Van Asperen[18]的方法。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)和對(duì)照，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行OD值的測(cè)定。

1.5　總RNA提取及第一鏈cDNA的合成

分別選取二斑葉螨SS、LZ-R、GN-R、WW-R、TS-R和LX-R共6個(gè)種群雌成螨約400頭，按照RNeasy?Plus Micro Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各種群總RNA。對(duì)總RNA進(jìn)行1%的瓊脂糖電泳膠電泳檢測(cè)完整性。選取OD260/280在1.8~2.2之間的RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，具體步驟參照PrimerScript?RT Reagent Kit Perfect Real time試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6　引物的設(shè)計(jì)

參照二斑葉螨在線基因組信息(http://bioinformatics.psb.ugent.be/orcae/overview/Tetur)設(shè)計(jì)用于GSTs、P450s及CCEs相關(guān)解毒酶基因qRT-PCR研究的引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1　本研究所用的qRT-PCR定量引物及相關(guān)信息

注：“F”表示正向序列，“R”表示反向序列。

Note: “F” and “R” indicate forward and reverse sequence, respectively.

1.7　qRT-PCR分析

qRT-PCR反應(yīng)體系為：10 μL熒光染料GoTaq?qPCR Master Mix，7 μL 雙蒸水，上下游引物各1 μL，cDNA模版1 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min；然后95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s共40個(gè)循環(huán)；最后60℃到95℃為熔解曲線過(guò)程。然后將cDNA模板按1∶3梯度稀釋成5個(gè)濃度梯度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，并計(jì)算不同引物的擴(kuò)增效率(表1)。對(duì)照用已經(jīng)處理過(guò)的滅菌水代替cDNA模板當(dāng)做空白對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.8　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用DPS 6.05軟件對(duì)二斑葉螨LZ-R、GN-R、WW-R、TS-R和LX-R種群的酶活性進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan新復(fù)極差法(DMRT，P<0.05)進(jìn)行多重比較；采用比較Ct值的方法[19]，以SS種群的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照樣品，分別計(jì)算其不同種群解毒酶基因相對(duì)表達(dá)量的差異，利用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-samplestTest，P<0.05)。

2結(jié)果與分析

2.1　二斑葉螨不同種群抗性倍數(shù)測(cè)定

二斑葉螨不同地理種群的采集信息及生物測(cè)定結(jié)果如表2所示，相對(duì)于SS種群，在田間采集的5個(gè)種群中，GN-R的抗性倍數(shù)最大，達(dá)到60.53倍，而LZ-R，WW-R，TS-R和LX-R種群的抗性倍數(shù)相對(duì)較低，為22.50~27.38倍。

表2　二斑葉螨所有種群來(lái)源及抗性倍數(shù)

2.2　二斑葉螨不同種群解毒酶活性的變化

2.2.1不同種群GSTs活性測(cè)定結(jié)果GSTs活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)田間采集的5個(gè)種群及室內(nèi)SS種群GSTs總活力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)TS-R種群GSTs總活力最高，為1.62 μmol/min；GN-R種群GSTs總活力最低，為0.72 μmol/min；與SS種群相比，LZ-R和GN-R種群的總活力均低于SS種群；而其他種群GSTs總活力顯著高于SS種群(P<0.05)。

TS-R和LX-R種群GSTs比活力分別為1331.69和1342.56 μmol/(mg·min)，彼此之間差異不顯著，但顯著高于SS種群，為SS種群的1.34和1.35倍。同SS種群相比，LZ-R、GN-R和WW-R種群的GSTs比活力沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。

2.2.2不同種群P450s活性測(cè)定結(jié)果P450s活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。TS-R種群P450s總活力和比活力最高，分別為0.0020 nmol/min和0.0109 nmol/(mg·min)；LZ-R種群的總活力和比活力最低，分別為0.0013 nmol/min和0.0074 nmol/(mg·min)。DMRT分析顯示，TS-R種群P450s比活力顯著高于其他種群，其中與SS種群的相對(duì)比值為1.47；而其他田間種群與SS種群相比差異不顯著(P>0.05)。

2.2.3不同種群CCEs活性測(cè)定結(jié)果CCEs活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。與SS種群相比，5個(gè)田間種群的CCEs總活力和比活力均有顯著性升高，而田間5個(gè)種群之間的總活力和比活力差異不顯著(P>0.05)。CCEs總活力從大到小依次為：LZ-R種群、LX-R種群、WW-R種群、TS-R種群、GN-R種群、SS種群，但TS-R種群的CCEs的比活力在5個(gè)田間種群中最低，為18.75 nmol/(mg·min)。LZ-R種群、GN-R種群、WW-R種群、TS-R種群和LX-R種群CCEs比活力同SS種群的相對(duì)比值分別為1.56，1.36，1.45，1.33和1.44。

表3　二斑葉螨不同地理種群GSTs活性測(cè)定

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)注不同小寫(xiě)字母代表存在顯著性差異(Duncan新復(fù)極差法，P<0.05)。下同。

Note: Data followed by different letters within the same column indicate significantly different at 0.05 level by using the method of Duncan’s multiple range test. The same below.

表4　二斑葉螨不同地理種群P450s活性測(cè)定

表5　二斑葉螨不同地理種群CCEs活性測(cè)定

2.3　二斑葉螨不同種群解毒酶基因相對(duì)表達(dá)量的變化

2.3.1不同種群GSTs基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定以α-tubulin為內(nèi)參基因[20]，分析二斑葉螨不同種群Delta家族GSTs基因TuGSTd01、TuGSTd04、TuGSTd05、TuGSTd06、TuGSTd09和TuGSTd16 mRNA水平相對(duì)表達(dá)量，敏感種群的表達(dá)量默認(rèn)為1，結(jié)果如圖1所示。TuGSTd01表達(dá)量在LX-R種群中顯著升高，為SS種群的1.63倍；TuGSTd05表達(dá)量在WW-R和TS-R種群中顯著升高1.42和1.49倍，而在LZ-R種群中卻顯著降低；TuGSTd06表達(dá)量在LX-R種群中顯著升高2.34倍；TuGSTd04 和TuGSTd09表達(dá)量分別在GN-R種群和LZ-R種群中顯著降低，分別為SS的0.41和0.46倍；TuGSTd16的表達(dá)量在所有種群中沒(méi)有顯著變化。

圖1　二斑葉螨不同種群GSTs基因相對(duì)表達(dá)量Fig.1　The GSTs gene relative expression levels in different strains of T. urticae　“*”表示顯著水平(P<0.05)；“**”表示極顯著水平(P<0.01)?！?” and “**”indicate significantly correlation at the level of 0.05 and 0.01 respectively. 下同。The same below.

2.3.2不同種群P450s基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

二斑葉螨不同種群P450s基因相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果如圖2 所示，CYP406A1、CYP4CL1和CYP387A1基因?qū)儆贑YP4家族，CYP392A6、CYP392D8和CYP392E10基因?qū)儆贑YP2家族。CYP406A1 和CYP4CL1表達(dá)量在LZ-R、GN-R以及WW-R種群中均顯著升高，分別為SS種群的2.82，1.85，3.37和4.88，1.80，3.88倍，CYP387A1表達(dá)量在LZ-R種群中顯著升高2.19倍，但在LX-R種群中卻顯著下調(diào)0.42倍；然而，CYP2家族的3個(gè)基因在所有的種群中均沒(méi)有顯著的變化。

圖2　二斑葉螨不同種群P450s基因相對(duì)表達(dá)量Fig.2　The P450s gene relative expression levels in different strains of T. urticae

2.3.3不同種群CCEs基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定二斑葉螨不同種群CCEs基因相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果如圖3 所示，TuCCE-35和TuCCE-36基因均屬于羥基膽堿酯酶。在所有種群中，只有WW-R和TS-R種群的TuCCE-35基因表達(dá)量顯著升高，為SS種群的2.82和3.09倍，在LX-R種群中更是達(dá)到了5.05倍，但差異不顯著；TuCCE-36基因在所有種群中的表達(dá)量均不顯著。

圖3　二斑葉螨不同種群CCEs基因相對(duì)表達(dá)量Fig.3　The CCEs gene relative expression levels in different strains of T. urticae

3討論

代謝抗性是害螨(昆蟲(chóng))對(duì)殺螨(蟲(chóng))劑敏感性降低的重要抗性機(jī)制，而涉及與代謝抗性相關(guān)的主要解毒酶類(lèi)包括GSTs、P450s和CCEs等。本研究通過(guò)對(duì)田間5個(gè)不同種群主要解毒酶活性的分析，發(fā)現(xiàn)解毒酶活性的高低與各地理種群的抗性水平之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性，但與室內(nèi)SS種群相比，TS-R和LX-R種群GSTs比活力、TS-R種群P450s比活力以及所有田間種群CCEs的比活力均顯著升高(P<0.05)，這與本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)二斑葉螨對(duì)甲氰菊酯抗性的產(chǎn)生與相應(yīng)的解毒酶活力增強(qiáng)有關(guān)結(jié)果一致[12]。Van Pottelberge等[8]通過(guò)酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)酯酶、GSTs和P450s參與了對(duì)螺螨酯的解毒代謝。同樣，解毒酶活性的增強(qiáng)在Tirello等[21]研究二斑葉螨抗吡螨胺、阿維菌素等種群中也有相關(guān)報(bào)道。Niu等[22]在研究柑橘全爪螨(Panonychuscitri)9個(gè)不同地理種群與噠螨靈敏感性中發(fā)現(xiàn)，GSTs參與了其對(duì)噠螨靈的田間抗性。He等[23]在研究朱砂葉螨(Tetranychuscinnabarinus)對(duì)阿維菌素的抗性機(jī)制中也發(fā)現(xiàn)3種解毒酶解毒活力的增強(qiáng)在其抗性發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。Zhong等[24]指出中華按蚊(Anophelessinensis)對(duì)溴氰菊酯的抗性產(chǎn)生與靶標(biāo)擊倒抗性和P450s的活性有關(guān)，并且P450s的作用尤為明顯。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，對(duì)害螨及昆蟲(chóng)抗藥性相關(guān)的GSTs、P450s和CCEs的研究已逐步深入到基因表達(dá)及功能上。本研究qRT-PCR結(jié)果也表明不同田間種群GSTs、P450s和CCEs各家族部分基因的表達(dá)量有所升高，與生理生化水平上對(duì)解毒酶的活性變化研究結(jié)果基本一致。Demaeght等[11]采用基因芯片技術(shù)比較了二斑葉螨敏感和抗螺螨酯種群，發(fā)現(xiàn)CCEs、P450s以及脂籠蛋白基因表達(dá)量均顯著的上調(diào)，其中CYP392E10在催化代謝螺螨酯的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。Riveron等[25]研究不吉庫(kù)蚊(Anophelesfunestus)對(duì)氯菊酯抗性的產(chǎn)生主要是由于CYP6P9a和CYP6P9b基因的過(guò)量表達(dá)引起的，功能分析表明重組的CYP6P9b蛋白對(duì)I型和II型的擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥均有代謝作用。

目前，隨著二斑葉螨基因組的成功測(cè)序[1]，其靶標(biāo)抗性[26]和代謝抗性的研究逐漸上升到分子水平研究領(lǐng)域，極大地促進(jìn)了害螨的防治及抗性治理[27]，并且基于高通量測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組分析[28]和全基因組[29]分析在其他物種作用機(jī)制的研究中也逐漸得到大量應(yīng)用。然而，二斑葉螨基因組中有32個(gè)GSTs，86個(gè)P450s及 71個(gè)CCEs基因[1]，本試驗(yàn)只是研究了其中的14個(gè)解毒基因，雖然結(jié)果不能反應(yīng)全部解毒酶家族mRNA表達(dá)水平的變化，但是為進(jìn)一步研究二斑葉螨抗甲氰菊酯解毒酶的分子機(jī)理提供了依據(jù)。

本研究分別從生理生化水平和分子水平分析二斑葉螨不同地理種群GSTs、P450s和CCEs超家族酶的活性變化及基因的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)抗性種群GSTs、P450s和CCEs的活性和基因表達(dá)量均發(fā)生不同程度的變化。GSTs基因TuGSTd01、TuGSTd04、TuGSTd05、TuGSTd06和TuGSTd09，P450s基因CYP406A1、CYP4CL1和CYP387A1以及CCEs基因TuCCE-35基因表達(dá)的顯著上調(diào)或下調(diào)可能參與了抗性的分子解毒作用，與二斑葉螨對(duì)甲氰菊酯的抗性形成有關(guān)。

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