甘肅省高寒草原牧草孢囊線蟲的鑒定

李惠霞，彭煥，彭德良，朱銳東，徐鵬剛，李建榮

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

甘肅省高寒草原牧草孢囊線蟲的鑒定

李惠霞1，彭煥2，彭德良2，朱銳東1，徐鵬剛1，李建榮1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

摘要：2013年8月下旬，對(duì)甘肅天祝高寒草甸草原孢囊線蟲發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，從嵩草和矮嵩草根部和根際土樣中分離得到孢囊線蟲。通過對(duì)孢囊和孢囊陰門錐的形態(tài)觀察，初步鑒定為禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae)。其特征為孢囊淺褐色，闊檸檬形，陰門錐雙膜孔，未見陰門下橋，泡狀突明顯。利用通用引物AB28和TW81對(duì)其群體rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，得到ITS區(qū)序列長度為1045 bp。將所測(cè)得序列在Genbank和Blast上比對(duì)，結(jié)果顯示，此禾谷孢囊線蟲群體與H. avenae群體相似度達(dá)99%～100%。進(jìn)一步證實(shí)寄生于甘肅天祝高寒草甸草原嵩草和矮嵩草的孢囊線蟲均為H. avenae，這是首次報(bào)道莎草科嵩草和矮嵩草也是禾谷孢囊線蟲的寄主。

關(guān)鍵詞：高寒草甸草原；禾谷孢囊線蟲；嵩草；矮嵩草

DOI：10.11686/cyxb2014372http://cyxb.lzu.edu.cn

李惠霞，彭煥，彭德良，朱銳東，徐鵬剛，李建榮. 甘肅省高寒草原牧草孢囊線蟲的鑒定. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(8): 174-180.

Li H X, Peng H, Peng D L, Zhu R D, Xu P G, Li J R. Identification of cyst nematode in alpine meadow steppe, Gansu. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(8): 174-180.

收稿日期：2014-09-02；改回日期：2014-12-25

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31460463)和草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué))開放課題基金(CYZS-2011010)資助。

作者簡(jiǎn)介：李惠霞(1972-)，女，甘肅天水人，副教授。E-mail:lihx@gsau.edu.cnIdentification of cyst nematode in alpine meadow steppe, Gansu

LI Hui-Xia1, PENG Huan2, PENG De-Liang2, ZHU Rui-Dong1, XU Peng-Gang1, LI Jian-Rong1

1.CollegeofPrataculturae,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China; 2.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPest,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China

Abstract:A survey of grass cyst nematodes in Tianzhu alpine meadow steppe, Gansu Province was conducted in August, 2013. Cyst nematodes were isolated from the roots and root rhizosphere of Kobresia sp. and Kobresia humilis. The nematodes were initially identified as Heterodera avenae based on cyst characteristics, particularly the cyst vulva cones. The cysts were light brown, large lenmon-shaped and contained vulva cones with bifenestrate and obvious bullae and without a vulva under-bridge. The 1045 bp sequence fragment of ITS region was amplified using PCR with general primers AB28 and TW81. The similarities between these groups and H. avena were 99%-100%. Molecular analysis confirmed that the cyst nematodes isolated from Kobresia sp. and Kobresia humilis growing in Tianzhu alpine meadow steppe were H. avenae. This is the first report identifying Kobresia sp. and Kobresia humilis as hosts of H. avenae.

Key words:alpine meadow steppe; cereal cyst nematode; Kobresia sp.; Kobresia humilis

禾谷孢囊線蟲(Heterodera)是一類危害小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)、燕麥(Avenasativa)等禾谷類作物的世界性重要病原線蟲。屬于復(fù)合種群組，包括12 個(gè)有效種，其中禾谷孢囊線蟲(Heroderaavenae)，菲利普孢囊線蟲(H.filipjevi)和麥類孢囊線蟲(H.latipons)是最為常見且最具經(jīng)濟(jì)重要性的種[1-3]。H.avenae是溫帶地區(qū)禾谷類植物上最重要的，也是世界上分布最廣的種[1,4]。目前，H.avenae在我國湖北、河南、河北、山東、山西、青海、內(nèi)蒙古、北京、安徽、陜西、甘肅、江蘇、寧夏、天津、新疆和西藏等16個(gè)省市自治區(qū)分布報(bào)道的小麥禾谷孢囊線蟲主要為該種[5-12]。H.filipjevi分布在歐洲、美洲和中亞[2,8]，彭德良等[13]在河南省臨潁、許昌、衛(wèi)輝和延津發(fā)現(xiàn)H.filipjevi。H.latipons主要分布在地中海地區(qū)[2,14-15]，我國尚未見報(bào)道。

禾谷孢囊線蟲除危害小麥、大麥和燕麥，齊淑華等[16]報(bào)道禾谷孢囊線蟲可危害青稞(Hordeumvulgarevar.nudum)。王明祖等[17]的研究表明除小麥、裸大麥(Hordeumsativumvar.hexastichon)、米大麥(Hordeumvulgare)、家燕麥(Avenasativa)、野燕麥(Avenafatura)外，黑麥草(Loliumperenne)、鵝觀草(Roegneriakanoji)、葦狀羊茅(Festucaelatiorvar.arundinucea)、球莖草蘆(Phalaristuberosa)和鴨茅(Dactylisglomerata)等禾本科植物也是該線蟲的良好寄主。這些多年生的禾本科植物作為禾谷孢囊線蟲的中間寄主或橋梁寄主存在于麥類作物田間。西北農(nóng)牧交錯(cuò)帶分布最廣，面積最大的，是以各種針茅為主的叢生禾草高寒草原，以紫花針茅(Stipapurpurea)和坐花針茅(S.subssesiliflora)為主的典型草原，還有以戈壁針茅(S.gobica)和沙生針茅(S.glareosa)為主的荒漠草原，以嵩草屬(Kobresiasp.)為建群種的草甸草原，其建群的群系主要為禾草和莎草，而這些牧草很可能也是禾谷孢囊線蟲的寄主。但對(duì)于農(nóng)牧交錯(cuò)帶禾谷孢囊線蟲對(duì)牧草的寄生情況了解甚少，因此，針對(duì)寄生于牧草的孢囊線蟲的種類、交叉侵染、生態(tài)分布多樣性進(jìn)行研究，顯得尤為重要。

rDNA-ITS序列是一個(gè)多用途的遺傳標(biāo)記，常用 ITS-RFLP(internal transcript space-restriction fragment length polymorphism)分析線蟲不同群體的差異及多態(tài)性。Subbotin等[18]研究了70個(gè)H.avenae復(fù)合種群的ITS-RFLP 圖譜，揭示出H.avenae是一個(gè)并系分類群, 中國禾谷孢囊線蟲不同于其他的H.avenae群體。彭德良等[19]對(duì)7個(gè)國內(nèi)種群與摩洛哥種群做RFLP分析,發(fā)現(xiàn)我國部分群體屬于“B ”型。歐師琪等[20]用6種限制性內(nèi)切酶酶切發(fā)現(xiàn)，陜西禾谷孢囊線蟲群體和青海群體、河南群體不完全一致，呈現(xiàn)豐富的多樣性。上述國內(nèi)外的研究充分說明我國不同地域H.avenae群體間rDNA-ITS具有豐富的多樣性。

綜上所述，近年來，麥類作物孢囊線蟲的研究得到廣泛重視，但對(duì)于農(nóng)牧交錯(cuò)帶禾谷孢囊線蟲對(duì)麥類和牧草的寄生情況了解甚少，因此，針對(duì)寄生于牧草的孢囊線蟲的種類多樣性進(jìn)行研究，顯得尤為重要。本文利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段相結(jié)合的方法對(duì)天祝高寒草甸草原的針茅(Stipacapillata)、披堿草(Elymusdahuricus)、嵩草和矮嵩草(Kobresiahumilis)孢囊線蟲進(jìn)行鑒定，以期明確天祝草原孢囊線蟲的種類。

1材料與方法

1.1　線蟲的采集

于2013年8月牧草生長季在甘肅省天祝高寒草甸草原不同地點(diǎn)進(jìn)行采樣。采用“Z”字形法采集受害牧草根及根際土壤，每點(diǎn)采取5~20 cm深處的土樣500~1000 g，充分混勻，取其中的500~1000 g作為一個(gè)標(biāo)樣，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行線蟲分離。具體采樣信息見表1。

1.2　線蟲的分離方法

采用簡(jiǎn)易漂浮法進(jìn)行孢囊的分離，取200 g土樣用強(qiáng)水流沖洗，攪動(dòng)，沉淀片刻，將混合物通過20目(850 μm) 和60目(250 μm)的樣品篩，重復(fù)以上步驟3次。再用小水流輕輕清洗60目(250 μm)篩上殘余物，將其淋洗入三角瓶中，用濾紙過濾收集，4℃冷藏備用。

1.3　孢囊線蟲標(biāo)本的制作

1.3.1二齡幼蟲標(biāo)本的制作將二齡幼蟲置于60℃水浴2 min，進(jìn)行熱殺死，用三乙醇胺-福爾馬林液(TAF)固定過夜。用吸管汲取一滴浮載劑滴于潔凈載玻片中央。在體視顯微鏡下用挑針將固定好的二齡幼蟲挑至載玻片中央的浮載劑中。選取與線蟲蟲體直徑相似的3根5 mm左右的支撐物，均勻置于浮載劑邊緣，將烤熱的蓋玻片蓋于浮載劑上，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。在體視顯微鏡下用裁成小條的濾紙吸取多余的浮載劑。然后用封片劑封片。待封片劑干后，貼上標(biāo)簽，即可用于短時(shí)間形態(tài)的觀察、拍照并測(cè)量。

1.3.2孢囊陰門錐標(biāo)本的制作用細(xì)毛筆挑取飽滿孢囊置于載玻片的水滴中，在體視顯微鏡下用鋒利的解剖刀切下孢囊陰門錐部分。用毛針或竹針仔細(xì)清除陰門錐內(nèi)附著物，用刀適當(dāng)修正陰門錐邊緣，最好使陰門錐的高度不超過陰門窗區(qū)域?qū)挾鹊?0~15倍。將切下的陰門錐用40%雙氧水處理數(shù)分鐘。將陰門錐移至載玻片的水滴中，用凡士林封片制成臨時(shí)玻片。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)的觀察、拍照、測(cè)量及參照王明祖等[17]的方法鑒定。

1.4　孢囊線蟲DNA的提取

從檢出孢囊的樣品中，挑取飽滿的孢囊，參考彭德良等[11]的方法提取孢囊線蟲的DNA，將單個(gè)孢囊放入Eppendorf管中，加入10 μL滅菌重蒸水、7 μL的10×PCR-buffer(含Mg2+)、3 μL蛋白酶K(600 μg/mL)，在液氮中速凍1 min，取出后用75%乙醇消毒的玻璃棒研磨1~2 min后，置于-20℃冷凍至少2 h。之后，將Eppendorf管置于65℃下溫育1.5 h，95℃10 min，4℃至少5 min。最后，12000 r/min離心1 min。取DNA上清液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5　rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增

反應(yīng)采用50 μL體系，10×PCR-buffer(含Mg2+)5.0 μL，dNTPs 4 μL，引物TW81 (GTTTCCGTAG GTGAACCTGC)1 μL，引物AB28 (ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT)1 μL，ExTaq DNA Polymerase(5 U/μL)1 μL，模板DNA 3.0 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足到50 μL，同時(shí)設(shè)置無DNA模板的陰性對(duì)照。在Eppendorf PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1.5 min，循環(huán)35次，72℃延伸10 min，4℃ 5 min，最后-20℃保存。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加2 μL 6×Loading buffer在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用0.5×TAE電泳緩沖液，120 V電泳40 min，EB染色，在BIO-RAD成像儀紫外光燈下觀測(cè)并照相。

1.6　rDNA-ITS區(qū)域PCR產(chǎn)物的回收純化、克隆、測(cè)序和序列分析

將上述電泳后的目的條帶切下，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN)按步驟進(jìn)行回收純化。取4 μL純化后的產(chǎn)物與6 μL pMD18-T vector在16℃連接4 h，然后將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，用熱擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)化后均勻涂在含有Ampicillin (100 mg/L)、IPTG(24 mg/L)和X-gal(200 mg/L)的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基平板上，之后倒置在37℃培養(yǎng)箱中12～16 h，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取單個(gè)白斑于含有Ampicillin(100 mg/L)的液體LB中置于37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，經(jīng)菌液PCR鑒定后,將含有正確片段的菌液進(jìn)行測(cè)序。所得序列用Chromas、DNAMAN分析比對(duì)，在GenBank注冊(cè)，并在NCBI下載已知近緣種序列，用MEGA 5.2中的UPGMA法構(gòu)建禾谷孢囊線蟲群體的系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

2結(jié)果與分析

2.1　孢囊線蟲發(fā)生情況

采集到不同地點(diǎn)禾本科牧草的20份根部和根際土樣，其中嵩草和矮嵩草根部觀察到寄生于根部的白色雌蟲(圖1)，并從其根際土樣中分離得到2個(gè)淺褐色孢囊群體，每100 g土樣中孢囊數(shù)分別為36個(gè)和54個(gè)。孢囊密度較高，表明嵩草和矮嵩草是其良好寄主。但在針茅和披堿草根部均未觀察到白雌蟲，根際土樣也未分離到孢囊(表1)。

2.2　孢囊線蟲的形態(tài)鑒定

對(duì)收集自嵩草和矮嵩草的2個(gè)孢囊線蟲群體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察(圖1)，孢囊檸檬形，頸部明顯，呈淺褐色，孢囊長(584.1±63.2) μm(472～691 μm)；孢囊寬(451.9±56.9) μm(264～519 μm)。陰門錐膜孔為雙膜孔，無下橋，陰門裂清晰可見。形態(tài)測(cè)量值分別為：陰門膜孔長(29.2±2.4) μm(25～32 μm)；膜孔寬(14.3±1.5) μm(12～17 μm)；陰門裂長(8.9±1.6) μm(7～11 μm)，且陰門錐下方有較多泡狀突。二齡幼蟲都為線形，唇區(qū)圓，與身體連接處縊縮明顯，口針強(qiáng)壯，中食道球發(fā)達(dá)。尾部呈錐形，有較長的透明區(qū)，其相關(guān)形態(tài)測(cè)量值為：線蟲體長(382.4±28.9) μm(314.1～421.9 μm)；線蟲體寬(22.7±2.1) μm(19.5～26.9 μm)；體長/蟲體最寬處體寬(17.0±1.9) μm(14.1～20.0 μm)； 體長/尾長(10.4±1.6) μm(7.0～11.6 μm)；尾長(37.3±5.8) μm(28.7～58.6 μm)；透明尾長(27.3±5.7) μm(19.1～36.6 μm)。受精卵長(108.4±6.5) μm(97.1～121.1 μm)；受精卵寬(48.2±5.0) μm(40.2～55.9 μm)；卵量(粒/孢囊) (231.5±36.9) (196～311)。根據(jù)上述形態(tài)觀察和測(cè)量值，參考文獻(xiàn)[21-23]，將分離自甘肅天祝嵩草和矮嵩草的孢囊群體鑒定為禾谷孢囊線蟲(H.avenae)。

表1　甘肅省天祝高寒草甸牧草孢囊線蟲發(fā)生情況

嵩草Kobresiasp., 矮嵩草K.humilis.

圖1　孢囊線蟲形態(tài)特征Fig.1　Illustration of cereal cyst nematode　A.淺褐色孢囊Cyst；B.受精卵Eggs；C,D.陰門膜孔Fenestra area；E,F.泡狀突Ballae；G.二齡幼蟲頭部Head of second-stage juvenile；H.二齡幼蟲尾部Tail of second-stage juvenile；I.矮嵩草K. humilis.

2.3　rDNA-ITS區(qū)序列分析

將采集自嵩草和矮嵩草的2個(gè)孢囊線蟲群體編號(hào)為群體Ⅰ和群體Ⅱ，從群體Ⅰ隨機(jī)挑選10個(gè)飽滿的孢囊，編號(hào)依次為GS1~GS10，從群體Ⅱ隨機(jī)挑選10個(gè)飽滿的孢囊，編號(hào)依次為GS11~GS20。以AB28和TW81為引物，對(duì)上述2個(gè)孢囊線蟲群體rDNA-ITS進(jìn)行擴(kuò)增，得到所有片段長多約為1000 bp，陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶出現(xiàn)(圖2,圖3)。

圖2　甘肅天祝嵩草和矮嵩草孢囊線蟲群體Ⅰ的rDNA-ITS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2　PCR products of rDNA-ITS of cyst nematodes population Ⅰfrom Kobresia sp., K. humilis in Tianzhu of Gansu M:Maker(DL2000)；N：陰性對(duì)照Negative control; 1~10: GS1, GS2, GS3, GS4, GS5, GS6, GS7, GS8, GS9, GS10.

圖3　甘肅天祝嵩草和矮嵩草孢囊線蟲群體ⅡrDNA-ITS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3　PCR products of rDNA-ITS of cyst nematodes population Ⅱfrom Kobresia sp., K. humilis in Tianzhu of Gansu M:Maker(DL2000); N: 陰性對(duì)照Negative control; 11~20: GS11, GS12, GS13, GS14, GS15, GS16, GS17, GS18, GS19, GS20.

將PCR產(chǎn)物經(jīng)回收，純化，克隆和測(cè)序，最終得到長度均為1045 bp的ITS序列，將序列提交Genbank并與NCBI下載的ITS序列進(jìn)行Blast比對(duì)，這些序列分別包括Avenae組的有效種(澳大利亞的H.australis，中國、法國、德國、以色列、印度的H.avenae，德國的H.mani，美國的H.filipjevi，英國的H.arenaria)、Schachtii組(伊朗的H.glycines、比利時(shí)的H.schachtii)、Goettingiana組(德國的H.goettingiana、荷蘭的H.cruciferae、意大利的H.carotae)和比利時(shí)H.urticae。用MEGA5.2的UPGMA方法構(gòu)建ITS區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。

圖4　UPGMA法構(gòu)建的甘肅天祝高寒草甸

H.avenae，禾谷孢囊線蟲；H.mani，稀少孢囊線蟲；H.filipjevi，菲利普孢囊線蟲；H.arenaria，蚤綴孢囊線蟲；H.glycines，大豆孢囊線蟲；H.schachtii，甜菜孢囊線蟲；H.goettingiana，豌豆孢囊線蟲；H.urticae，蕁麻孢囊線蟲；H.cruciferae，十字花科孢囊線蟲；H.carotae，胡蘿卜孢囊線蟲.橫線上數(shù)字為置信度。Numbers on the line indicate degree of confidence.聚類分析結(jié)果表明，所有的序列聚為3個(gè)大的分支，其中本研究中的9個(gè)禾谷孢囊線蟲群體與上述Avenae組的10個(gè)群體聚為一個(gè)大的分支，H.glycines和H.schachtii聚為一分支，其置信度為100。Goettingiana組3個(gè)群體和H.urticae為一類。在Avenae組的分支中，本研究線蟲群體與中國的禾谷孢囊線蟲和澳大利亞的H.australis群體聚為一個(gè)小的分支，其他國家的H.avenae聚在另外一個(gè)小的分支中。

3討論

孢囊線蟲病在我國的分布逐年擴(kuò)大，已成為小麥的重要病害，嚴(yán)重威脅我國糧食的安全生產(chǎn)。農(nóng)牧交錯(cuò)帶農(nóng)業(yè)種植區(qū)與草原畜牧區(qū)相連接的生態(tài)過渡地帶，又稱半農(nóng)半牧區(qū)或生態(tài)脆弱帶。在過渡帶內(nèi)，種植業(yè)和草地畜牧業(yè)在空間上交錯(cuò)分布，具有生態(tài)多樣性和復(fù)雜性。西北農(nóng)牧交錯(cuò)帶是遏制西北荒漠化、沙化東移和南下的生態(tài)屏障。處于甘肅中部的天祝高寒草甸草原(東經(jīng)102°01′-103°40′，北緯36°45′-37°54′)是半農(nóng)半牧區(qū)，麥類作物及禾草種類多樣。本研究采集高寒草甸牧草(針茅、披堿草和矮嵩草)根部及根際土壤，觀察根部并分離樣品中的孢囊。其結(jié)果顯示，采自嵩草和矮嵩草根際土樣中分離到孢囊，在其根部發(fā)現(xiàn)白色雌蟲。這表明，莎草科嵩草和矮嵩草可以作為禾谷孢囊線蟲的寄主。該結(jié)果首次表明H.avenae的寄主不局限于禾本科植物，還包括莎草科植物。

禾谷孢囊線蟲種群的鑒定目前主要采用形態(tài)特征和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法。形態(tài)特征鑒定主要包括對(duì)孢囊、陰門錐及二齡幼蟲形態(tài)的觀察以及相關(guān)體值的測(cè)定，但是僅根據(jù)形態(tài)學(xué)和形態(tài)測(cè)量值區(qū)別這12個(gè)種比較困難，需要許多專業(yè)知識(shí)和技巧，用單個(gè)個(gè)體經(jīng)常不能鑒定到種的水平。本研究對(duì)采集自甘肅天祝高寒草甸草原嵩草和矮嵩草的根際土樣中孢囊進(jìn)行了形態(tài)觀察和形態(tài)體值的測(cè)量，形態(tài)特征與陳品三等[21]、Zafar[22]和王明祖[23]禾谷孢囊線蟲的描述基本一致，但形態(tài)測(cè)量值略微偏小。形態(tài)測(cè)量值的略微偏差，可能是生態(tài)環(huán)境、地域差異造成，不同的寄主也可能對(duì)群體分化存在一定的影響。孢囊線蟲rDNA-ITS的多種內(nèi)切酶的RFLP 圖譜可用來分析禾谷孢囊線蟲種內(nèi)ITS多態(tài)性，彭德良等[19]用11 種限制性內(nèi)切酶酶切禾谷孢囊線蟲ITS 擴(kuò)增產(chǎn)物，成功地將采集到的禾谷孢囊線蟲ITS與摩洛哥群體ITS 分開，分別屬于“B 型”和“A型”。歐師琪等[20]用6種限制性內(nèi)切酶酶切發(fā)現(xiàn)，陜西禾谷孢囊線蟲群體和青海群體、河南群體不完全一致，呈現(xiàn)豐富的多樣性。分子生物學(xué)鑒定是通過rDNA-ITS區(qū)序列的分子特征分析，結(jié)合以形態(tài)學(xué)鑒定提高了禾谷孢囊線蟲種類鑒定的準(zhǔn)確性。ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，本研究線蟲群體與中國的禾谷孢囊線蟲、德國的H.pratensis和澳大利亞的H.australis群體聚為一個(gè)小的分支，揭示了它們之間具有更高的親緣關(guān)系。

4結(jié)論

本研究對(duì)寄生于甘肅中部天祝高寒草甸草原牧草(嵩草和矮嵩草)的孢囊線蟲群體進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和rDNA-ITS區(qū)序列的分子特征分析。結(jié)果顯示，該群體均為禾谷孢囊線蟲，這是首次報(bào)道莎草科嵩草和矮嵩草也是禾谷孢囊線蟲的寄主植物。

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