蒺藜苜蓿全基因組中U-box基因家族的篩選與特征分析

鄭興衛(wèi)，邵麟惠，李聰

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

蒺藜苜蓿全基因組中U-box基因家族的篩選與特征分析

鄭興衛(wèi)，邵麟惠，李聰*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

摘要：植物基因組中廣泛存在U-box基因，其編碼蛋白大部分作為泛素系統(tǒng)中決定底物特異性識(shí)別的E3泛素連接酶，廣泛地調(diào)控植物生長(zhǎng)生殖發(fā)育以及響應(yīng)逆境脅迫等過(guò)程。本文利用蒺藜苜?；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)生物信息學(xué)手段，鑒定蒺藜苜蓿U-box家族基因；采用MEGA6軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析；通過(guò)GSDS在線(xiàn)工具和Mapinspect軟件進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)及染色體定位分析；利用已有的蒺藜苜蓿芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行組織表達(dá)和脅迫響應(yīng)表達(dá)分析。結(jié)果表明，蒺藜苜?；蚪M中含有41個(gè)U-box基因，不均勻地分布于蒺藜苜蓿的8條染色體上。根據(jù)結(jié)構(gòu)域組成和系統(tǒng)進(jìn)化分析將這些U-box蛋白分成6類(lèi)?；虮磉_(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，該家族成員的表達(dá)具有一定的組織特異性，并能響應(yīng)鹽、干旱和氮素脅迫。這些研究結(jié)果為蒺藜苜蓿U-box基因家族的功能分析奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蒺藜苜蓿；U-box基因家族；進(jìn)化；表達(dá)模式

DOI：10.11686/cyxb2015102http://cyxb.lzu.edu.cn

鄭興衛(wèi)，邵麟惠，李聰. 蒺藜苜蓿全基因組中U-box基因家族的篩選與特征分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(8): 130-141.

Zheng X W, Shao L H, Li C. Genome-wide screening and characterization of the U-box gene family inMedicagotruncatula. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(8): 130-141.

收稿日期：2015-02-25；改回日期：2015-04-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31372362)項(xiàng)目和“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BAD17B01)資助。

作者簡(jiǎn)介：鄭興衛(wèi)(1987-)，女，河北定州人，在讀博士。E-mail:smilezxw@126.com

通訊作者*Corresponding author. E-mail:licong0520@sina.com

Genome-wide screening and characterization of the U-box gene family inMedicagotruncatula

ZHENG Xing-Wei, SHAO Lin-Hui, LI Cong*

InstituteofAnimalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193，China

Abstract:The U-box domain genes typically exist in multiple variants within plant genomes, and most of them belong to the ubiquitin/proteasome system as E3ubiquitin ligase. They play key roles in the regulation of growth, in development, in reproduction as well as in response to environmental stress. In this study, bioinformatics methods were applied to identify U-box family genes of M. truncatula through whole genome screening. A phylogenetic tree was created using the MEGA6 program. Gene structure and chromosome location were defined by GSDS and Mapinspect. A total of 41 U-box genes distributed unevenly on 8 chromosomes were identified from M. truncatula. The U-box proteins were classified into six major classes based on their motif compositions and phylogeny relationships. The expression profiles of M. truncatula U-box genes showed characteristics of tissue specificity and response to salt, drought and nitrogen stress. These results will be useful for future functional analyses of the U-box family genes in M. truncatula.

Key words:Medicago truncatula; U-box gene family; phylogenetic analysis; expression patterns

U-box基因家族是一類(lèi)具有U-box結(jié)構(gòu)域的基因家族，其編碼蛋白大部分是泛素系統(tǒng)中決定底物識(shí)別特性的泛素連接酶E3[1]，也有部分U-box蛋白質(zhì)屬于泛素鏈聚集因子E4[2]。作為E3的U-box蛋白在真核生物，特別是植物中廣泛存在，在與細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、形態(tài)發(fā)生、分泌途徑等過(guò)程有關(guān)的蛋白質(zhì)降解途徑中發(fā)揮著重要作用[3-6]。

U-box基序最初是從具有泛素鏈聚集酶 E4活性的酵母蛋白質(zhì) UFD2 中鑒定出來(lái)的[7]。第一個(gè)被鑒定出具體結(jié)構(gòu)的植物U-box蛋白為擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtPUB14蛋白質(zhì)[8]。近年來(lái)，隨著越來(lái)越多的 U-box 蛋白質(zhì)被鑒定出來(lái)，其結(jié)構(gòu)與功能也逐漸引起了人們的關(guān)注。研究表明，U-box 結(jié)構(gòu)域由大約70個(gè)氨基酸組成，該結(jié)構(gòu)域在真菌、植物和動(dòng)物等真核生物中高度保守。在目前已鑒定出的真核生物U-box蛋白中，植物U-box(plant U-box protein，PUB)蛋白的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于其他生物[3]。如酵母中有 2 個(gè) U-box 基因，在人中有 21 個(gè) U-box 基因[4,7,9]，而經(jīng)基因組序列分析預(yù)測(cè)，擬南芥基因組中存在64個(gè)U-box基因[10-11]，水稻(Oryzasativa)中已鑒定出77個(gè)帶有U-box結(jié)構(gòu)的基因[12]。到目前為止，多種植物的PUB蛋白基因功能已經(jīng)被驗(yàn)證：1)PUB蛋白參與植物的防御反應(yīng)。編碼擬南芥AtPUB17和與其同源的煙草(Nicotianabenthamiana)ACRE276蛋白的基因能正調(diào)控細(xì)胞凋亡和植物防御的過(guò)程[13]。AtPUB19通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié) ABA信號(hào)調(diào)控植物的干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程[14]。超表達(dá)擬南芥的 PUB22 和 PUB23能夠增加其對(duì)干旱脅迫的敏感性[15]。辣椒(Capsicumannuum)中的U-Box 蛋白質(zhì)CaPUB1，在擬南芥中超表達(dá)后植株的耐鹽性增加[16]。CMPG1 在煙草與番茄(Solanumlycopersicum)中參與多個(gè)抗病基因介導(dǎo)的抗性反應(yīng)[17]。2)一些植物U-box蛋白調(diào)控植株生長(zhǎng)和生殖發(fā)育過(guò)程。水稻OsPUB15突變后，導(dǎo)致種子不能長(zhǎng)出初生根，幼苗生長(zhǎng)緩慢甚至死亡[18]。擬南芥AtPUB4基因突變后，影響絨氈層細(xì)胞降解途徑，使花粉粒粘連導(dǎo)致雄性不育[19]。ACR1在蕓薹屬植物雌蕊中作用于其下游的S 受體激酶，促進(jìn)了雌蕊中兼容性因子的泛素化降解，最終導(dǎo)致花粉自交不親和[20]。并且擬南芥PUB13和同源基因水稻SPL11同時(shí)能夠調(diào)控植物的細(xì)胞死亡、抗病和開(kāi)花時(shí)間[21]，證明植物在發(fā)育和先天免疫反應(yīng)方面具有信號(hào)交叉。

蒺藜苜蓿是豆科苜蓿屬一年生植物，由于其具有生育期短(80~100 d)、基因組較小(454~526 Mb)、二倍體(2n=16)、自花授粉、易于轉(zhuǎn)化、再生時(shí)間較短等特點(diǎn)被作為豆科模式植物進(jìn)行研究[22-23]。蒺藜苜蓿與大部分豆科植物具有相似的遺傳性，從蒺藜苜蓿獲得的信息對(duì)其他豆科植物具有重要的參考價(jià)值。因此，蒺藜苜蓿成為繼擬南芥和水稻進(jìn)行基因組序列測(cè)定之后第3個(gè)基因組完整測(cè)序的模式植物[24-25]。蒺藜苜蓿全基因組序列公布后仍在不斷完善，目前，利用生物信息學(xué)方法分析基因家族的特征、進(jìn)化關(guān)系成為熱點(diǎn)。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)蒺藜苜蓿全基因組中的U-box基因家族的種類(lèi)、數(shù)目、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、系統(tǒng)發(fā)生和基因表達(dá)模式等進(jìn)行分析，旨在為豆科植物育種提供重要的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1　數(shù)據(jù)來(lái)源

試驗(yàn)于2014年8月至2015年1月進(jìn)行。最新的蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)全基因組數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)(Mt4.0)下載于JVCI蒺藜苜蓿測(cè)序網(wǎng)站(http://medicago.jcvi.org/medicago/)[26]；擬南芥U-box基因家族蛋白序列和基因序列下載于擬南芥U-box基因家族網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/pub.jsp)[10]；水稻U-box基因家族蛋白序列下載于水稻全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)[27]；蒺藜苜?；蛐酒磉_(dá)數(shù)據(jù)下載自蒺藜苜蓿基因表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(MtGEA v3，http://mtgea.noble.org/v3/)[28]。

1.2　蒺藜苜蓿U-box 基因家族成員鑒定

首先利用蒺藜苜蓿全基因組序列構(gòu)建本地BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)[29]，以目前擬南芥已經(jīng)鑒定出的所有U-box基因家族成員，共64個(gè)蛋白的基因序列對(duì)蒺藜苜?；蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)執(zhí)行本地BLAST搜索，E value設(shè)為0.001；同時(shí)將Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)[30]中U-box保守結(jié)構(gòu)域序列下載并提取出來(lái)(PF04565)，利用Hmmer v3.1b1[31](http://hmmer.janelia.org/)構(gòu)建隱馬爾科夫模型(HMM)，在Mt4.0v1蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索含有U-box結(jié)構(gòu)域的候選序列。合并上述兩部分結(jié)果，手工剔除無(wú)完整讀碼框的序列。所得結(jié)果利用Pfam和SMART[32](http://smart.embl-heidelberg.de/)在線(xiàn)工具進(jìn)一步分析結(jié)構(gòu)域，去除無(wú)典型U-box結(jié)構(gòu)域的序列，最終得到蒺藜苜蓿的U-box基因。利用ExPASy Proteomics Server(http://www.expasy.org/proteomics)對(duì)所有蒺藜苜蓿U-box蛋白氨基酸序列進(jìn)行分子量、等電點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.3　U-box家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)Clustal W[33]程序?qū)疝架俎-box蛋白進(jìn)行多序列聯(lián)配比對(duì)分析，序列聯(lián)配比對(duì)結(jié)果使用MEGA6[34]程序采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)生成基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，替換模式為“Poisson model”，缺口設(shè)置為“Pairwise deletion”，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap重復(fù)1000次。利用在線(xiàn)工具SMART分析U-box基因家族蛋白的結(jié)構(gòu)域組成。

1.4　蒺藜苜蓿U-box家族基因結(jié)構(gòu)及染色體定位分析

在得到每個(gè)基因信息的同時(shí)得到了基因的DNA序列，包括基因的cDNA序列，再用在線(xiàn)工具GSDS[35](http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)得到基因結(jié)構(gòu)圖。同時(shí)獲得了這些基因的染色體位置信息，利用Mapinspect工具標(biāo)出每個(gè)U-box結(jié)構(gòu)域基因在染色體組上的位置，從而得到每個(gè)U-box結(jié)構(gòu)域基因在基因組中的分布情況。

1.5　蒺藜苜蓿U-box家族基因表達(dá)模式分析

根據(jù)41個(gè)蒺藜苜蓿U-box基因?qū)?yīng)的CDS序列，在蒺藜苜?；蛐酒脚_(tái)BLAST搜索其對(duì)應(yīng)的探針，獲得探針的表達(dá)量信息。將39個(gè)不同組織器官、不同處理下的基因芯片數(shù)據(jù)通過(guò)CIMminer在線(xiàn)分析軟件鑒定蒺藜苜蓿U-box家族表達(dá)差異基因，并作出熱圖(heat-map)，最后對(duì)蒺藜苜蓿U-box基因的表達(dá)情況進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2結(jié)果與分析

2.1　蒺藜苜蓿U-box基因家族信息

通過(guò)本地BLAST比對(duì)以及Hmmer搜索，去除不含U-box典型結(jié)構(gòu)域的序列，最終從已發(fā)表的蒺藜苜蓿全基因組中鑒定出41個(gè)U-box 基因家族成員，如表1所示。通過(guò)Pfam和SMART工具進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，41個(gè)蒺藜苜蓿U-box蛋白均含有約60~70個(gè)氨基酸的U-box保守結(jié)構(gòu)域。通過(guò)ExPASy工具分析，蒺藜苜蓿中最長(zhǎng)的U-box蛋白(登錄號(hào)：Medtr1g090320.1)包含1490個(gè)氨基酸殘基，分子量大小為41個(gè)蛋白中的最大值167.08 kD，最短的U-box蛋白(登錄號(hào)：Medtr2g007630.1)包含259個(gè)氨基酸殘基，分子量最小，為28.73 kD。等電點(diǎn)范圍為5.28(Medtr7g078330.1)~9.24(Medtr2g007630.1)。

2.2　蒺藜苜蓿U-box家族系統(tǒng)進(jìn)化及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

為研究蒺藜苜蓿U-box基因家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，對(duì)最終篩選出的41個(gè)蒺藜苜蓿U-box蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。經(jīng)過(guò)SMART蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，除U-box結(jié)構(gòu)域外，蒺藜苜蓿U-box蛋白還含有其他結(jié)構(gòu)域。根據(jù)進(jìn)化樹(shù)及蛋白結(jié)構(gòu)域(圖1)，并參考擬南芥和水稻的U-box基因家族分類(lèi)結(jié)果(表2)，本文將蒺藜苜蓿中41個(gè)U-box蛋白分為6種類(lèi)型，分別包含18，12，5，3，2和1個(gè)蒺藜苜蓿U-box蛋白家族成員。ARM亞家族在植物中研究最多，并且在擬南芥和水稻中都被鑒定為最大的亞類(lèi)，在蒺藜苜蓿中為第2大亞類(lèi)。在擬南芥和水稻中根據(jù)N端保守位點(diǎn)甘氨酸、賴(lài)氨酸/精氨酸和亮氨酸定義的GKL+U-box亞家族，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)域分析與U-box only亞類(lèi)沒(méi)有區(qū)別，因此在本文中歸為U-box only亞類(lèi)，U-box only結(jié)構(gòu)的PUB蛋白在蒺藜苜蓿中的數(shù)量最多，共18個(gè)。Kinase亞家族有5個(gè)成員，其中3個(gè)成員含絲/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(S_TKc domain)，另外兩個(gè)為絲/蘇/酪氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(STYKc domain)。含有WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)和TPR結(jié)構(gòu)的U-box基因在蒺藜苜蓿中分別有3和2個(gè)。MtPUB28是蒺藜苜蓿中唯一含有UFD2結(jié)構(gòu)的U-box蛋白。

為了深入分析與其他物種同源基因的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)蒺藜苜蓿與擬南芥和水稻的U-box/ARM亞類(lèi)進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建(圖2)。結(jié)果顯示，與擬南芥或水稻中的同源基因相比，大部分蒺藜苜蓿U-box/ARM基因與蒺藜苜蓿家族內(nèi)部的同源基因的遺傳距離更加接近。然而，MtPUB25、MtPUB32和MtPUB34在擬南芥中都存在與其遺傳距離最近的直系同源蛋白。

表1　蒺藜苜蓿基因組中的U-box基因

圖1　蒺藜苜蓿U-box家族進(jìn)化樹(shù)及蛋白結(jié)構(gòu)Fig.1　The neighbor joining phylogenetic tree and structure of U-box proteins in M. truncatula　使用U-box蛋白的氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，分支上數(shù)字代表校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap重復(fù)1000次時(shí)該節(jié)點(diǎn)可信度The phylogenetic tree was constructed by using the amino acid sequences of the U-box proteins. The numbers on the branches mean the reliability percent of Bootstraps value based on 1000 replication.

圖2　蒺藜苜蓿與擬南芥、水稻U-box/ARM蛋白的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系Fig.2　Phylogenetic relationship of M. truncatula, Arabidopsis and O. sativa U-box/ARM proteins　紅色表示蒺藜苜蓿U-box/ARM蛋白，藍(lán)色表示擬南芥U-box/ARM蛋白，綠色表示水稻U-box/ARM蛋白。The red labels indicate U-box/ARM protein in M. truncatula, while blue and green ones indicate U-box/ARM in Arabidopsis and O. sativa, respectively.

2.3　蒺藜苜蓿U-box家族基因結(jié)構(gòu)及染色體定位分析

對(duì)家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析顯示(圖3)，蒺藜苜蓿U-box家族基因結(jié)構(gòu)差異較大，內(nèi)含子數(shù)目從0個(gè)到16個(gè)數(shù)目不等。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，蒺藜苜蓿U-box蛋白分類(lèi)中的I類(lèi)，即U-box only亞類(lèi)，其基因結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，大多數(shù)不含內(nèi)含子或僅含有1個(gè)內(nèi)含子，僅有3個(gè)基因含有3個(gè)以上的內(nèi)含子。II類(lèi)(U-box/ARM亞類(lèi))中每個(gè)基因的內(nèi)含子數(shù)目不超過(guò)4個(gè)。III類(lèi)(Kinase/U-box亞類(lèi))中基因的內(nèi)含子數(shù)目在6~9個(gè)之間，IV類(lèi)(U-box/WD40亞類(lèi))的3個(gè)基因所含內(nèi)含子數(shù)目最多，分別為16個(gè)、15個(gè)和13個(gè)。V類(lèi)(TPR/U-box亞類(lèi))的2個(gè)基因均含有7個(gè)內(nèi)含子。僅包含1個(gè)基因的VI類(lèi)(UFD2/U-box亞類(lèi))，Medtr6g013690.1基因含有15個(gè)內(nèi)含子。

表2　蒺藜苜蓿、擬南芥和水稻U-box蛋白的結(jié)構(gòu)域組成

圖3　41個(gè)蒺藜苜蓿U-box基因的結(jié)構(gòu)分析Fig.3　Gene structure of 41 U-box gene in M. truncatla

通過(guò)提取蒺藜苜蓿U-box基因的染色體定位信息，得到41個(gè)U-box基因在蒺藜苜蓿8條染色體上的定位圖(圖4)。由圖4可知，蒺藜苜蓿U-box基因在染色體上呈不均等分布。其中5號(hào)染色體分布最多，共含有10個(gè)U-box基因，而4號(hào)染色體上分布的U-box基因最少，僅有2個(gè)U-box成員。另外，U-box基因在染色體上的分布呈現(xiàn)區(qū)域性，從3號(hào)、5號(hào)、7號(hào)和8號(hào)染色體中可以看到，在染色體上的某一區(qū)域家族成員個(gè)數(shù)比較密集。

圖4　蒺藜苜蓿U-box基因在染色體上的定位Fig.4　Chromosomal locations of U-box genes in M. truncatula

2.4　蒺藜苜蓿U-box家族基因表達(dá)模式分析

利用蒺藜苜蓿MtGEA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的組織表達(dá)分析結(jié)果(圖5)表明，共有37個(gè)U-box基因在數(shù)據(jù)庫(kù)中有表達(dá)數(shù)據(jù)。聚類(lèi)圖中用綠-黑-紅三色代表基因表達(dá)的強(qiáng)度，紅色越亮代表信號(hào)越強(qiáng)，綠色越亮代表信號(hào)越弱，黑色代表中間水平。結(jié)果顯示，Medtr5g020570.1、Medtr5g020570.2在葉片中特異性表達(dá)，Medtr5g077510.1和Medtr3g008082.1主要在根中表達(dá)，Medtr1g017770.1與Medtr3g065080.1在營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)量高，Medtr1g079450.1和Medtr7g116600.1在種皮中特異性表達(dá)。Medtr1g044720.1普遍存在于蒺藜苜蓿葉、莖、花和種子等組織中，表達(dá)量較為豐富，而Medtr5g048050.1、Medtr5g083030.1、Medtr5g090510.1、Medtr6g071340.1和Medtr7g005940.1在各組織中表達(dá)量都很低。

圖5　蒺藜苜蓿U-box基因表達(dá)模式Fig.5　The expression profile of the M. truncatula U-box genes

同時(shí)，根據(jù)不同處理下的芯片數(shù)據(jù)，還分析了不同脅迫處理下蒺藜苜蓿U-box基因的表達(dá)模式，包括鹽(200 mmol/L NaCl)、干旱、低氮(N2、NO3-、NH4+)處理。結(jié)果顯示，鹽脅迫下9個(gè)基因(Medtr1g017770.1、Medtr2g018010.1、Medtr3g095730.1、Medtr4g107010.1、Medtr5g034440.1、Medtr5g048050.1、Medtr5g077510.1、Medtr6g071340.1和Medtr7g117890.1)在根中表達(dá)量上調(diào)，表明這些基因可能會(huì)參與植株幼苗期對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。水分脅迫下，在幼苗和根中檢測(cè)到的U-box基因表達(dá)量變化并不一致。干旱處理后在幼苗中表達(dá)量上調(diào)的基因有Medtr4g107010.1和Medtr6g013690.1兩個(gè)，Medtr4g085720.1、Medtr5g020570.1、Medtr5g020570.2和Medtr7g116600.1四個(gè)基因則表現(xiàn)為干旱時(shí)表達(dá)量降低，脅迫解除后又恢復(fù)甚至超過(guò)正常值。而在干旱脅迫后的根中，Medtr1g044720.1基因表達(dá)量上調(diào)，表達(dá)量下降的有10個(gè)基因(Medtr3g008270.1、Medtr3g008280.1、Medtr3g095730.1、Medtr4g085720.1、Medtr5g020570.1、Medtr5g020570.2、 Medtr7g005940.1、Medtr7g077780.1、Medtr8g092870.1和Medtr8g093310.1)。N素(N2、NO3-、NH4+)脅迫下，Medtr4g085720.1和Medtr4g107010.1 在幼苗中響應(yīng)脅迫，表達(dá)量都上調(diào)，而根中這兩個(gè)基因表達(dá)量基本不受N素(NO3-、NH4+)脅迫的影響。Medtr7g005940.1在幼苗和根中對(duì)NH4+脅迫響應(yīng)都比NO3-敏感。

3討論

隨著多種植物基因組測(cè)序的完成，利用全基因組數(shù)據(jù)對(duì)基因家族進(jìn)行系統(tǒng)分析和預(yù)測(cè)基因功能已成為植物基因功能研究所關(guān)注的重要問(wèn)題[37-39]。蒺藜苜蓿作為豆科的模式植物，其基因組測(cè)序完成后，WRKY[40-41]、LBD[42]、MADS-box[43]及NBS[44]等家族都進(jìn)行了廣泛的生物信息學(xué)分析。U-box蛋白在植物生殖發(fā)育及抗逆機(jī)制中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是當(dāng)前生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。本研究在蒺藜苜?；蚪M中鑒定出41個(gè)U-box基因，這與之前擬南芥(64個(gè))[39]和水稻(77個(gè))[36]等植物的報(bào)導(dǎo)存在一定差異，這說(shuō)明U-box基因家族并不與基因組大小有直接的關(guān)系，這與Zeng等[12]在水稻U-box基因家族研究中的結(jié)論一致。

U-box功能域是一種被修飾的RING-finger結(jié)構(gòu)，它不具有RING-finger type蛋白質(zhì)中由半胱氨酸和組氨酸及兩個(gè)鋅離子構(gòu)成的金屬離子螯合殘基，而是用鹽鍵和氫鍵來(lái)穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)[45]。除了N端的U-box結(jié)構(gòu)域外，U-box蛋白中通常還存在一些與蛋白相互作用密切相關(guān)的二級(jí)結(jié)構(gòu)域，主要用來(lái)介導(dǎo)U-box蛋白與底物蛋白的特異性識(shí)別。本研究中根據(jù)除U-box結(jié)構(gòu)域外的其他結(jié)構(gòu)域的種類(lèi)，將蒺藜苜蓿中的41個(gè)U-box蛋白家族成員分為6個(gè)亞家族。U-box/ARM亞家族成員是目前植物U-box家族基因中功能研究最多的亞類(lèi)。擬南芥和水稻均為研究最為深入的模式植物，突變體類(lèi)型較蒺藜苜蓿更為豐富，芯片數(shù)據(jù)更加全面完整，U-box基因功能也得到了更加廣泛的驗(yàn)證。研究表明，U-box/ARM蛋白通過(guò)多個(gè)ARM基序相互銜接形成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)以提供蛋白-蛋白相互作用的場(chǎng)所，參與植物的自交不親和、抗病、相應(yīng)非生物脅迫、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)過(guò)程。本文對(duì)蒺藜苜蓿與擬南芥、水稻的U-box/ARM亞家族進(jìn)行了聯(lián)合系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)與單子葉的水稻相比，蒺藜苜蓿U-box基因與同是雙子葉的擬南芥更容易聚為一類(lèi)，并且U-box基因家族在物種間進(jìn)化上是較為保守的(圖2)，所以可以認(rèn)為與擬南芥聚類(lèi)在一起的蒺藜苜蓿U-box基因也能具有類(lèi)似的功能。基于擬南芥中基因功能已報(bào)導(dǎo)或基因組中已注釋的U-box/ARM基因的分析結(jié)果[46-47]，可以對(duì)蒺藜苜蓿的U-box基因家族進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析。在磷酸鹽缺失條件下，擬南芥AtPUB9與其上游信號(hào)AtARK2共同調(diào)控植株側(cè)根發(fā)育[48]，與其對(duì)應(yīng)的蒺藜苜蓿同源蛋白MtPUB32可能也具有類(lèi)似功能。擬南芥AtPUB18和AtPUB19是同源基因，參與ABA介導(dǎo)的干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程，并且與AtPUB22和AtPUB23響應(yīng)干旱脅迫的過(guò)程相互獨(dú)立[49-52]，蒺藜苜蓿中MtPUB26與AtPUB18和AtPUB19同源，可能也參與到類(lèi)似的干旱響應(yīng)過(guò)程。

本文通過(guò)對(duì)蒺藜苜蓿基因芯片信息分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)蒺藜苜蓿U-box家族基因在8個(gè)不同組織的表達(dá)顯示，不同的U-box家族成員在表達(dá)上具有一定的組織特異性，暗示U-box家族成員間存在功能特異性。而陳浩等[53]通過(guò)選取水稻中4個(gè)U-box蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blotting檢測(cè)和EST數(shù)據(jù)比較分析，得出4個(gè)U-box蛋白質(zhì)在水稻生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期或部位為組成型表達(dá)，且表達(dá)量接近。這可能與物種間存在差異有關(guān)，或者與不同研究中所涉及的轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)和EST數(shù)據(jù)存在差異有關(guān)。多個(gè)U-box蛋白基因在鹽、干旱和氮素脅迫條件下，表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的變化，暗示這些基因在調(diào)控逆境脅迫過(guò)程中能夠發(fā)揮作用。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)U-box基因功能的研究主要采用酵母雙雜交篩選與其相互作用的下游蛋白[54]，以及基于RNA沉默或基因敲除的反向遺傳學(xué)辦法[19]。通過(guò)研究蒺藜苜蓿U-box蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，尋找與其相互作用的靶蛋白，將有助于了解植物體內(nèi)蛋白與蛋白的互作機(jī)制，從而揭示U-box基因如何調(diào)控蒺藜苜蓿的生長(zhǎng)發(fā)育，以及如何參與對(duì)逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。

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