切梢小蠹伴生菌分離培養(yǎng)及其種類研究*

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切梢小蠹伴生菌分離培養(yǎng)及其種類研究*

王曉渭1，袁瑞玲2,3，余俊旭4，李巧1，陳鵬2

(1.西南林業(yè)大學(xué)，云南昆明650224；2.云南省林業(yè)科學(xué)院，云南昆明650201；

3.云南省森林植物培育開發(fā)與利用重點實驗室，云南昆明650201；4.云南大學(xué)，云南昆明650091)

摘要：為了探究切梢小蠹伴生菌的種類，在10個不同的地點采集樹干內(nèi)的切梢小蠹成蟲及其坑道藍變組織樣品，采用MEA培養(yǎng)基對伴生菌進行分離、純化和形態(tài)學(xué)鑒定。結(jié)果表明，切梢小蠹的伴生菌子實體和菌落形態(tài)各異，分屬Ophiostoma和Leptogramphium。蟲種上，云南切梢小蠹、橫坑切梢小蠹和松芽小蠹的伴生菌多為Ophiostoma spp.，而華山松切梢小蠹伴生菌多為Leptogramphium spp.；寄主上，云南松和思茅松上的切梢小蠹伴生菌多為Ophiostoma spp.；而華山松上的小蠹蟲伴生菌為Leptogramphium spp.。研究結(jié)果為揭示切梢小蠹的危害機理提供了基礎(chǔ)信息。

關(guān)鍵詞：切梢小蠹；伴生菌；寄主植物；多樣性

切梢小蠹(Tomicusspp.)，隸屬于鞘翅目(Coleoptera)多食亞目(Phytophaga)象蟲總科(Curculionoidae)小蠹科(Scolytindae)切梢小蠹屬(Tomicus)，是一種重要的蛀干性森林害蟲，主要危害云南松(Pinusyunnanensis)、華山松(P.armandii)、馬尾松(P.massoniana)、思茅松(P.kesiyavar.langbianensis)、高山松(P.densata)等多種松類植物[1]。目前切梢小蠹屬有8個種[1]：縱坑切梢小蠹(Tomicuspiniperda)、橫坑切梢小蠹(T.minor)、云南切梢小蠹(T.yunnanensis)、松芽小蠹(T.brevipilosus)、華山松切梢小蠹(T.armandii)、地中海切梢小蠹(T.destruens)、多毛切梢小蠹(T.pilifer)和顆瘤切梢小蠹(T.puellus)，其中橫坑切梢小蠹、云南切梢小蠹、松芽小蠹、華山松切梢小蠹等4種在中國西南地區(qū)均有分布。

切梢小蠹對松類植物的危害分為蛀梢和蛀干2個時期：蛀梢期，其成蟲取食枝梢髓心組織，進行補充營養(yǎng)，完成其成蟲的性發(fā)育；蛀干期，性發(fā)育成熟的成蟲由樹梢轉(zhuǎn)移到樹干蛀食、產(chǎn)卵，形成母坑道和子坑道，其幼蟲在樹皮下發(fā)育，化蛹及羽化。切梢小蠹這一系列繁殖過程破壞了松樹的韌皮部，使植物的水分和有機物運輸功能受阻，最終導(dǎo)致樹木死亡[2～3]。20世紀80年代至今，切梢小蠹在云南松林區(qū)暴發(fā)成災(zāi)，僅在云南省常年危害面積就達10×104hm2以上[4]，給當(dāng)?shù)亓謽I(yè)產(chǎn)業(yè)造成了嚴重損失，對云南山區(qū)生態(tài)環(huán)境造成了嚴重破壞。

蠹害過程不僅是小蠹蟲直接對樹木的蛀食危害，而且在蛀害過程中小蠹蟲常攜帶病原真菌即“小蠹蟲伴生菌”侵入到樹木中進行協(xié)同危害，能迅速削弱林木的抗病蟲能力，加速了樹木的死亡，研究表明，小蠹蟲伴生菌是松類植物致死的另一個重要原因[5-6]。切梢小蠹伴生菌也叫藍污真菌(Blue stain fungi)，經(jīng)由小蠹蟲攜帶到寄主植物體內(nèi)，并對寄主植物產(chǎn)生一定致病作用，因此，蠹害是小蠹蟲及其伴生菌的蛀害與侵染相互協(xié)同作用的結(jié)果[7]。

南非農(nóng)林生物科技研究中心(Forestry & Agriculture Biotechnology Institute，簡稱FABI)是目前國際上研究小蠹蟲伴生菌的權(quán)威機構(gòu)，F(xiàn)ABI對伴生菌的分類、特性、危害等方面的研究處在世界的前沿，僅Michael J.Wingfield命名或參與命名的Leptogramphium、Ophiostoma和Ceratocystis的伴生菌就達36個種[8-9]。國內(nèi)對蠹害的研究起步較晚，大多注重于小蠹蟲的生物生態(tài)學(xué)特性，而對于伴生菌的種類，伴生菌與小蠹蟲和寄主植物的關(guān)系的研究尚少[6]。本項研究選擇云南省和貴州省受切梢小蠹危害的云南松、華山松和思茅松等林份作為采樣點，運用真菌學(xué)、森林病理學(xué)和昆蟲學(xué)的基本研究方法，對切梢小蠹伴生菌進行培養(yǎng)，用形態(tài)學(xué)方法分類，探討切梢小蠹伴生菌種類、以及伴生菌與切梢小蠹和寄主植物之間關(guān)系，以期為切梢小蠹及伴生菌的防治提供參考。

1材料與方法

1.1采樣點

于2013年11月-2014年12月，在云南省和貴州省調(diào)查和采樣，具體采樣地包括：云南昆明、大理、麗江、曲靖、普洱、貴州盤縣等地。采集的松類主要是云南松、華山松和思茅松。每個采樣點隨機選取5棵受害松樹，將受害木伐倒后每棵樹的主干取3段，每段長60 cm，將新鮮的木段及時帶回實驗室，對木段進行解剖，收集坑道內(nèi)的切梢小蠹成蟲，裝入離心管編號，備用。用消毒后的解剖刀，割取出切梢小蠹成蟲的坑道韌皮組織，放于培養(yǎng)皿中并編號，用于伴生菌的分離。

表1　切梢小蠹伴生菌采樣信息一覽表

1.2菌種的分離方法

菌種的分離方法由FABI提供[8～9]。根據(jù)小蠹蟲伴生菌侵入寄主一段時間后，伴生菌會在寄主植物韌皮部和坑道上長成一個黑色菌柄和白色孢子體的子實體。因此，菌種的分離時，只挑取切梢小蠹母坑道內(nèi)的伴生菌孢子進行分離純化與培養(yǎng)。

具體方法：分離菌種的時候，直接將帶有坑道的松樹木片放在解剖鏡下觀察，如果直接能觀察到伴生菌子實體，可用解剖針挑取伴生菌孢子，然后將孢子接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離；如果不能直接在解剖鏡下觀察到伴生菌子實體，則將帶坑道的木塊或藍變的木塊放在墊有慮紙的培養(yǎng)皿中，加入少量的蒸餾水，保持培養(yǎng)皿濕潤，置于25℃下培養(yǎng)1-2周，期間每天觀察木塊是否長出子實體，長出后立即進行接種分離和純化培養(yǎng)。

1.3菌種的培養(yǎng)、純化和保存

1.3.1培養(yǎng)基

MEA培養(yǎng)基(配方為，20 g麥芽提取粉，20 g瓊脂粉，蒸餾水1 000 mL)，用于伴生菌普通分離純化培養(yǎng)；MEA選擇培養(yǎng)基(配方為，20 g麥芽提取粉，20 g瓊脂粉，0.5 g放線菌酮，0.4 g鏈霉素，蒸餾水1 000 mL)，用于在分離伴生菌時抑制細菌和其他真菌等雜菌的生長，從而更好地將伴生菌分離出來。MEA培養(yǎng)基和MEA選擇培養(yǎng)基都置于25℃的恒溫箱中培養(yǎng)。

1.3.2菌種的純化

分離菌種接種到培養(yǎng)基1-2天后，在超凈工作臺內(nèi)，用MEA培養(yǎng)基和MEA選擇培養(yǎng)基，經(jīng)過4～5次轉(zhuǎn)接純化，直到完全純化，伴生菌在培養(yǎng)基上長成顏色相同，分布均一的菌落。

1.3.3菌種的保存

將純化后的菌種接到外徑為15 mm、長150 mm的試管斜面培養(yǎng)基，再置于4℃冰箱中保存。

1.4伴生菌的形態(tài)鑒定

伴生菌形態(tài)學(xué)鑒定，根據(jù)魏景超真菌鑒定手冊和FABI伴生菌形態(tài)鑒定方法進行[8～11]。鑒定主要依據(jù)：是否產(chǎn)孢、產(chǎn)孢類型、孢子大小、和孢子形態(tài)，孢子梗形態(tài)、孢子梗顏色、孢子梗分隔；菌絲形態(tài)、菌絲顏色、菌絲隔膜、營養(yǎng)情況等；觀察菌落形狀、大小、顏色、質(zhì)地、表面的紋飾、高度和邊緣等特征[12]。

1.5切梢小蠹的鑒定方法

切梢小蠹鑒定參照葉輝[13]、呂軍[4]和李霞[14]等小蠹蟲形態(tài)學(xué)方法。

2結(jié)果與分析

2.1切梢小蠹的種類

共采集到50個標(biāo)本，鑒定出4種切梢小蠹：云南切梢小蠹、橫坑切梢小蠹、華山松切梢小蠹、松芽小蠹。其中，在云南省石林縣長湖鎮(zhèn)云南松林采集到橫坑切梢小蠹、云南切梢小蠹和松芽小蠹；云南省大理州祥云縣、云南省昆明市團結(jié)村和云南省麗江市玉龍縣采集到橫坑切梢小蠹和云南切梢小蠹，寄主為云南松；云南省陸良縣張果山、貴州省六盤水市盤縣和云南省普洱市墨江縣、云南省普洱市寧洱縣采集到橫坑切梢小蠹和松芽小蠹，寄主分別為云南松和思茅松；云南省陸良縣龍海鄉(xiāng)在華山松上采集對華山松切梢小蠹；貴州省六盤水市盤縣華山松林僅采集到華山松切梢小蠹。各采樣點切梢小蠹種類如表2所示。

表2　不同樹種切梢小蠹種類及伴生菌種類

2.2伴生菌類群的特征

2.2.1伴生菌菌落形態(tài)特征

伴生菌在MEA培養(yǎng)基上生長不一，但根據(jù)其特點，可以大體分為3類：(1)伴生菌生長較快，生長初期呈膜狀，淺白色，后逐漸呈白色、褐色和橄欖色，菌落、菌苔濕潤，菌絲可在培養(yǎng)基內(nèi)生長，也可以在培養(yǎng)基表面成為氣生菌絲，但氣生菌絲并不發(fā)達，菌落微微凸起，2周后，培養(yǎng)基表面可見白色顆粒狀絮狀物出現(xiàn)(如圖1a～f)。(2)伴生菌生長迅速，擴展較快，生長初期膜狀無色，后來呈黑色，氣生菌絲有的較發(fā)達，菌落微凸起，后期呈毛毯狀；有的氣生菌絲很不發(fā)達，貼著培養(yǎng)基表面生長，后期呈膜狀均一(如圖1g～k)。(3)菌落生長緩慢，光滑，中心淺黃色，外圍呈白色，有凹痕，生長后期，菌種中心凸起(如圖1l)。具體菌落形態(tài)見圖1。

圖1　伴生菌在培養(yǎng)基上菌落形態(tài)

圖2　切梢小蠹伴生菌子實體的形態(tài)

2.2.2伴生菌形態(tài)特征

切梢小蠹伴生菌分有性和無性2種繁殖方式，鏡檢可見有2類菌絲：一類呈褐色，較粗，直徑為8～10 μm；另一類無色，較細，直徑為4～6 μm。分生孢子梗橄欖色，光滑、直立，有青霉?fàn)钪銧钪?，向下部分顏色較深，向上部分顏色較淺，長為108～240 μm。頂部由黏液黏呈球狀，寬40～140 μm(如圖2a、圖2b)，分生孢子小梗4～7段，小梗頂端長有細長的產(chǎn)孢細胞，無色，長形或瓶狀，產(chǎn)孢細胞產(chǎn)生棒狀或圓形的環(huán)痕孢子，光滑、無色，4.8～10.8 μm×1.92～3.6 μm(如圖2c、圖2d，孢子成熟脫落下來后由黏液黏呈球狀。

2.2.3切梢小蠹伴生菌初步鑒定

通過魏景超和FABI真菌形態(tài)學(xué)鑒定方法[8-11]，結(jié)合伴生菌分生孢子梗、分生孢子、菌絲和菌落特征，切梢小蠹伴生菌初步鑒定為2個屬：Ophiostoma(圖2c)和Leptogramphium(圖2d)。由于國內(nèi)對這2個屬的種類記載較少，所以從形態(tài)學(xué)鑒定到種有一定的難度。其具體種名，還需借助分子系統(tǒng)學(xué)的方法進一步確定。

2.3伴生菌與切梢小蠹及寄主植物的關(guān)系

切梢小蠹對伴生菌具有一定的攜帶率，其中云南切梢小蠹對伴生菌的帶菌率為12.29 %[15]。研究表明，切梢小蠹對伴生菌的攜帶率因蠹害程度而異，在蠹害重的地區(qū)，切梢小蠹帶菌率較高，而在蠹害較輕的地區(qū)，帶菌率相對較低[15]。切梢小蠹伴生菌帶菌率的大小直接影響了其對寄主植物的危害水平。因此，蠹害是切梢小蠹與其伴生菌的共同危害和寄主植物的抗性相互作用的結(jié)果，切梢小蠹、伴生菌和寄主植物之間逐漸形成特定的關(guān)系。

切梢小蠹伴生菌是切梢小蠹的內(nèi)生真菌，二者形成一種互利共生的關(guān)系[16].但由于切梢小蠹與其伴生菌種類的不同，切梢小蠹對伴生菌的攜帶具有特異性。由表2可知，橫坑切梢小蠹、云南切梢小蠹和松芽小蠹的伴生菌多為(Ophiostomaspp.)；而華山松切梢小蠹伴生菌多為(Leptogramphiumspp.)。這種特定的共生關(guān)系，導(dǎo)致切梢小蠹與其伴生菌共同危害寄主植物。

不同切梢小蠹對不同寄主有一定的偏好性，在長期的進化和自然選擇的作用下，使切梢小蠹和寄主植物形成特定的關(guān)系，而由于切梢小蠹伴生菌和寄主植物種類的不同，導(dǎo)致切梢小蠹的伴生菌對寄主植物寄生也是特定的。云南松和思茅松被侵染的伴生菌多為(Ophiostomaspp.)；而華山松被侵染的伴生菌為(Leptogramphiumspp.)。

總之，切梢小蠹伴生菌是Ophiostoma和Leptogramphium屬中的某些種，而且可能有多個種，甚至有新種或新紀錄種。由于切梢小蠹、伴生菌和寄主植物的種類多樣，使它們?nèi)咧g形成的關(guān)系也是復(fù)雜多樣的。

3討論

切梢小蠹伴生菌根據(jù)FABI和真菌鑒定手冊初步鑒定有2個屬，但是由于國內(nèi)真菌鑒定常用分類系統(tǒng)對Ophiostoma和Leptogramphium2個屬分類地位的意見尚不統(tǒng)一，存在多種分類方式，所以這2個屬在分類地位上需進一步對應(yīng)或補充，也還需要進一步用分子系統(tǒng)學(xué)的方法驗證。但可以肯定的是，小蠹蟲伴生菌在國內(nèi)種類豐富，其中在云南省Ophiostomaspp.和Leptogramphiumspp.較為普遍。由于切梢小蠹種類在云南省分布廣、種類多，和寄主植物的差異性，伴生菌種類繁多，子實體和菌落形態(tài)各異，而且伴生菌與切梢小蠹和寄主植物的關(guān)系復(fù)雜。

切梢小蠹與其所攜帶的真菌之間所形成的關(guān)系為互利共生的關(guān)系。切梢小蠹的伴生菌通過對寄主植物的侵染而削弱植物抗性，有助于切梢小蠹的入侵，寄主樹木的死亡是切梢小蠹與其伴生菌對于寄主植物動態(tài)相互作用的結(jié)果[16]。但是，寄主植物抵抗切梢小蠹與其伴生菌進攻的機制是隨切梢小蠹及其伴生菌的種類不同而有差異，還是沒有種的特異性尚待作進一步研究。同時，在切梢小蠹伴生菌和寄主樹木的關(guān)系上，不僅表現(xiàn)為不同伴生菌種類寄生于不同的寄主植物，而且更重要的是伴生菌的不同的致病力導(dǎo)致寄主植物的死亡率不同[17]。但是，在致病力的差異上和使寄主致死機理上還不夠明確，還有待進一步研究。

對于切梢小蠹伴生菌多樣性的研究可以豐富真菌類群，進一步提高人們對切梢小蠹致病和寄主防御機制的理解。為此，應(yīng)該加強對切梢小蠹伴生菌分類學(xué)研究；應(yīng)該加強伴生菌與切梢小蠹的相互關(guān)系的研究[16]；應(yīng)該加強伴生菌與寄主植物關(guān)系的研究，為今后更有效地進行切梢小蠹防治提供理論基礎(chǔ)。

致謝：特別感謝南非農(nóng)林生物科技研究中心的切梢小蠹伴生菌專家周旭東教授(博士后)和常潤磊博士親臨指導(dǎo)伴生菌的分離，提供關(guān)于伴生菌分離和鑒定的方法。

參考文獻：

[1]王曉渭,袁瑞玲,焦曉旭.等.云南切梢小蠹及其伴生真菌的研究進展[J].西部林業(yè)科學(xué),2014,43(5):154-159.

[2]Chen Peng.Is there competition betweenTomicuspinierda(L.) andT.minor(Hart.) (Col.,Scolytidae) during shoot-feeding and breeding in China[D].Uppsala:Swedish University of Agricultural Sciences(SLU),2003.

[3]Lieutier F,Ye H.Shoot damage byTomicussp.(Coleoptera:Scolytidae) and effect onPinusyunnanensisresistance to subsequent reproductive attacks on the stem[J].Agric.For.Entomol,2003,5:227-233.

[4]呂軍.中國西南地區(qū)4種切梢小蠹的發(fā)生、分布及危害機理研究[D].昆明：云南大學(xué),2011.

[5]廖周瑜,葉輝.縱坑切梢小蠹伴生菌危害機理的研究[J].中國森林病蟲,2002,21(3):3-5.

[6]廖周瑜.縱坑切梢小蠹伴生菌——云南半帚孢(Leptographiumyunnanense)危害機理與云南松抗性研究[D].昆明：云南大學(xué),2002.

[7]葉輝,呂軍.縱坑切梢小蠹藍污真菌侵害云南松樹組織解剖觀察[J].林業(yè)科學(xué),2001,37(6):71-74.

[8]Michael J.Wingfield,Keith A.Seifert,Joan F.Webber.CeratocystisandOphiostoma[M].Minnesota:American Phytopathological Society (APS)PRESS,1993:1-293.

[下轉(zhuǎn)第54頁]

Species Diversity and Their Isolation and Cultivation of

Fungi Associated with Tomicus

WANG Xiao-wei1,YUAN Rui-ling2,3,YU Jun-xu4,LI Qiao1,CHEN Peng2

(1.Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650224,P.R.China;2.Yunnan Academy of Forestry,Kunming Yunnan 650201,P.R.China；

3.Yunnan Key Laboratory of Forest Plant Cultivation & Utilization,Kunming Yunnan 650201,P.R.China；4.Yunnan University,Kunming Yunnan 650091)

Abstract:In order to study species variety of fungi associated with Tomicus,Tomicus adults in infected tunnels and blue stain tissues were collected from 10 sites,and MEA medium was used for isolating and purifying the fungi.The results showed that the form of the fungi’s fruiting bodies and colonies were different,and they were identified as two genuses,Leptogramphium and Ophiostoma.In terms of insect species,most fungi associated with Tomicus yunnanensis,T.minor and T.brevipilosus were Ophiostoma spp.,and most fungi associated with and T.armandii were Leptogramphium spp..In terms of host plant,most fungi in Pinus yunnanensis and P.kesiya var.langbianensis were Ophiostoma spp.,and most fungi in P.armandii were Leptogramphium spp..This study could provide basic information for revealing the damage mechanism of Tomicus.

Key words:Tomicus;associated fungi;host plants;species diversity

中圖分類號：S 763

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-8246(2015)06-0042-06

通訊作者簡介：陳鵬(1975-)，男，研究員，博士，主要從事森林保護與病蟲害方面的研究。E-mail：13099919112@163.com

作者簡介：第一王曉渭(1988-)，男，碩士研究生，主要從事森林保護方面的研究。E-mail：15198886280@163.com

基金項目：云南省應(yīng)用基礎(chǔ)重點項目“云南省切梢小蠹伴生真菌種類及在小蠹蛀害中的協(xié)同互作機制”(2013FA055)。

收稿日期：*2015-05-05