DNA分子鑒定技術(shù)在中成藥真?zhèn)涡澡b別中的應(yīng)用與研究進(jìn)展

陳蓉，吳成麗，鄧赟，卞金輝

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DNA分子鑒定技術(shù)在中成藥真?zhèn)涡澡b別中的應(yīng)用與研究進(jìn)展

陳蓉1，吳成麗1，鄧赟2，卞金輝2

［摘要］中成藥真?zhèn)涡缘臏?zhǔn)確鑒定是臨床用藥安全有效的前提所在，DNA分子鑒定技術(shù)是分子生物學(xué)上的一種常規(guī)技術(shù)，應(yīng)用于中成藥真?zhèn)涡缘蔫b別是對(duì)目前中藥質(zhì)量控制體系的有效補(bǔ)充。本文主要從中成藥DNA分子鑒定常規(guī)操作流程及DNA分子鑒定在中成藥的真?zhèn)涡澡b別中的應(yīng)用研究方面進(jìn)行了綜述，并對(duì)其應(yīng)用過程中存在的問題和發(fā)展前景進(jìn)行了總結(jié)和展望。

［關(guān)鍵詞］DNA分子鑒定；中成藥；綜述

［作者單位］1.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

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DNA分子鑒定技術(shù)是指利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)某物種或某個(gè)體中特異性的DNA序列進(jìn)行分析鑒定，從而達(dá)到在分子水平上對(duì)物種和個(gè)體進(jìn)行鑒定的目的，它作為近代科學(xué)技術(shù)發(fā)展的重要成果已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到各物種的分類鑒定中來［1-3］。上個(gè)世紀(jì)90年代以來，不斷有學(xué)者把DNA分子鑒定技術(shù)應(yīng)用到中藥的鑒定中來［4-7］，2010版藥典及其增補(bǔ)本相繼收錄了烏梢蛇、蘄蛇的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒別法、川貝母的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性鑒別方法（PCR-RFLP），2015版藥典還建立了《中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則》。由此可見，DNA分子鑒定技術(shù)有望成為繼化學(xué)儀器分析技術(shù)應(yīng)用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)之后又一應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制的常規(guī)技術(shù)。

但是目前納入標(biāo)準(zhǔn)的中藥DNA分子鑒定技術(shù)主要集中在對(duì)中藥材的鑒定上，對(duì)于中成藥的DNA分子鑒定還未見收錄。由于中成藥的組成復(fù)雜，其質(zhì)量控制難度更大，中成藥中的造假、摻假現(xiàn)象也更為嚴(yán)重，而DNA分子鑒定技術(shù)具有快速、微量、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，能夠?qū)χ谐伤幹性纤幉倪M(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒定，所以建立中成藥的DNA分子鑒定方法對(duì)解決目前中成藥質(zhì)量控制中的一些難題顯得非常迫切和必要。

本文搜集了近年來中成藥DNA分子鑒定中的代表性研究成果，主要從中成藥DNA分子鑒定常規(guī)操作流程及DNA分子鑒定在中成藥真?zhèn)涡澡b別中的應(yīng)用研究方面進(jìn)行綜述和總結(jié)，并對(duì)其目前應(yīng)用中存在的問題及發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1　DNA分子鑒定技術(shù)鑒別中成藥真?zhèn)涡缘囊话懔鞒?/h2>

1.1 中成藥中基因組DNA的提取

目前常用的基因組DNA提取方法包括CTAB法、SDS法、離心柱型試劑盒法、磁珠試劑盒法等。羅［8］等人以麥冬為例，對(duì)上述常用DNA提取方法在中藥中的應(yīng)用進(jìn)行了比較研究，研究發(fā)現(xiàn)改良CTAB法提取出的DNA質(zhì)量和數(shù)量為最優(yōu)，陳玉秀［9］、杜向紅［10］、劉麗華［11］、劉楊［12］等也針對(duì)不同的藥材，分別對(duì)CTAB法進(jìn)行改進(jìn)，提高了中藥玉竹、蒲公英、景天三七、吳茱萸等藥材中DNA的提取效率；但是陳莉等［13］在利用CTAB法和SDS法對(duì)丹參、絞股藍(lán)、三七進(jìn)行DNA提取的研究中發(fā)現(xiàn)，丹參、絞股藍(lán)的DNA適用于CTAB法提取，而三七的DNA更適合用SDS法提取，其原因是不同植物中含有不同的次生代謝產(chǎn)物，這些次生代謝產(chǎn)物會(huì)不同程度的影響DNA的提取。Chen R［14］等也發(fā)現(xiàn)對(duì)于不同劑型的中成藥也需要根據(jù)樣品特征選取不同的DNA提取方法，比如固體制劑可選用改良的CTAB法，而液體制劑則需要采用乙醇重結(jié)晶或者是柱吸附試劑盒進(jìn)行富集提取。由此可見，對(duì)于中成藥的DNA提取，目前還沒有通用的方法，需要根據(jù)待檢測中成藥中不同的藥材以及不同的制劑類型設(shè)計(jì)優(yōu)化相關(guān)的DNA提取方法。

1.2 中成藥中目的DNA的擴(kuò)增

對(duì)于中成藥中目的DNA的擴(kuò)增，按照所用引物分類可分為通用引物PCR法以及特異性引物PCR法。通用引物對(duì)于植物一般采用ITS2或者psbA-trnH區(qū)域通用引物，對(duì)于動(dòng)物一般采用COI序列通用引物進(jìn)行擴(kuò)增［15］。特異性引物PCR則需要根據(jù)不同的檢測對(duì)象選擇其特異性DNA序列，并設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增［16， 17］，這兩類方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，通用引物PCR法無需設(shè)計(jì)特異性引物，在PCR方案設(shè)計(jì)當(dāng)中相對(duì)簡單，但是對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測則需要依靠DNA測序儀等；特異性引物PCR法前期建立方法時(shí)需要對(duì)待檢測品種及其混偽品進(jìn)行序列比對(duì)，并設(shè)計(jì)特異性引物，但是在后期PCR產(chǎn)物檢測中則依靠常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳等手段即可快速獲得檢測結(jié)果，利于此類檢測方法的推廣。

此外，目前已報(bào)道的中成藥的DNA分子鑒定中目標(biāo)序列的擴(kuò)增，按照操作流程則可分為普通PCR和巢式PCR，巢式PCR是在普通PCR之前，利用通用引物或者特異性引物對(duì)待檢測樣品再進(jìn)行一次PCR操作，可以達(dá)到富集DNA和提高特異性的目的，適用于對(duì)復(fù)雜樣本組［18］或者極其微量DNA的擴(kuò)增［14］。

1.3 中成藥中目的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

在分子生物學(xué)技術(shù)中，對(duì)于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測有較多方法：經(jīng)典的瓊脂糖凝膠電泳檢測技術(shù)，新進(jìn)發(fā)展起來的第一代、第二代高通量測序技術(shù)，可以定量的熒光定量PCR技術(shù)，以及納米金、比色探針等可視化檢測技術(shù)。對(duì)于中成藥目的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測，可以根據(jù)具體需要選用適當(dāng)?shù)腜CR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法，目前已報(bào)道的有：玉屏風(fēng)散中白術(shù)、黃芪、防風(fēng)等藥材的鑒定采用瓊脂糖凝膠電泳檢測［19］；連翹敗毒丸中金銀花的鑒定采用第一代測序法檢測［20］，八寶清心散等中成藥中原藥材的鑒定采用第二代高通量測序法［21］；生脈飲、烏雞白鳳丸等中成藥中人參藥材的檢測采用G-四聚體比色探針法等［14］。

2　DNA分子鑒定技術(shù)在中成藥真?zhèn)涡澡b別中的應(yīng)用

中成藥不同于中藥材在于，中藥材為單一動(dòng)物或者植物樣本，而中成藥除少數(shù)是單味藥組成外其余均為多種藥材混合加工而成，并有多種制劑方式，其基因組DNA較為復(fù)雜，對(duì)其進(jìn)行檢測也更加困難。此外，在制劑工藝中，中成藥中的藥材，有的經(jīng)過研磨粉碎直接入藥，有的經(jīng)過煎煮提取以提取液形式入藥，有的在提取過程中還加入了乙醇進(jìn)行沉淀等，這些加工都在不同程度上都降低了藥材DNA的質(zhì)量和數(shù)量。同時(shí)，多種藥用輔料的加入，如蜂蜜、淀粉、糖包衣等對(duì)DNA的提取也造成了極大的困難，所以根據(jù)劑型不同以及中成藥的具體制劑工藝不同，對(duì)其中藥材DNA的鑒定方案也有所不同。

2.1 以原藥材直接入藥的中成藥

2.1.1 單味藥材組成的中成藥或保健品 目前市售的部分中成藥或者保健品是由單味藥材組成，這種藥品大多是一些貴重中藥，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其摻假現(xiàn)象也比較嚴(yán)重，建立這類藥品的DNA分子鑒定方法能準(zhǔn)確的判斷該藥品的真?zhèn)涡?，因此有較大的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，僅含有單味藥材的中成藥其成分也相對(duì)單一，DNA提取和鑒定均可采用中藥材DNA鑒定所用的方法，難度較低。

Mihalov JJ［22］等人利用DNA測序技術(shù)對(duì)植物的ITS序列進(jìn)行測序，成功地鑒別了西方市場上混淆流通的人參和西洋參的粉末制品、片劑和膠囊劑等。王巍［23］等人利用特異性引物PCR技術(shù)對(duì)全天麻膠囊中的天麻及常見偽品進(jìn)行了鑒定，不僅建立了天麻的特異性引物PCR鑒定法，還成功的從某廠家的全天麻膠囊中檢測出天麻常見偽品馬鈴薯的DNA。劉光全［24］等人利用ITS序列分析技術(shù)對(duì)3個(gè)不同廠家的蟲草膠囊進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2個(gè)廠家所用樣品為西藏蟲草和蛹蟲草，均與其產(chǎn)品名稱“冬蟲夏草”

不相符合，也不屬于國家衛(wèi)計(jì)委允許的保健食品菌株。目前冬蟲夏草的藥典標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定腺苷的含量不低于0.010%，腺苷是一種非特異性化合物，廣泛存在于各種動(dòng)植物藥中，上述西藏蟲草和蛹蟲草中也存在較高含量的腺苷，所以腺苷的測定不能有效的控制冬蟲夏草及其成藥或者保健品的質(zhì)量，而通過DNA分子鑒定則能直接有效地鑒別出其真?zhèn)涡浴?/p>

2.1.2 多味藥材組成的中成藥 對(duì)于一些由多味中藥材配伍而成的中成藥的DNA分子鑒定，目前也有相關(guān)報(bào)道。Coghlan， M. L［21］等人利用第二代高通量測序技術(shù)對(duì)澳大利亞海關(guān)扣留的包括粉劑、片劑、膠囊劑等在內(nèi)的15種中藥樣品進(jìn)行測序分析，鑒定出了68種動(dòng)植物品種，發(fā)現(xiàn)了瀕危物種亞洲黑熊和高鼻羚的DNA，這不僅為中藥質(zhì)量控制提供了新技術(shù)，也為藥品監(jiān)管、非法貿(mào)易的查處提供了技術(shù)支持。但是就目前而言，第二代高通量測序技術(shù)相對(duì)來說普及面較窄，價(jià)格較高，序列分析技術(shù)壁壘較高，更多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測，在中成藥真?zhèn)涡澡b別中的應(yīng)用前景還比較有限。崔占虎［18］等利用特異性引物PCR技術(shù)結(jié)合DNA測序?qū)ΠㄟB翹敗毒丸、牛黃清宮丸、健腦補(bǔ)腎丸、金噪開音丸等在內(nèi)的6種含有金銀花藥材的中成藥進(jìn)行了分析，在6種樣品中均成功檢測出了金銀花的特異性DNA序列。但是該法采用了巢式PCR操作，首先利用通用引物對(duì)trnL-trnF葉綠體序列進(jìn)行擴(kuò)增富集，再將PCR產(chǎn)物稀釋后，用金銀花特異性引物進(jìn)行第二輪PCR，最后將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆測序得分析結(jié)果。巢式PCR的引入使操作更加繁瑣，也提高了PCR污染的幾率。同時(shí)通過克隆測序?qū)z測結(jié)果進(jìn)行分析雖然使檢測結(jié)果更加直觀可靠，但是也進(jìn)一步延長了檢測周期，提高了檢測成本，所以該方法在技術(shù)上還需要進(jìn)一步改進(jìn)。此外， Cheng KT［25］等首次利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）技術(shù)對(duì)著名中成藥“玉屏風(fēng)散”中的白術(shù)、黃芪、防風(fēng)等藥材進(jìn)行了鑒別研究；隨后，李會(huì)軍［26］等人同樣利用該技術(shù)，建立了中成藥中川貝母的DNA標(biāo)準(zhǔn)圖譜，利用待測樣品的DNA圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相比較，從而判斷待檢測中成藥的真?zhèn)涡裕淮拚蓟ⅲ?0］等利用psbA-trnH和rbcL兩個(gè)葉綠體通用引物對(duì)中成藥連翹敗毒丸中植物藥材的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，再將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分子克隆，通過挑取單克隆測序的方法鑒定出了連翹敗毒丸中6種原料藥材；Chen R［14］等人采用特異性引物PCR技術(shù)對(duì)含有人參的中成藥進(jìn)行分析，在其片劑、丸劑等劑型中均成功擴(kuò)增出人參的特異性DNA條帶，這些都是DNA分子鑒定技術(shù)對(duì)多味藥材組成的中成藥鑒別的有益嘗試。

2.2 以提取液入藥的中成藥

中成藥的一些新劑型中有些中藥材是以提取液入藥的，如復(fù)方丹參滴丸中的三七、地奧心血康膠囊中的薯蕷以及各種口服液、注射液中的各類藥材等，而現(xiàn)代提取工藝中主要用水提法、醇提法等，由于DNA不溶于乙醇，所以對(duì)經(jīng)過乙醇提取以及經(jīng)過乙醇沉淀的提取液，其中大部分DNA會(huì)被除去，僅留下極少量的DNA，這大大提高了此類中成藥中中藥材DNA提取和鑒定的難度，即使對(duì)水提取液入藥的中成藥，其DNA富集和鑒定的難度也較大，目前這方面的相關(guān)報(bào)道也較少。Chen R［14］等人曾利用巢式PCR技術(shù)檢測出了藿香正氣水中的半夏以及常見偽品虎掌半夏、水半夏，直接有效的解決了藿香正氣水中半夏摻假鑒定的難題。由此可見，對(duì)于部分以提取液入藥的中成藥中微量的DNA也可以通過擴(kuò)增后檢測。該文章還建立了含有人參和黨參口服液以及注射液中對(duì)應(yīng)藥材的檢測方法，并以比色探針為基礎(chǔ)開發(fā)了可視化檢測芯片技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測，提高了檢測效率，并使檢測結(jié)果更加直觀、可靠。

3　展望

綜上，隨著2015版藥典《中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則》的建立，將會(huì)有越來越多的中藥材DNA分子鑒定方法被收入藥典，同時(shí)也會(huì)有越來越多的研究聚焦到中成藥的DNA分子鑒定上來，利用其解決中成藥質(zhì)量控制中真?zhèn)舞b別等的一些難題，有效彌補(bǔ)現(xiàn)有分析方法的不足。但中成藥的DNA分子鑒定技術(shù)還存在一些亟待解決的問題，首先由于中成藥本身組成復(fù)雜、品種繁多、制劑不同、輔料添加等原因存在，增加了中成藥DNA分子鑒定的難度；其次，中成藥DNA分子鑒定是從分子角度對(duì)中成藥中所用藥材的“真?zhèn)巍边M(jìn)行鑒別，對(duì)于藥品的質(zhì)量尚無法進(jìn)行判斷；第三，對(duì)于利用正品藥材非藥用部位的摻假等也并不能鑒別。所以，我們要正確認(rèn)識(shí)和利用DNA分子鑒定技術(shù)的優(yōu)勢，建立和完善相應(yīng)中成藥的質(zhì)量控制、評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，從而不斷推進(jìn)中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程。

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（責(zé)任編輯：胡慧玲）

DNA identification of Chinese patent medicines: A review

CHEN Rong1， WU Cheng-li2， DENG Yun2， BIAN Jin-hui2// （1.

School of Ethnomedicine， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， Sichuan； 2. School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， Sichuan）

［Key words］DNA identification； Chinese patent medicines； review

［Abstract］To ensure clinical safety and efficacy， it is very important that the Chinese Patent Medicines （CPMs） are accurately identified. DNA identification which is conventionally used in molecular biology can be an effective supplementary of CPMs’quality control. This article reviews the general protocol of CPMs’ DNA identification and its application in the quality evaluation of Traditional Chinese Medicines. Additionally， the current problems and future development of CPMs’ DNA identification are also prospected at the end.

［中圖分類號(hào)］R 284.1

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1674-926X（2016）02-026-04

［基金項(xiàng)目］四 川省教育廳理工科一般項(xiàng)目（14ZB0077）；成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金（ZRQN1434）；四川省科技廳項(xiàng)目（2014SZ0071-4）

［作者簡介］陳 蓉（1987-），女，碩士，助教，主要從事中藥DNA分子鑒定研究

［通訊作者］卞 金輝（1975-），男，副教授，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

［收稿日期］2015-09-12