RNA干擾的系統(tǒng)生物學(xué)研究進展

張 清，石張鎮(zhèn)，許 人，王世寶，姜 娜，王 晶，郭艷茹，孫延霞*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 腫瘤血液科，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部 呼吸科)

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RNA干擾的系統(tǒng)生物學(xué)研究進展

張 清1，石張鎮(zhèn)1，許 人2，王世寶1，姜 娜1，王 晶1，郭艷茹1，孫延霞1*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 腫瘤血液科，吉林 長春130033；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部 呼吸科)

RNA干擾(RNAi)，又名RNA沉默，是指由雙鏈DNA(dsRNA)引起的特異性基因抑制現(xiàn)象。目前，RNAi已經(jīng)成為了一種非常強大的實驗方法，用于大規(guī)模的基礎(chǔ)和臨床研究。雖然體外RNAi效果很好，但它在應(yīng)用于體內(nèi)仍有挑戰(zhàn)性，這也是臨床應(yīng)用RNAi技術(shù)的難點。系統(tǒng)生物學(xué)是一個試圖整合不同層次信息以理解生物系統(tǒng)如何行使功能的學(xué)術(shù)領(lǐng)域。RNAi的系統(tǒng)生物學(xué)研究內(nèi)容主要包括：研究參與RNAi過程的組分，探索各不同組分之間的相互關(guān)系和相互作用，建立整個RNAi系統(tǒng)的可理解模型與仿真，用來指導(dǎo)合理的設(shè)計實驗和臨床上應(yīng)用RNAi為基礎(chǔ)的治療。

RNAi的動力學(xué)研究是RNAi系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要部分。對RNAi動力學(xué)的深入研究是臨床應(yīng)用RNAi的基礎(chǔ)，尤其確定取得臨床療效所需的給藥方案將是成功應(yīng)用RNAi的重要部分。目前研究體內(nèi)RNAi需要高成本投入，全面探索RNAi的過程，正確理解影響RNAi的動力學(xué)參數(shù)，可以專門定制和優(yōu)化用于科研與臨床的方案，從而節(jié)省大量的時間和資源。數(shù)學(xué)建模使用簡單的動力學(xué)方程反映RNAi過程中的每一步，可以揭示許多有關(guān)RNAi動力學(xué)方面的問題。部分研究者在這方面做了一些工作，也給我們帶來了更深的思考。以下就對于在研究RNAi系統(tǒng)生物學(xué)過程中的幾個關(guān)鍵問題進行分別闡述。

1 RNAi的機制

RNAi廣泛存在于真核細胞生物體中。1998年，美國科學(xué)家Fire和Mellow發(fā)現(xiàn)了RNAi的機制。細胞內(nèi)異常的dsRNA被Dicer酶(RNaseIII家族中成員，負責(zé)識別并切割dsRNA)特異性識別并切割成長為21-23nt的短雙鏈RNA，稱為小干擾RNA(siRNA)；siRNA與細胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、解旋酶等構(gòu)成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，作用是對靶mRNA進行識別和切割。RISC的解旋酶將其中的siRNA變成單鏈，成為有活性的RISC，RISC與靶mRNA互補結(jié)合，利用自身核酸內(nèi)切酶活性將mRNA切斷降解。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，RISC中的siRNA與靶mRNA結(jié)合時還可以作為引物，在RNA聚合酶(RdRp)的作用下，合成更多新的dsRNA。RNAi的核心途徑可以簡單概括為起始、效應(yīng)、放大三個階段。

除了siRNA，微小RNA(miRNA)也是基因表達的轉(zhuǎn)錄

后調(diào)控因子。miRNA是生物體中普遍存在的內(nèi)源性的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它通過RNAi機制發(fā)揮生物學(xué)作用，靶向抑制mRNA翻譯[1]，從而參與真核生物的幾乎所有基因的表達調(diào)控。一些研究表明，外源導(dǎo)入的siRNA能使體內(nèi)和體外細胞的RNAi途徑飽和，導(dǎo)致參與競爭的siRNAs的效果下降，而增加他們的靶基因的表達水平。而siRNAs使RNAi途徑飽和的同時，也能導(dǎo)致內(nèi)源性miRNA的功能失調(diào)[2，3]。即，外源引入的siRNA與內(nèi)源性miRNA這兩種小RNAs都與RNAi途徑相關(guān)。

2 RNAi的動力學(xué)及建模

起始階段，dsRNA被dicer酶剪切成siRNA。有實驗[4-6]表明dsRNA的初始劑量越大產(chǎn)生的沉默效應(yīng)越顯著。也就是說，RNAi反應(yīng)程度是受dsRNA初始劑量大小的影響。2005年，Groenenboom MA等人[7]對核心途徑建立了三個擴展模型對RNAi的劑量依賴性做出了系統(tǒng)生物學(xué)闡述。其中“RNase模型”說明了特異性核糖核酸酶(RNase)降解siRNA涉及的飽和動力學(xué)，即劑量依賴是由于siRNA降解酶的飽和引起。通過模型證實了每個mRNA產(chǎn)生的dsRNA數(shù)是確定閾值的主要因素，即每個mRNA產(chǎn)生的dsRNA越多，觸發(fā)基因沉默的閾值越低。同理，增加RdRp合成dsRNA的速率也可以使相關(guān)模型的閾值降低。另外一些研究也表明了閾值的存在：Lipardi等人[8]發(fā)現(xiàn)在果蠅胚胎提取的dsRNA劑量低于閾值濃度不能誘發(fā)RNAi，而十倍劑量時便能夠觸發(fā)RNAi；Li等人[9]的結(jié)果也說明了在斑馬魚胚胎，小劑量的dsRNA只引起部分表型的改變，而高劑量的dsRNA引起超過50%部分表型和35%全部表型的改變。部分表型的效果可以表明胚胎體內(nèi)只有短暫的反應(yīng)，而高劑量的dsRNA觸發(fā)全部表型改變能夠表明有持續(xù)的反應(yīng)。因此，RNAi的啟動依賴于dsRNA的初始劑量。另外，目前發(fā)現(xiàn)影響RNAi速率的生物成分還有Dicer酶[10，11]和Exportin-5[12]、dCRIF[13]等。

效應(yīng)階段，siRNA參與形成RISC，RISC與靶mRNA結(jié)合并將靶mRNA降解。在轉(zhuǎn)染實驗中觀察到同時引入2個或更多人工siRNAs會使其中某種siRNA基因沉默活性減低[1,14-17]。因此RISC形成過程中小RNAs間的競爭是RNAi的重要限速因素。Loinger A等[18]提出了一個基于速率方程的精細模型，揭示了由于各種不同小RNAs之間的競爭引起的基因表達的整體變化?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)這主要是由于miRNA與外源性siRNA競爭Argonaute蛋白(Ago蛋白)引起，Ago蛋白是形成RISC的核心組件[19]，siRNA需裝載在Ago蛋白上才能引起基因沉默效應(yīng)[20]。有研究發(fā)現(xiàn)真核生物細胞僅供應(yīng)有限的幾種類型的Ago蛋白，比如人體細胞提供4種類型的Ago蛋白[11]，限制siRNA/miRNA參與組裝RISC的能力[16-17,21-24]。越來越多的證據(jù)表明，RISC的催化成分與Ago蛋白的相互作用，是RNAi途徑的關(guān)鍵限速步驟。Khan等[3]也應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué)方法對小RNAs轉(zhuǎn)染實驗的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并通過構(gòu)建線性消退模型，證實了細胞內(nèi)RNAi的過程具有飽和效應(yīng)，RNAi的沉默速率與這種飽和效應(yīng)密切相關(guān)。

放大階段，以siRNA為引物、mRNA為模板在RdRp的作用下，合成更多的dsRNA。2003年，Bergstrom CT等人[25]提出了關(guān)于RNAi的單向放大模型，從RdRp的分子生物學(xué)角度說明在RdRp聚合作用下產(chǎn)生的dsRNAs與啟動沉默過程的dsRNAs不同。發(fā)生這種不同的原因是RNA聚合作用具有從5'到3'端的單向性，即合成dsRNA時，RdRp僅在引物片段的3'端方向操作，向引物片段上游延伸，上游的siRNAs在每一輪放大都增加，在連續(xù)一輪輪的放大之后，上游的siRNAs的不斷增多，而siRNA的分子數(shù)越來越小，直到siRNA分子數(shù)小至siRNA上游不能準備進一步的聚合，沉默反應(yīng)最終消失。這一單向放大模型說明了沉默效應(yīng)不能永久持續(xù)，單向放大確保沉默反應(yīng)將僅在持續(xù)輸入dsRNA的情況下持續(xù)下去，即RNAi效應(yīng)的持續(xù)需要dsRNA的濃度維持在某個特定范圍。而由于哺乳動物體內(nèi)缺乏RdRp，他們只能被dsRNA誘導(dǎo)短暫的沉默[26]，而缺乏了放大階段，因此維持沉默效應(yīng)只有通過不斷輸入dsRNA來完成。2006年，Derek W.Bartlett和Mark E.Davis[27]對哺乳動物體內(nèi)RNAi動力學(xué)的研究是實用且具有代表性的。他們研究RNAi從siRNA遞送到細胞內(nèi)起效的過程，研究主要對比了哺乳動物體內(nèi)快速分裂細胞、慢分裂細胞與不分裂細胞中RNAi的效應(yīng)程度和持續(xù)時間的影響因素，發(fā)現(xiàn)siRNA數(shù)量對基因沉默的作用大小有重大的影響，而對總持續(xù)時間影響較?。患毎对鲆鸬南♂屝?yīng)造成分裂細胞的基因沉默持續(xù)時間縮短；不分裂細胞基因沉默的持續(xù)時間不受細胞分裂稀釋作用的控制，而是受來自細胞內(nèi)siRNA內(nèi)在的穩(wěn)定的影響。這些結(jié)論在我們研究基因功能與基因治療中，能幫助我們分析和制定產(chǎn)生效應(yīng)的siRNA閾值、效應(yīng)持續(xù)時間、影響因素及變化特點等。

3 展望

綜上，盡管目前RNAi技術(shù)用于抑制基因的表達已相當成熟，但RNAi在用于基因治療上仍面臨很大的挑戰(zhàn)，不僅包括siRNA遞呈的載體和方式，更重要的內(nèi)容是如何根據(jù)基因沉默的閾值、細胞增長率、siRNA穩(wěn)定性等參數(shù)來指定給藥方案。盡管RNAi的系統(tǒng)生物學(xué)研究使我們對RNAi的機制有了更深的理解，但現(xiàn)階段我們還缺少大量的實驗來驗證我們設(shè)計的每一個模型是否真實有效，另外，已有模型尚不能模擬RNAi的全過程。隨著人們不斷的探索創(chuàng)新與完善，相信將來RNAi技術(shù)不僅在科研上而且在臨床上也能得到廣泛應(yīng)用。

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吉林省自然科學(xué)基金項目(201215069)

1007-4287(2016)10-1783-03

2016-05-10)

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