復(fù)方中草藥對(duì)虹鱒抗氧化能力的影響

孫裔雷,王荻,劉紅柏

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江 哈爾濱 150070；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 漁業(yè)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

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復(fù)方中草藥對(duì)虹鱒抗氧化能力的影響

孫裔雷1、2,王荻1,劉紅柏1

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所,黑龍江 哈爾濱 150070；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 漁業(yè)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

摘要:為了將中草藥作為飼料添加劑長(zhǎng)期應(yīng)用于虹鱒養(yǎng)殖生產(chǎn)，探討了復(fù)方中草藥對(duì)虹鱒Oncorhynchus mykiss抗氧化能力的影響。在水溫為(17±1) ℃條件下，將體質(zhì)量為(200.0±1.5) g 的1+齡虹鱒隨機(jī)分為2個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組120尾魚，每組設(shè)1個(gè)平行，飼養(yǎng)在室外循環(huán)水圓形水泥池(直徑6 m)中。兩個(gè)試驗(yàn)組魚分別投喂添加茵陳、板藍(lán)根等(復(fù)方一)和添加紫草、金銀花等(復(fù)方二)的全價(jià)飼料，對(duì)照組魚只投喂全價(jià)飼料，共飼養(yǎng)30 d。停飼24 h后，采集試驗(yàn)魚的血清、肝臟、脾臟、腎臟，測(cè)定各組織中丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量，以及總一氧化氮合酶(TNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的活性及總抗氧化能力(T-AOC)。結(jié)果表明：兩個(gè)試驗(yàn)組虹鱒肝臟中SOD活性均上升， MDA含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；復(fù)方一試驗(yàn)組肝、脾和腎臟中NO含量，脾臟中iNOS活性以及血清中T-AOC活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，血清中GSH-PX活性也相應(yīng)提高；復(fù)方二試驗(yàn)組腎臟中NO含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。研究表明，復(fù)方一較復(fù)方二能更有效地提高虹鱒的抗氧化能力。

關(guān)鍵詞:虹鱒；中草藥；抗氧化

動(dòng)物體內(nèi)抗氧化能力與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，是機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分?；钚匝跏菣C(jī)體內(nèi)最常見的自由基，對(duì)機(jī)體發(fā)揮正常的生理功能具有重要意義[1]。但在感染、應(yīng)激或營(yíng)養(yǎng)缺乏等異常情況下，自由基代謝平衡失調(diào)，機(jī)體產(chǎn)生過量的活性氧自由基，會(huì)引起機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、蛋白質(zhì)氧化損傷、DNA損傷等[2]，造成多種器官功能異?；蚪M織病變[3]。機(jī)體抗氧化系統(tǒng)作為一種完整而復(fù)雜的自由基清除系統(tǒng)，具有清除動(dòng)物體內(nèi)多余活性氧、保護(hù)自身免受氧化損傷的功能[4]。該系統(tǒng)包括一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、維生素E等多種抗氧化劑。與人工合成的抗氧化劑相比，抗氧化系統(tǒng)在清除體內(nèi)過量自由基和治療疾病方面效果更佳。因此，提高抗氧化系統(tǒng)的機(jī)能對(duì)保持機(jī)體正常的生理狀態(tài)具有十分重要的意義。

中草藥為天然藥物，富含增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能的活性物質(zhì)，具有毒副作用小、資源豐富、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中備受青睞[5]。中草藥的種類豐富，針對(duì)不同的作用對(duì)象和目的具有多種配伍，為防治疾病、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能提供了多種選擇[6]。因此,對(duì)具有較強(qiáng)抗氧化性的天然中草藥的研究已受到人們的重視[7]。研究表明，中草藥添加劑能較好地促進(jìn)施氏鱘Acipenserschrenckii[8]、哲羅鮭Huchotaimen[9]的抗氧化能力。

虹鱒Oncorhynchusmykiss是一種珍貴的世界性冷水養(yǎng)殖魚類[10]。該魚食用價(jià)值高、生長(zhǎng)迅速、易捕撈、人工繁殖簡(jiǎn)便易行，已成為聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織向全世界推廣的產(chǎn)量高且品質(zhì)優(yōu)良的四大淡水魚類養(yǎng)殖品種之一[11]。本研究中，分析了兩種自組復(fù)方中草藥飼料添加劑對(duì)虹鱒抗氧化能力的影響，為篩選適合的中草藥配伍方劑，長(zhǎng)期應(yīng)用于虹鱒養(yǎng)殖生產(chǎn)中提供參考。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)用健康、非免疫狀態(tài)下的1+齡虹鱒購(gòu)自渤海冷水性魚類試驗(yàn)站，體質(zhì)量為(200.0±1.5)g。試驗(yàn)用中草藥購(gòu)自哈爾濱世一堂藥店，烘干后備用。各試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)飼料的制備試驗(yàn)選用2種自組復(fù)方中草藥，復(fù)方一由茵陳、板藍(lán)根等組成，復(fù)方二由紫草、金銀花等組成。試驗(yàn)飼料中復(fù)方一中草藥添加量為8.10 g/kg(飼料)，復(fù)方二中草藥添加量為16.25 g/kg(飼料)。

按照各復(fù)方配比稱取中草藥，參照董曉慧等[12]的方法制備試驗(yàn)飼料，并將制備好的試驗(yàn)飼料于冰箱(-18 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)魚先采用全價(jià)基礎(chǔ)飼料預(yù)飼2周。試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)復(fù)方中草藥試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組120尾魚，每組設(shè)置1個(gè)平行。試驗(yàn)時(shí)，按照魚體質(zhì)量的2.5%確定投喂量(以投喂后當(dāng)場(chǎng)吃完為宜)，2個(gè)試驗(yàn)組分別用2種添加復(fù)方中草藥的基礎(chǔ)全價(jià)飼料投喂，對(duì)照組投喂全價(jià)基礎(chǔ)飼料，每天投喂2次。定期清理水池污物，試驗(yàn)于室外圓形水泥池(直徑6 m)中進(jìn)行，循環(huán)水養(yǎng)殖，水溫為(17±1) ℃，連續(xù)投喂30 d。

表1試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料配方及主要營(yíng)養(yǎng)成分

Tab.1Ingredients and approximate composition of the basic diet

w/%

注：1)預(yù)混劑中包括復(fù)合維生素0.3%、復(fù)合微量元素0.2%、膽堿0.2%、氧化鎂0.2%、防霉劑0.02%、磷酸二氫鈣1.0%

Note: Premix contains complex vitamin 0.3%, trace element 0.2%, choline 0.2%, MgO 0.2%, mildew preventive 0.02%, CaH2PO41.0%

1.2.3樣品的采集試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)平行組中隨機(jī)選取15尾魚，從其尾動(dòng)(靜)脈采血，4 ℃下以3500 r/min離心20 min，取血清；解剖取魚肝臟、脾臟、腎臟組織樣本。將每尾魚的血清及組織樣本均于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定

(1) 樣品處理。將試驗(yàn)魚各組織樣本分別與生理鹽水混合，充分勻漿，按不同檢測(cè)指標(biāo)及試劑盒要求的速度和時(shí)間離心，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。血清在水浴中融化后即可檢測(cè)，每個(gè)指標(biāo)檢測(cè)的樣本數(shù)均為15。

(2) 指標(biāo)的測(cè)定。按照各試劑盒說明書方法，測(cè)定一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量和總抗氧化能力(T-AOC)，以及總一氧化氮合酶(TNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性。TNOS、iNOS活力單位定義為：每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol NO為一個(gè)酶活力單位(U)。SOD活力單位定義為：1 mg組織勻漿液中，對(duì)SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U)。GSH-PX活力單位定義為：每毫升反應(yīng)液中，對(duì)GSH-PX抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的GSH-PX量為一個(gè)GSH-PX活力單位(U)。T-AOC活力單位定義為：每分鐘每毫升血清使反應(yīng)體系的吸光度值每增加0.01時(shí)，為1個(gè)總抗氧化能力單位(U)。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行組間顯著性比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2結(jié)果與分析

2.1肝臟、脾臟、腎臟中NO含量及TNOS、iNOS活性的變化

從表2可見：復(fù)方一組虹鱒肝臟、脾臟、腎臟中NO含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；復(fù)方二組魚腎臟中NO含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，肝臟和脾臟中NO含量與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。

從表3可見：復(fù)方一、復(fù)方二對(duì)虹鱒脾臟中TNOS活性有一定的促進(jìn)作用,但與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)；復(fù)方一組iNOS活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，復(fù)方二組略高于對(duì)照組，但無顯著性差異(P>0.05)。

2.2肝臟中SOD活性及MDA含量的變化

表2復(fù)方中草藥對(duì)虹鱒肝臟、脾臟、腎臟中NO含量的影響

Tab.2Effect of compound Chinese herbal medicines on NO content in liver, spleen and kidney of the rainbow trout

μmol/g

注：同列中標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)；標(biāo)有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同

Note: The means with different letters within the same column are significantly different at the 0.05 probability level; and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

表3復(fù)方中草藥對(duì)虹鱒脾臟中TNOS和iNOS活性的影響

Tab.3Effect of compound Chinese herbal medicines on activities of spleen TNOS and iNOS in rainbow trout

U/mg

表4復(fù)方中草藥對(duì)虹鱒肝臟中SOD活性及MDA含量的影響

Tab.4Effects of compound Chinese herbal medicines on SOD activity and MDA content in liver of rainbow trout

組別group超氧化物歧化酶/(U·mg-1)SOD丙二醛/(nmol·mg-1)MDA對(duì)照control14.41±1.53a3.53±0.78b復(fù)方一compound117.76±1.38a3.22±0.71ab復(fù)方二compound214.83±1.26a1.58±0.27a

從表4可見：2種復(fù)方中草藥對(duì)虹鱒肝臟中SOD活性具有一定的促進(jìn)作用，但與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)；復(fù)方二組MDA含量顯著低于對(duì)照組(P>0.05)，復(fù)方一組略低于對(duì)照組，但無顯著性差異(P>0.05)。

2.3血清中T-AOC和GSH-PX活性的變化

從表5可見：復(fù)方一組魚血清中的T-AOC活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，復(fù)方二組略高于對(duì)照組，但無顯著性差異(P>0.05)；2種復(fù)方中草藥對(duì)試驗(yàn)魚血清中GSH-PX活性具有一定的促進(jìn)作用，但與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。

表5復(fù)方中草藥對(duì)虹鱒血清中T-AOC和GSH-PX活性的影響

Tab.5Effect of compound Chinese herbal medicines on activities of serum T-AOC and GSH-PX in rainbow trout

U/mL

3討論

3.1中草藥對(duì)虹鱒NO含量及TNOS活性的影響

NO作為免疫調(diào)節(jié)劑、神經(jīng)遞質(zhì)和血管擴(kuò)張劑，廣泛分布于動(dòng)物體各組織中。NO可與機(jī)體組織中超氧化物陰離子形成不活躍的亞硝酸鹽，發(fā)揮超氧化物細(xì)胞毒效應(yīng)的化學(xué)屏障作用，因此，也被稱為超氧化物清除劑[13]。NO可直接與導(dǎo)致膜脂過氧化反應(yīng)和細(xì)胞死亡的脂質(zhì)烷氧基、過氧化氫自由基反應(yīng)，終止脂質(zhì)自由基傳播鏈反應(yīng)，最終達(dá)到抗氧化目的[14]。NO與鐵可生成亞硝酰鐵，阻止金屬催化的活性氧的形成，抑制叔丁基過氧化氫生成烷氧基和過氧化氫自由基[13]。機(jī)體中TNOS包括eNOS、nNOS、iNOS三種類型。正常生理狀態(tài)下，eNOS、nNOS表達(dá)水平較低，僅維持機(jī)體正常生理功能，但在炎癥狀態(tài)下，iNOS被激活產(chǎn)生大量NO，導(dǎo)致組織損傷[15]。許多中草藥對(duì)NO的生成具有調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)中，復(fù)方一組虹鱒肝臟、脾臟、腎臟中NO含量顯著高于對(duì)照組；復(fù)方二組魚腎臟中NO含量顯著高于對(duì)照組，肝臟和脾臟中NO含量與對(duì)照組無顯著性差異；2種復(fù)方對(duì)虹鱒脾臟TNOS活性有一定促進(jìn)作用。這表明2種復(fù)方在虹鱒機(jī)體內(nèi)起到了抗氧化作用，促進(jìn)了體內(nèi)氧自由基的清除。但NO針對(duì)細(xì)胞氧化損傷具有兩相性，低濃度的NO可以保護(hù)組織細(xì)胞免受損傷，隨著濃度的增加，NO將會(huì)從抗氧化劑轉(zhuǎn)變成氧化劑。因此，合理使用中草藥是保證機(jī)體健康的重要因素。

3.2中草藥對(duì)虹鱒SOD活性及MDA含量的影響

MDA作為氧自由基攻擊多不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過氧化物[18]，可間接反映機(jī)體內(nèi)活性氧自由基水平和脂質(zhì)過氧化程度，間接反映出機(jī)體受損傷的情況[19]。肝臟中，復(fù)方二組魚的MDA含量顯著低于對(duì)照組，復(fù)方一組略低于對(duì)照組。這表明本試驗(yàn)用2種復(fù)方中草藥均能降低MDA含量，不同程度地削弱了產(chǎn)生自由基的能力，降低了組織損傷程度，對(duì)機(jī)體存在積極影響。試驗(yàn)組間存在差異性的原因可能是同一類藥性藥物的化學(xué)成分不同，且機(jī)體機(jī)能狀態(tài)可以影響藥物作用，從而造成機(jī)體對(duì)藥物的吸收、分布和代謝出現(xiàn)差異，最終導(dǎo)致藥物的生物效應(yīng)不同[20]。

3.3中草藥對(duì)虹鱒T-AOC和GSH-PX活性的影響

T-AOC是機(jī)體抗氧化和清除自由基能力的總和，是衡量抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標(biāo)[21]，可代表和反映機(jī)體對(duì)外來刺激的代償能力以及機(jī)體自由基代謝的狀態(tài)[22]，對(duì)機(jī)體體液、細(xì)胞、組織酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)抗氧化能力綜合評(píng)判具有重要的意義。本試驗(yàn)中，虹鱒飼料中添加2種復(fù)方中草藥后，復(fù)方一組魚血清中T-AOC活性顯著高于對(duì)照組，復(fù)方二組略高于對(duì)照組，這表明復(fù)方一提高機(jī)體抗氧化的能力更強(qiáng)。石宏武等[23]研究發(fā)現(xiàn)，投喂中草藥飼料后，金魚組織中T-AOC活性先短暫升高，隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，組織中毒性產(chǎn)物的量超過了機(jī)體的清除能力，抗氧化保護(hù)機(jī)制受損，造成組織損傷。說明在試驗(yàn)過程中，魚機(jī)體可能受到中草藥毒性成分損傷。本試驗(yàn)中僅添加了一種濃度的復(fù)方中草藥，也未觀察鰓、血液、肝臟等組織器官是否出現(xiàn)損傷變化，因此，這2種復(fù)方中草藥的最佳添加濃度及毒性損傷需進(jìn)一步研究。

GSH-PX具有清除機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物、消除活性氧自由基對(duì)組織損傷的功能，是一種常見的活性氧自由基清除劑[24]。本試驗(yàn)中，復(fù)方一促進(jìn)了試驗(yàn)魚血清中GSH-PX的活性，與SOD、T-AOC等的變化規(guī)律一致，這表明復(fù)方一作為飼料添加劑可以提高虹鱒抗氧化能力。

綜上所述，本試驗(yàn)中選取的2種復(fù)方中草藥抗氧化劑中，復(fù)方一在降低肝臟中MDA含量，提高肝臟中SOD、血清中T-AOC和GSH-PX的活性和肝臟等組織中NO含量等的效果更為明顯，能明顯增強(qiáng)虹鱒機(jī)體的抗氧化能力，推測(cè)其作為一種飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。

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Effects of dietary Chinese herbal medicine compounds

on antioxidant capacity in rainbow trout

SUN Yi-lei1,2, WANG Di1, LIU Hong-bai1

(1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070,China; 2. Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract：A feeding trial was conducted to evaluate the effects of two kinds of Chinese herbal compound on antioxidant defenses of rainbow trout Oncorhynchus mykiss for application of Chinese herbal compound in rainbow trout culture. Juvenile rainbow trout of 1+old with body weight of (200.0±1.5)g were randomly divided into outdoor circulating circular tanks at a rate of 120 fish per tank and fed basal diet and the diets containing two kinds of Chinese herbal medicine compounds (No.1 Artemmisia capillaries and Isatis indigotica; No.2 Arnebia guttata and Lonicera japonic)at feeding rate of 2.5% with duplication at water temperature of (17±1) ℃ for 30 days. The NO and malonaldehyde (MDA) contents, activities of total nitric oxide synthase (TNOS), inducible nitric oxide synthase (iNOS), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-PX) and total antioxidant capacity (T-AOC) were determined in serum, liver, spleen and kidney of the rainbow trout fasted for 24 hours at the end of the experiment. The results showed that there were significantly higher activity of SOD and significantly lower content of MDA in liver in the rainbow trout fed the diets containing Chinese herbal medicines than those in the juveniles fed the basal diet (P<0.05). The contents of NO in liver, spleen and kidney, the activity of iNOS in spleen, and the serum T-AOC were found to be increased significantly in the rainbow trout fed the diets containing Chinese herbal compound 1 (P<0.05), with higher activity of GSH-PX in serum. The rainbow trout fed the diets containing Chinese herbal compound 2 had significantly higher content of NO in the kidney. The findings indicate that compound 1 improves the antioxidant capacity effectively, and can be used as an excellent antioxidant of Chinese herbal medicine for rainbow trout.

Key words：Oncorhynchus mykiss; Chinese herbal medicine; antioxidant capacity

通信作者：劉紅柏(1970—)， 女， 博士， 研究員。E-mail:liuhongbai@sina.com

作者簡(jiǎn)介：孫裔雷(1989—)， 男， 碩士研究生。E-mail:sunyileiabb@sina.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD25B10)

收稿日期：2014-06-13

中圖分類號(hào)：S942.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-1388(2015)02-0170-05

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.011