基于網(wǎng)絡藥理學探究九香蟲腎保護作用機制

何天目段燦燦侯曉暉李曉飛張建永*

（1.遵義醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，貴州 遵義563003； 2.遵義醫(yī)科大學藥學院，貴州 遵義563003； 3.遵義醫(yī)科大學基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義563003）

九香蟲是半翅目蝽科兜蝽屬九香蟲（Aspongopus chinensisDallas）的干燥體，別名打屁蟲、屁巴蟲等，廣泛分布于貴州、云南、四川等地，是我國傳統(tǒng)中藥昆蟲。始載于《本草綱目》：“咸溫無毒，用于膈脘滯氣，脾腎虧損，壯元陽”?！侗静菪戮帯?中記載：“蟲中之至佳者，亦興陽之物，以扶衰弱最宜”［1］，古籍皆強調(diào)了其對腎的補益作用。2020 年版《中國藥典》 收錄九香蟲，認為其歸肝、脾、腎經(jīng)，具有理氣止痛，溫中助陽的功效，主治腎虛陽痿，胃寒脹痛等［2］。同時九香蟲在民間常用于泡酒，具有補腎壯陽、理氣止痛、興陽益精之功效［3］。九香蟲發(fā)揮腎保護作用的功效屢有記載，其機制可能與尿素循環(huán)、抑制轉(zhuǎn)化生長因子基因磷酸化、抗炎等有關［4?9］，但其具體分子機制尚不清楚。

網(wǎng)絡藥理學是基于“藥物?靶點?疾病”相互作用網(wǎng)絡關系，通過分析基因、疾病、藥物等網(wǎng)絡庫的關聯(lián)，利用專業(yè)算法及網(wǎng)絡分析軟件，整體揭示“藥物?靶點”、“靶點?疾病”、“藥物?疾病”互作的奧秘，揭示復雜藥物協(xié)同作用于人體的奧秘，并指導臨床精準用藥及新藥研發(fā)［10］。目前，網(wǎng)絡藥理學已經(jīng)被廣泛用于中藥腎毒性等的研究中，如有研究采用網(wǎng)絡藥理學方法分析雷公藤腎毒性［11］、商陸腎損傷［12］、朱砂安神丸肝腎解毒等作用機制［13］，為其臨床應用提供參考。

綜上，本研究擬采用網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術探討九香蟲腎保護作用機制，為提高九香蟲的藥用效應，擴大其臨床應用提供新的線索。

1 方法

1.1 九香蟲活性成分篩選及靶點預測 本研究通過檢索中國知網(wǎng)、萬方、Pubmed、Web of Science 等國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫，獲取九香蟲主要化學成分，經(jīng)Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）驗證和轉(zhuǎn)化，并整理分類。

1.2 九香蟲靶點預測及網(wǎng)絡構建 采用Chemdraw19.0 軟件繪制活性成分的結構后輸入到 Targetnet 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／targetnet.scbdd.com／）預測作用靶點，篩選條件為：預測準確率（Accuracy，AUC）＞＝0.7，預測概率（Probability，Prob）＞0.9［14］。并經(jīng)Uniprot（https：／ ／www.uniprot.org／）校正和轉(zhuǎn)化，確定物種為“Homo sapiens”的靶點。進一步采用Cytoscape3.7.0 軟件構建九香蟲“成分?靶點”網(wǎng)絡，并運用Network Analyzer 插件分析網(wǎng)絡拓撲參數(shù)。

1.3 九香蟲腎保護作用潛在靶點預測 通過在GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.genecards.org／）、比較基因組學毒理數(shù)據(jù)庫（The Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：／ ／ctdbase.org／）、Digsee 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／210.107.182.71／geneSearch／）中輸入 關鍵詞“腎毒性（nephrotoxicity）、腎損傷（renal injury、kidney injury）”，篩選已報道的、標記有“marker／mechanism”的基因，剔除重復基因，得到腎損傷靶標數(shù)據(jù)庫，并經(jīng)Uniprot 校正，篩選物種為“Homo sapiens”的靶點，利用image GP 工具（http：／ ／www.ehbio.com／ImageGP／index.php／）繪制維恩圖整合九香蟲腎保護共同靶點。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡與“核心成分?靶點”網(wǎng)絡構建String［15］（Search Tool for the Retrieval of InteractingGenes／Proteins，Version：11.0，http：／ ／string?db.org／）數(shù)據(jù)庫旨在整合所有可公開獲得的蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用信息來源，搜尋已知蛋白質(zhì)和預測蛋白質(zhì)之間相互作用的系統(tǒng)。將九香蟲腎保護共同靶點導入String 數(shù)據(jù)庫，選用Multiple proteins 工具，篩選物種為人源，選取高置信度（high con?fidence，0.7），獲取蛋 白相互作用。將其導 入Cytoscape3.7.0 軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡（protein protein interaction network，PPI network），并與“成分?靶點”網(wǎng)絡圖進行融合（Merge），運用Network Analyzer 插件分析網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，篩選出節(jié)點度高于平均值的節(jié)點進一步構建“核心成分?靶點”網(wǎng)絡，用于后續(xù)分析。

1.5 核心靶點基因功能及通路分析 Enrichr［16］數(shù)據(jù)庫（http：／ ／amp.pharm.mssm.edu／Enrichr／＃）常用于基因富集分析，包含來自102 個基因集庫的180 184 個帶注釋的基因集。同時將“1.4”項下篩選后的核心靶點導入Enrichr 網(wǎng)站，選取GO 生物進程（Biological Process）、細胞組分（Cellular Component）、分子功能（Molecular Function）及Pathways（KEGG 2019 Human）進行GO、KEGG 通路富集分析。以P＜0.05 為條件，依據(jù)綜合得分（combined score），通過image GP 工具繪制“GO 細胞組分、分子功能及生物進程富集分析”及“KEGG 通路富集氣泡圖”。

1.6 iGEMDOCK 分子對接 iGEMDOCK［17］是開源的分子對接軟件，用于系統(tǒng)評估和活性篩選，通過基于對接位點（蛋白質(zhì)?配體作用）和化合物性質(zhì)（原子組成）使用k?均值和分層聚類方法提供后分析工具，能直接導入配體分子進行對接，并且允許多個配體同時進行對接。其能量打分函數(shù)通過蛋白質(zhì)?化合物相互作用的靜電、氫鍵和范德華力打分，結果以能量的高低去判斷結合程度，化合物分子與受體結合的構象穩(wěn)定時能量越低，結合性越高。將九香蟲核心成分與靶點進行分子對接，并以腎保護藥物卡托普利（Captopril，Pubchem ID：44093）及氯沙 坦（Losartan，Pubchem ID：3961）作為陽性對照藥［18?19］。具體方法為，首先在在PDB 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.rcsb.org／）中搜索靶點的蛋白結構，限定物種為人，以PDB 格式上傳后選擇限定配體（bounded ligand）類型準備對接；核心成分通過Chem 3D 19.0 軟件使化合物能量最小化后以Mol 格式上傳后選擇標準對接模式進行分子對接，具體對接參數(shù)為generic evolutionary method ＝200、generation ＝70、number of solution＝2。

2 結果

2.1 九香蟲活性成分篩選 通過檢索國內(nèi)外文獻，經(jīng)Pubchem 轉(zhuǎn)化，剔除相同成分，共篩選到九香蟲活性成分93 種，見表1，且與文獻報道的九香蟲主要活性成分相符。主要分為核苷酸類（18 種）、多巴胺類（18 種）、營養(yǎng)成分（16 種）、芳香類成分（5 種）及其他成分（36 種）。其中，多巴胺類（±）?Aspongamide A、Aspongopusamide A、N?乙酰多巴胺及3，4?二羥基苯丙酮等腎保護作用成分在本研究中均被收錄［4?5］。

表1 九香蟲主要活性成分

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 九香蟲靶點預測及網(wǎng)絡構建 采用Targetnet 數(shù)據(jù)庫預測93 個活性成分的作用靶點，并經(jīng)Uniprot 校正后共獲取靶點288 個。進一步采用Cytoscape3.7.0 軟件構建九香蟲“成分?靶點”網(wǎng)絡，見圖1。其中，按照度值大小排名前五的成分為1，2?苯二醇（O22，degree＝83）、2，3?丁二醇（O31，degree ＝79）、3，4?二羥基苯乙醇（O23，degree ＝72）、十三烷（Q1，degree ＝70）、十二烷二酸（Y9，degree＝70）；排名前五的靶點為碳酸酐酶6（Carbonic anhydrase 6，CA6，degree ＝69）、碳酸酐 酶7（Carbonic anhydrase 7，CA7，degree＝65）、碳酸酐酶5B（Carbonic anhydrase 5B，CA5B，degree ＝64）、碳酸酐酶5 A（Carbonic anhydrase 5 A，CA5A，degree ＝63）、羧酸酯酶2（Cocaine esterase，CES2，degree＝59）。

圖1 九香蟲“成分?靶點”網(wǎng)絡

2.3 九香蟲腎保護作用潛在靶點預測 以腎毒性（nephro?toxicity）及腎損傷（renal injury、kidney injury）為關鍵詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索到靶點1 432 個、CTD 數(shù)據(jù)庫檢索到102 個、Digsee 數(shù)據(jù)庫檢索到279 個，去除重復靶點，并經(jīng)Uniprot 校正整合共得到腎毒性相關靶點1 565 個。腎毒性相關1 565 個靶點與九香蟲288 個靶點取交集得到九香蟲發(fā)揮腎保護作用潛在靶點104 個，用于后續(xù)進一步分析。

2.4 蛋白相互作用（PPI）與“核心成分?靶點”網(wǎng)絡構建分析 將九香蟲腎保護104 個靶點蛋白導入String 數(shù)據(jù)庫中，獲取相互作用關系，去除孤立靶點后得到94 個靶點蛋白，隨后將結果導入Cytoscape 3.7.0 軟件構建PPI 網(wǎng)絡，見圖2。并與“成分?靶點”網(wǎng)絡圖進行融合，去除孤立節(jié)點共有182 個節(jié)點。其中88 個節(jié)點代表九香蟲成分，平均度值為10.55，大于平均度值的成分有49 個；94 個節(jié)點代表九香蟲腎保護靶點，平均度值為16.02，大于平均度值的靶點有36 個，將49 個活性成分與36 個靶點構建“核心成分?靶點”網(wǎng)絡，見圖3，運用Network Analyzer 插件按照度值大小排名前10 核心成分、靶點見表2。

表2 九香蟲腎保護核心成分?靶點（Top10）

圖3 九香蟲腎保護“核心成分?靶點”網(wǎng)絡

圖2 蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡

2.5 GO 富集分析和KEGG 靶點通路注釋分析 將篩選出的36 個核心靶點導入Enrichr 數(shù)據(jù)庫，以P＜0.05 為條件進行GO 富集分析及KEGG 通路注釋分析，結果按綜合得分大小排列。GO 分析得到686 個生物進程、90 個分子功能及29 個細胞組分，結果見圖4（Top10）。KEGG 通路注釋分析，共富集到91 條關鍵通路，根據(jù)綜合得分大小取前20條通路，并用image GP 工具進行可視化，見表3、圖5。

表3 KEGG 通路富集分析（Top20）

圖4 GO 細胞組分、分子功能及生物進程富集分析（Top 10）

圖5 KEGG 通路富集氣泡圖（Top 20）

2.6 iGEMDOCK 分子對接 采用iGEMDOCK V2.1 軟件將九香蟲腎保護“核心成分?靶點”網(wǎng)絡中的49 個核心成分與度值較高的10 個核心靶點選擇對接位點后進行分子對接，見表4，其中Toll 樣受體（Toll?like receptor 9，TLR9）因無人源蛋白結構未進行分子對接。配體與受體結合的構象穩(wěn)定時能量越低，結合可能性越大。其分子對接結果見圖6，1，2?脫氫?N?乙?；喟桶罚―1）、3，4?二羥基苯基乙酸（O24）、阿斯吡嗪（O16）、亞麻酸（Y6）等結合性較強，且與陽性藥結果相似，內(nèi)皮型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，endothelial，NOS3）、花生四烯酸5?脂氧合酶（Arachidonate 5?lipoxygenase，ALOX5）、組蛋白去乙?；福℉istone deacetylase 4，HDAC4）、轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor p65，RELA）及半胱天冬酶9（Caspase?9，CASP9）等靶點結合性也較高。其中NOS3 靶點與成分3，4?二羥基苯基乙酸（O24）及1，2?脫氫?N?乙?；喟桶罚―1）結合性較強，見圖7。

圖6 九香蟲腎保護靶點分子對接結果

表4 九香蟲腎保護靶點分子對接信息

圖7 NOS3 與O24、D1 最佳對接形式

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為腎為“先天之本”、“生命之源”，腎具藏精、主水、主納氣、主骨、生髓等功效［20］。九香蟲作為傳統(tǒng)中藥，因其補腎壯陽、興陽益精、氣血雙宣之功效而被廣泛藥食兩用，正如民間常說“有錢人吃人參鹿茸，無錢人吃打屁蟲”。目前研究發(fā)現(xiàn)，九香蟲水提取物灌胃腎陽虛小鼠后，小鼠血清中尿素含量下降，力竭游泳時間延長，具有腎保護作用［1］。九香蟲提取物Aspongopusamide A、N?乙酰多巴胺及3，4?二羥基苯丙酮等可能通過抑制環(huán)氧合酶?2（Prostaglandin G／H synthase 2，COX?2／PTGS2）對高糖誘導的系膜細胞發(fā)揮腎保護作用［4］。也有研究發(fā)現(xiàn)九香蟲中（±）?Aspongamide A 在腎細胞上能抑制轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor?β1，TGF?β1）誘導的基因磷酸化，并能抑制高糖誘導的促細胞炎癥因子和膠原分泌，在慢性腎病及腎纖維化上發(fā)揮腎保護作用［5］。同時，結合本研究中“PPI”網(wǎng)絡及通路富集分析進一步探析發(fā)現(xiàn)，Aspongopusamide A、N?乙酰多巴胺及3，4?二羥基苯丙酮可能通過基 質(zhì)金屬 蛋白酶9（Matrix metalloproteinase?9，MMP9）、環(huán)氧合 酶?1（Prostaglandin G／H synthase 1，PTGS1）、TLR9、ALOX5 等靶點間接作用于COX?2 靶點，且與調(diào)節(jié)白細胞介素17（interleukin 17，IL?17）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）信號通路、5?羥色胺能突觸及花生四烯酸代謝有關。此外，TLR9、PTGS1 及ALOX5 等靶點在“核心成分?靶點”網(wǎng)絡中度值均較高，表明本研究預測較準，同時新發(fā)現(xiàn)的靶點通路，為進一步研究提供了參考。因此開展網(wǎng)絡藥理學研究對于更好揭示九香蟲腎保護作用具有一定意義。

3.1 九香蟲腎保護“多成分?多靶點?多通路”特點與分子對接驗證 經(jīng)九香蟲腎保護“核心成分?靶點”網(wǎng)絡及KEGG 通路富集分析，九香蟲發(fā)揮腎保護作用的核心成分有49 個，核心靶點36 個，關鍵通路達91 條，揭示了九香蟲發(fā)揮腎保護作用是通過多成分、多靶點、多通路共同作用的機制。經(jīng)分子對接驗證，阿斯吡嗪、亞麻酸、1，2?脫氫?N?乙?；喟桶返瓤赡苁前l(fā)揮腎保護作用的活性成分。核心“成分?靶點”網(wǎng)絡中度值較高的NOS3、ALOX5、HDAC4 及RELA 等核心靶點與九香蟲成分結合性也較強，提示本次靶點預測準確性較高。整合網(wǎng)絡及通路富集分析，九香蟲可能通過“腎素分泌”、“腎素?血管緊張素系統(tǒng)”、花生四烯酸代謝、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、精氨酸代謝等通路發(fā)揮腎保護作用，并將以上通路結果可視化，見圖8。

圖8 關鍵KEGG 通路分析

3.2 九香蟲可能通過“腎素分泌”、“腎素?血管緊張素系統(tǒng)”發(fā)揮腎保護作用 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（Angiotensin?converting enzyme，ACE）、前列腺素E2 受 體EP2 亞型（Prostaglandin E2 receptor EP2 subtype，PTGER2）、前列腺素E2 受體EP4 亞型（Prostaglandin E2 receptor EP4 subtype，PTGER4）和腺苷受體 A1（Adenosine receptor A1，ADORA1）靶點參與了腎素分泌通路；ACE、氨肽酶（Aminopeptidase N，ANPEP）靶點參與了“腎素?血管緊張素系統(tǒng)”通路。其中，ACE 可作用血管緊張素Ⅱ（Angio?tensin Ⅱ，AngⅡ）生成腎素，發(fā)揮收縮血管和刺激醛固酮分泌的生理效應。有研究發(fā)現(xiàn)ACE 活性降低可導致AngⅡ水平降低，從而保護腎細胞［21］。有研究發(fā)現(xiàn)抑制糖尿病腎病小鼠COX?2 表達下調(diào)尿前列腺素E2 水平抑制腎素分泌發(fā)揮腎保護作用［22］。因此，九香蟲可能通過作用于ACE 等靶點，通過調(diào)節(jié)腎素分泌等發(fā)揮腎保護作用。

3.3 九香蟲腎保護可能與花生四烯酸代謝、VEGF 信號通路有關 PTGS2、ALOX5、PTGS1 靶點參與了花生四烯酸代謝途 徑，PTGS2、CASP9、NOS3、蛋白激酶（RAC?alpha serine／threonine?protein kinase，AKT1）參與了VEGF 信號通路。VEGF 通路下游絲裂原活化蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）通路是腎毒性的關鍵抑制通路［23］，且VEGF 信號通路與花生四烯酸代謝相關，PTGS2 是其共同作用靶點。也有研究發(fā)現(xiàn)，花生四烯酸可引起人腎小球足細胞凋亡［24］。PTGS2 是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關鍵酶，PTGS2 在腎損傷中高度表達。有研究發(fā)現(xiàn)，PTGS2 水平降低在多種藥物致大鼠腎損傷模型的保護中發(fā)揮作用［25?26］。還有研究發(fā)現(xiàn)，PTGS2 抑制劑對大鼠腎間質(zhì)纖維化有保護作用［27］。因此，九香蟲可能通過影響VEGF信號通路及花生四烯酸代謝調(diào)節(jié)PTGS2 表達發(fā)揮腎保護作用。

3.4 九香蟲腎保護可能與精氨酸代謝有關 本研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，brain，NOS1）、誘導型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，inducible，NOS2）及NOS3 靶點參與了精氨酸代謝通路，且NOS3 靶點在分子對接驗證中結合性較強。腎臟在精氨酸代謝中扮演重要角色，而一氧化氮合酶是一種同工酶，在腎單位中廣泛表達。精氨酸在人體內(nèi)通過鳥氨酸循環(huán)，參與尿素的形成［28］。有研究發(fā)現(xiàn)金匱腎氣丸及六味地黃丸可通過影響精氨酸代謝發(fā)揮腎保護作用［29］。也有研究發(fā)現(xiàn)，二惡烷腎毒性［30］、阿奇霉素腎毒性［31］、多囊腎病發(fā)生［32］、腎移植術后急性腎損傷也與精氨酸代謝途徑有關。因此，九香蟲可能通過影響精氨酸代謝調(diào)節(jié)尿素循環(huán)等發(fā)揮腎保護作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡構建及分子對接等一系列整合分析從系統(tǒng)層面揭示九香蟲腎保護“多成分、多靶點、多通路”的分子作用機制。發(fā)現(xiàn)阿斯吡嗪、亞麻酸、1，2?脫氫?N?乙?；喟桶芳癗OS3、ALOX5、HDAC4、RELA 等潛在治療成分與靶點，可能通過調(diào)節(jié)“腎素分泌”“腎素?血管緊張素系統(tǒng)”、花生四烯酸代謝、VEGF、精氨酸代謝等通路有關，為九香蟲腎保護作用機制研究及其資源進一步開發(fā)應用提供參考。