環(huán)狀RNA研究進(jìn)展

付海璐，遲鑫明，邵淑娟

(大連醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116000)

環(huán)狀RNA研究進(jìn)展

付海璐，遲鑫明，邵淑娟Δ

(大連醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116000)

環(huán)狀RNA是一類非編碼RNA，因其呈環(huán)狀而得名。它穩(wěn)定且廣泛地存在于生物界，是比線性的mRNA含量更豐富的轉(zhuǎn)錄本，能夠在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控多種生命活動(dòng)，與心血管系統(tǒng)疾病，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病及腫瘤等多種危害人類健康的疾病相關(guān)。本文總結(jié)了環(huán)狀RNA研究的前沿及經(jīng)典文獻(xiàn)，闡述了環(huán)狀RNA的產(chǎn)生，分類及分子生物學(xué)方面特征。

環(huán)狀RNA；非編碼RNA；分子生物學(xué)功能；腫瘤；神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變

隨著生物技術(shù)及計(jì)算機(jī)技術(shù)的逐步發(fā)展，生物體中越來(lái)越多的“暗物質(zhì)”一一被曝光。他們雖然不編碼蛋白質(zhì)，但是卻起著重要的調(diào)控作用，比如miRNA，lncRNA。近幾年，環(huán)狀RNA正逐漸進(jìn)入科研工作者的視野。環(huán)狀RNA(circular RNA)是一類雙鏈閉合RNA，無(wú)3’帽子結(jié)構(gòu)及5’poly A尾，長(zhǎng)度在幾百到幾千不等，不受RNA外切酶降解，穩(wěn)定且廣泛地存在于生物界，具有進(jìn)化保守性[1-4]。環(huán)狀RNA可以由外顯子、內(nèi)含子或二者反向剪接共同組成[1，5-6]，可存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、血清外泌體以及唾液當(dāng)中[7-9]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)并鑒定的環(huán)狀RNA大部分屬于非編碼RNA[10]，不編碼蛋白卻能調(diào)控基因的表達(dá)。環(huán)狀RNA的調(diào)控表達(dá)機(jī)制多種多樣，他們可以作為“miRNA海綿”，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[11]；與細(xì)胞核內(nèi)的snRNP或者RNA聚合酶Ⅱ相互作用調(diào)控轉(zhuǎn)錄[5-6]；或者與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)控經(jīng)典的RNA剪接[12]。已有研究表明環(huán)狀RNA與腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變有著密切關(guān)系[13-14]。

1 環(huán)狀 RNA的發(fā)現(xiàn)

1976年，Sanger研究團(tuán)隊(duì)提出，高等植物中的類病毒為一種單鏈環(huán)狀閉合的RNA病毒，并將這種RNA稱為環(huán)狀RNA(circular RNA)[15]。由此，環(huán)狀RNA的概念第一次被提出。早期，環(huán)狀RNA被視為錯(cuò)誤剪接產(chǎn)物[16-17]，或是逃脫內(nèi)含子套索脫枝的中介物[17-18]，只存在于病毒等病原體中[19]。因此，在接下來(lái)的四十多年中，環(huán)狀RNA的研究一直處于比較低迷的狀態(tài)。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的提高以及相應(yīng)序列匹配算法的改進(jìn)，研究人員得以對(duì)環(huán)狀RNA進(jìn)行更為深入、廣泛的研究。2012年，有研究表明，環(huán)狀RNA穩(wěn)定且廣泛地存在于包括人類在內(nèi)的真核生物界，且極有可能是主要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[1，3]。至此，環(huán)狀RNA的存在再次引起了研究者的廣泛重視。

2 環(huán)狀RNA的合成

目前比較公認(rèn)的環(huán)狀RNA合成機(jī)制主要有2種：① “直接反向剪接”，或稱為“內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化”[20-21]；②“套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化”，也被稱為“外顯子跳讀”[22-24]。多項(xiàng)研究表明，“直接反向剪接”是外顯子環(huán)狀RNA的主要產(chǎn)生方式。與經(jīng)典的線性RNA可變剪接不同，反向剪接(back splicing)的過(guò)程是由前體mRNA下游序列(3’端)反向地與其上游的RNA序列(5’端)相連形成環(huán)狀RNA[3，25-26]。盡管如此，反向剪接卻與經(jīng)典剪接共享剪接信號(hào)以及剪接體，并且與經(jīng)典的RNA剪接具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[12]。大部分環(huán)狀RNA產(chǎn)生在經(jīng)典的已注釋剪接位點(diǎn)[24，27]，但有研究證明次要剪接位點(diǎn)的未注釋外顯子區(qū)也可形成環(huán)狀RNA[28]。關(guān)于促進(jìn)RNA呈環(huán)的動(dòng)力目前尚未有定論，但研究發(fā)現(xiàn)以下幾點(diǎn)可能與反向剪接發(fā)生相關(guān)：①外顯子的長(zhǎng)度。外顯子序列越長(zhǎng)，呈環(huán)能力越強(qiáng)[1]；②反向剪接反轉(zhuǎn)起始部位富含ALU重復(fù)序列(是正常的5倍左右)[4]；③反向剪接位點(diǎn)兩側(cè)的內(nèi)含子較普通內(nèi)含子更長(zhǎng)，并且有促進(jìn)呈環(huán)的作用[2，12]。

3 環(huán)狀RNA的分類

根據(jù)組成不同，環(huán)狀RNA可分為外顯子環(huán)狀RNA，內(nèi)含子環(huán)狀RNA及內(nèi)含子外顯子共同組成的環(huán)狀RNA。目前，研究發(fā)現(xiàn)最多的是由外顯子組成的環(huán)狀RNA，這類環(huán)狀RNA的產(chǎn)生主要依賴于直接反向剪接機(jī)制，大多來(lái)源于編碼基因，但是絕大部分不能編碼蛋白[1，4，10]。在細(xì)胞內(nèi)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，含量也因細(xì)胞種類而異[2]，并且未表現(xiàn)出與線性mRNA含量的明顯相關(guān)性。直到2013年，研究發(fā)現(xiàn)完全由內(nèi)含子構(gòu)成的環(huán)狀RNA，并稱之為ci RNA(circular intronic RNAs)。它們的形成與RNA剪接過(guò)程中的套索結(jié)構(gòu)脫枝失敗相關(guān)，因此沒(méi)有環(huán)狀RNA經(jīng)典的3’-5’ 連接，取而代之的是套索結(jié)構(gòu)遺留的2’-5’連接。ciRNA的產(chǎn)生依賴于5’剪接區(qū)域7nt長(zhǎng)的富含GU的序列及靠近分枝點(diǎn)的11nt的富含C的序列。這類ci RNA存在于細(xì)胞核，少見miRNA結(jié)合位點(diǎn)，但是能夠結(jié)合到母基因上，調(diào)控親本基因的表達(dá)[5]。最近，中科大研究人員在人類細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了多種由外顯子和內(nèi)含子共同構(gòu)成的環(huán)狀RNA，并將這類環(huán)狀RNA命名為EIciRNA(Exon-intron circular RNAs)，這類環(huán)狀 RNA通過(guò)直接反向剪接產(chǎn)生，存在于細(xì)胞核中，與U1 snRNP相互作用并促進(jìn)親本基因的轉(zhuǎn)錄[6]。

4 環(huán)狀RNA的總體特征

4.1 極高的穩(wěn)定性 環(huán)狀RNA呈閉合環(huán)狀，缺少3’末端和5’poly A尾[29]，因此不易被RNA核酸外切酶R及脫枝酶降解，具有極高的穩(wěn)定性。一般來(lái)說(shuō)，外顯子環(huán)狀RNA在細(xì)胞或組織中非常穩(wěn)定，大多數(shù)半衰期在48h以上[4]，比線性mRNA 10h的半衰期[30]更為穩(wěn)定。這也可以解釋為什么環(huán)狀RNA要比線性mRNA的豐度更高。

4.2 種類繁多且數(shù)量龐大，分布廣泛 大量研究顯示，環(huán)狀RNA廣泛存在于生物界，從病毒、果蠅到包括人在內(nèi)的多種原核及真核生物體內(nèi)都有大量的環(huán)狀RNA存在，占母基因轉(zhuǎn)錄本的5%～10%，是比mRNA豐度更高的主要轉(zhuǎn)錄本[4，10，27，31-32]，有深度測(cè)序表明每8個(gè)基因中就有1個(gè)能夠產(chǎn)生具有達(dá)到檢測(cè)水平的環(huán)狀RNA，且環(huán)狀RNA的數(shù)目是線性mRNA的10倍以上[3，10，19，33-34]?？梢哉f(shuō)，環(huán)狀RNA在生物體內(nèi)無(wú)處不在，無(wú)論是細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、血清外泌體以及人類唾液中均發(fā)現(xiàn)了大量的環(huán)狀RNA[7-9]。

4.3 較強(qiáng)的進(jìn)化保守性 盡管數(shù)量龐大，大部分環(huán)狀RNA在進(jìn)化過(guò)程中仍具有很強(qiáng)的保守性，腦內(nèi)的一些環(huán)狀RNA在人類，小鼠甚至果蠅中都具有相似的序列[35]。這也意味著環(huán)狀RNA在一些基本的生命過(guò)程中具有非常重要的作用。但也有報(bào)道指出，由內(nèi)含子構(gòu)成的環(huán)狀RNA-ciRNA并未顯示出很強(qiáng)的序列保守性[5]。

4.4 表達(dá)的時(shí)間-空間特異性 多項(xiàng)研究已經(jīng)證明許多環(huán)狀RNA的表達(dá)不依賴于其親本基因的線性mRNA表達(dá)，而是隨著發(fā)育、衰老的進(jìn)行而發(fā)生變化，即所謂的時(shí)間特異性。并且，在不同的細(xì)胞、組織中，環(huán)狀RNA的種類和含量也不盡相同[28，35-36]。

5 環(huán)狀RNA的研究方法

對(duì)于環(huán)狀RNA的經(jīng)典研究策略主要是通過(guò)對(duì)去除核糖體RNA(rRNA)及線性RNA(linear RNA)的RNA樣本進(jìn)行測(cè)序并比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定反向剪接序列，并通過(guò)RNA酶R處理，發(fā)散式引物PCR(divergent primer PCR)，Northern blotting和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定環(huán)狀RNA的性質(zhì)。由于環(huán)狀RNA能夠被miRNA或ASO等技術(shù)降解，因此可以通過(guò)敲降或者高表達(dá)來(lái)研究環(huán)狀RNA的功能。

隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來(lái)，測(cè)序、芯片技術(shù)已被普遍應(yīng)用到環(huán)狀RNA的發(fā)現(xiàn)和分類研究中。2015年，北京大學(xué)的黃巖誼、湯富酬課題組開發(fā)出了一種polyA非依賴的單細(xì)胞通用RNA測(cè)序法(single-cell universal polyA-independent RNA sequencing，SUPeR-seq)，為研究環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能提供了更為有效的新途徑。該方法用具有錨序列的隨機(jī)引物，取代了傳統(tǒng)的oligodT引物，用于cDNA合成，具有極高的敏感性和精確性，可測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的polyA(+)RNA和polyA(-)RNA序列，并且基本不受基因組DNA及rRNA污染的影響。研究人員已利用該方法在HEK293細(xì)胞中以及小鼠著床前胚胎細(xì)胞中分別鑒定了141及2891個(gè)環(huán)狀RNA轉(zhuǎn)錄本[37]。另一方面，數(shù)據(jù)庫(kù)的建成也為環(huán)狀RNA的研究提供了極其便利的條件。第一個(gè)環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫(kù)CircNet database[38]已經(jīng)建成，可以查詢到環(huán)狀RNA的序列，基因組注釋，表達(dá)概況，以及mi RNA-環(huán)狀RNA互作網(wǎng)絡(luò)；另外一個(gè)環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫(kù)circ2Traits則提供了環(huán)狀RNA及其相關(guān)疾病的信息。

6 環(huán)狀 RNA的生物學(xué)功能

1993年，Cell雜志報(bào)道了第一個(gè)有功能的環(huán)狀RNA-circRNA Sry。circRNA Sry在成年小鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)，與小鼠的性成熟相關(guān)，當(dāng)時(shí)研究人員認(rèn)為circRNA Sry呈環(huán)形的原因與它在染色體上的位置及周圍的基因結(jié)構(gòu)相關(guān)[26]。盡管有研究表明環(huán)狀RNA在體外能夠編碼蛋白[39]，但目前發(fā)現(xiàn)的絕大部分環(huán)狀RNA不能在體內(nèi)編碼蛋白[10]。已發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA的作用主要是調(diào)節(jié)基因表達(dá)，具體機(jī)制主要包括以下3種。

6.1 miRNA分子海綿作用 一些環(huán)狀RNA上具有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，從而抑制其對(duì)相應(yīng)mRNA的降解作用，主要見于外顯子構(gòu)成的環(huán)狀RNA(例如CDR1as，circRNA-SRY以及circRNA-ZNF19等)[3，11-12]。ciRS-7是目前研究比較多的與腦發(fā)育相關(guān)的環(huán)狀RNA之一，它是小腦退行性變相關(guān)蛋白1(CDR1)編碼基因的反義鏈的一種轉(zhuǎn)錄本，因而又稱CDR1as。ciRS-7的表達(dá)具有明顯的組織特異性，在神經(jīng)組織中含量極高，而在其他組織中含量接近于零。ciRS-7具有超過(guò)70個(gè)miR-7結(jié)合位點(diǎn)，能夠在神經(jīng)組織中大量富集miR-7(其富集能力是其他轉(zhuǎn)錄本富集miR-7能力的十倍以上)，抑制miR-7的功能，從而調(diào)節(jié)下游如 α-synuclein，泛素蛋白連接酶A(UBE2A)等與帕金森病，AD等腦發(fā)育疾病相關(guān)的因子[40]。已有實(shí)驗(yàn)表明， CDR1as會(huì)損害斑馬魚的中腦功能，產(chǎn)生與miR-7敲降類似的效果[3，11]。

6.2 調(diào)控經(jīng)典的RNA剪接 circMbl是muscleblind基因的第2個(gè)外顯子形成的環(huán)狀RNA，muscleblind能夠編碼剪接因子MBL，與mRNA的穩(wěn)定性密切相關(guān)。circMbl的側(cè)翼內(nèi)含子上具有很多MBL蛋白結(jié)合位點(diǎn)，具有很強(qiáng)的特異性結(jié)合MBL蛋白的能力。2者的結(jié)合能夠促進(jìn)circMbl的產(chǎn)生，而相應(yīng)經(jīng)典的mRNA剪接就會(huì)被競(jìng)爭(zhēng)性的抑制[12]。

6.3 與轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件結(jié)合(RNA聚合酶Ⅱ，snRNP等)調(diào)控母基因的轉(zhuǎn)錄 見于一些ciRNA(如ci-ankrd52，ci-sirt7)和EliRNA(如circEIF3J or circPAIP2)。Ci-ankrd52是來(lái)源于ankrd52的ciRNA，它能夠特異性地結(jié)合參與其母基因ankrd52轉(zhuǎn)錄的RNA polⅡ，調(diào)節(jié)ankrd52的轉(zhuǎn)錄效率。當(dāng)ci-ankrd52被特異性敲除之后，ankrd52的轉(zhuǎn)錄效率明顯降低；但是ci-ankrd的高表達(dá)卻并沒(méi)有提高ankrd52的轉(zhuǎn)錄效率，研究人員推測(cè)，這可能是外源性ci-ankrd52的定位異常所引起的[5]。

7 環(huán)狀RNA與疾病

已有研究證明環(huán)狀RNA與腫瘤、阿爾茲海默癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥大所引起的心力衰竭、肺纖維化等疾病密切相關(guān)[40-42]。目前，研究成果主要集中在環(huán)狀RNA與神經(jīng)發(fā)育和腫瘤2個(gè)方向。

7.1 環(huán)狀RNA與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育 已經(jīng)先后有研究表明哺乳動(dòng)物的腦富含環(huán)狀RNA，尤其以神經(jīng)突觸部位含量最高[3，12，43-44]，中腦，大腦的新皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)、胚胎的新皮質(zhì)區(qū)都存在不同種類的環(huán)狀RNA，一般來(lái)說(shuō)，神經(jīng)元越多的部位，環(huán)狀RNA的含量也越多[3，35]。且這些環(huán)狀RNA及其兩側(cè)內(nèi)含子的序列都比較保守，其表達(dá)豐度也會(huì)隨神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和分化而變化，但是這種變化并未表現(xiàn)出與其對(duì)應(yīng)的線性mRNA的相關(guān)性[28，35，43]。環(huán)狀RNA表達(dá)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程的這種緊密聯(lián)系，使得它很有可能對(duì)一些神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育疾病的診斷和治療帶來(lái)新的幫助[40]。

7.2 環(huán)狀RNA與腫瘤 有研究證明環(huán)狀RNA與結(jié)腸癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、肝細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤等腫瘤具有密切的聯(lián)系[13-14，42，45-48]。環(huán)狀RNA所表現(xiàn)出的廣泛存在性，高度穩(wěn)定性，多種多樣的調(diào)控功能，無(wú)疑為腫瘤的早期診斷和治療帶來(lái)了新的曙光。

有臨床研究表明，一些環(huán)狀RNA在腫瘤組織中的含量低于正常組織，并且與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分期、發(fā)病年齡、性別等臨床特征具有顯著相關(guān)性[13-14，42]。并且已經(jīng)有研究人員在人的唾液和血清外泌體中發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA的存在，且其中一些環(huán)狀 RNA在腫瘤患者與正?；颊叩难逋饷隗w中的含量呈顯著差異[7]。綜上，未來(lái)環(huán)狀RNA有望成為腫瘤診斷和分期的新型分子標(biāo)記物。

另外，已經(jīng)有許多研究表明，環(huán)狀RNA與腫瘤的分子生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)，能夠直接或間接調(diào)節(jié)許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展。第一，抑制wnt通路。2015年研究人員發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA cir-ITCH在人類食管癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示，cir-ITCH能夠抑制食管癌細(xì)胞系Eca-109 和 TE-1中Wnt通路活性，進(jìn)而抑制腫瘤的增殖能力、細(xì)胞周期進(jìn)程以及裸鼠成瘤能力[13]。第二，環(huán)狀RNA也與上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程密切相關(guān)。EMT是腫瘤發(fā)生及侵襲遷移能力增加過(guò)程中的重要事件，2015年有報(bào)道顯示，在EMT的過(guò)程中， QUAKING蛋白能夠結(jié)合到特定的環(huán)狀RNA側(cè)翼序列，從而調(diào)控這些環(huán)狀RNA的產(chǎn)生，而這類環(huán)狀RNA的數(shù)目達(dá)到了上千種，這也暗示著環(huán)狀RNA與腫瘤發(fā)生極有可能有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系[49]。

8 結(jié)語(yǔ)

環(huán)狀RNA在復(fù)雜的生命過(guò)程中扮演著重要的調(diào)控角色，是許多疾病的潛在診斷和治療靶點(diǎn)。目前對(duì)于環(huán)狀RNA的研究成果僅僅是冰山一角，要揭開環(huán)狀RNA神秘的面紗，還有漫長(zhǎng)的研究道路要走，有理由相信，未來(lái)環(huán)狀RNA在疾病診斷、治療以及藥物研發(fā)工作中會(huì)有更多用途。

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(編校：譚玲)

Reseach progress of circular RNAs

FU Hai-lu, CHI Xin-ming, SHAO Shu-juanΔ

(College of Basic Medical Sciences, Dalian Medical University, Dalian 116000，China)

Circular RNAs, which belong to non-coding RNAs, are so named for their circular shape. They stably exist in almost all kingdoms of life, accuring to be the most predominant transcripts instead of linear mRNAs. They act as regulators in transcription or posttranscription, playing important roles in tumors, cadiovascular diseases, neurodegenerative diseases and so on. In this paper, we collect information of the most authoritative articles, and elaborate the production, classification and molecular biologic characteristics of circular RNAs.

circular RNA; non-coding RNA; molecular biologic function；tumor； neurodegenerative disease

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81272225)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81470367)

付海璐，女，博士在讀，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)，E-mail：shandianlulu0416@163.com；邵淑娟，通信作者，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤靶向治療，腫瘤分子生物學(xué)，E-mail：shaoshujuan2006@126.com。

Q71

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.03