熱回流技術提取長裙竹蓀多糖的工藝研究

劉曉英　劉光榮

本研究為了優(yōu)化熱回流法提取竹筍多糖的提取工藝，以多糖提取率為指標，通過單因素及正交實驗對提取工藝進行優(yōu)化，主要考察了提取料液比、時間、提取pH等因素。研究結果顯示熱回流法提取長裙竹蓀多糖的最優(yōu)工藝為料液比（110：1）、時間（2小時）、提取pH（5.0），采用此條件下提取長裙竹蓀多糖提取率為（18.65±0.259）%，同時該工藝具有良好精密度與重復性，適用于長裙竹蓀多糖的提取。

多糖為生命代謝活動中不可或缺的重要部分，是幾個或多個單糖之問通過糖苷鍵連接形成的高分子化合物，可廣泛地參與人體的各項活動，如抗衰、增強免疫力、皮膚保濕、抗腫瘤、抗病毒等。目前化妝品中皮膚保濕劑主要包括化學保濕劑（如甘油、丙二醇）和多糖保濕劑（如透明質(zhì)酸、植物多糖）。由于從動植物中提取的多糖類物質(zhì)具有天然、安全無刺激、與皮膚親和力較高等優(yōu)勢，因此多糖類物質(zhì)在化妝品中的應用受到了人們的廣泛關注，可滿足人們對高品質(zhì)化妝品的需要。目前已知的多糖研究主要有植物多糖、動物多糖、真菌多糖、細菌多糖、藻類多糖等，其中真菌多糖的研究是目前的一個熱點。

竹蓀為高蛋白、多氨基酸、多維生素、低脂肪、營養(yǎng)豐富的食藥兼用的高等真菌竹蓀菌蓋，多糖主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其中，葡萄糖含量最高，其次是半乳糖和甘露糖。竹蓀菌蓋多糖具有較好的還原能力和抑制羥基自由基能力。隨著菌蓋多糖質(zhì)量分數(shù)的增加，其還原能力和抑制羥基自由基能力有定程度提高，其中菌蓋多糖的還原能力與質(zhì)量分數(shù)具有一定的線性相關性。據(jù)文獻報道，竹蓀提取液在化妝品中的應用很少，并且對其作用機理尚未研究；其研究主要是在醫(yī)藥（抗癌、抗菌、降血脂）與食品方面（防腐）等方面的報道。竹蓀提取液應用到化妝品中，具有潛在的美白、抗衰老、防曬及抗痤瘡等方面的功效。竹蓀提取液與其他美白劑抗衰劑相比，在起到美白、抗衰作用的同時，還具有多糖固有的保濕作用。若能利用竹蓀菌托、菌蓋來深入研究多糖在食品天然防腐劑、保健品、化妝品中的應用，對我們的生活會影響深遠。

長裙竹蓀（Dictyophora indusiata）是一類大型真菌，又稱竹菌、竹參，從分類學上隸屬于擔子菌亞門、腹菌綱、鬼筆目、鬼筆科、竹蓀屬。長裙竹蓀味道鮮美、營養(yǎng)豐富，既是馳名的名貴藥材又是宴席上的名貴山珍，因此素有“菌中皇后”“山中之王”美稱。對于真菌多糖的提取主要有熱水浸提法、酸堿浸提法、超聲波法、微波法、酶法、超聲酶法等，但目前對于長裙竹蓀多糖的提取報道不是很多，主要有熱水提取法及復合酶法等。作為種名貴的食用菌，隨著人們對長裙竹蓀需求量的增大，對長裙竹蓀多糖的研究也逐漸深入，如何在現(xiàn)有提取方法基礎之上加以完善優(yōu)化以獲得更大提取率的長裙竹蓀多糖非常有研究意義。本研究以長裙竹蓀為研究對象，采取常規(guī)的熱回流技術對料液比、提取時問、不同pH等進行了單因素分析及正交試驗，研究了長裙竹蓀多糖的提取工藝，并通過對提取條件的優(yōu)化篩選了最佳工藝，為進步開發(fā)長裙竹蓀的價值提供了依據(jù)，希望為竹蓀活性成分在化妝品領域的應用提供科學依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料與儀器

長裙竹蓀（購自福建寧德）；苯酚、葡萄糖、硫酸等均為分析純（購自北京化工廠）。

Tecan Genios，型號M200酶標儀（瑞士Tecan公司），移液槍（大龍），天秤（賽多利斯），電子調(diào)溫電熱套（江蘇金壇），電子恒溫水浴鍋（江蘇太倉），酸度計（梅特勒托利多）。

1.2實驗方法

1.2.1標準曲線繪制

精密稱取烘干至恒重的葡萄糖0.1g，置于燒杯中加水溶解定容至100ml，吸取1ml再定容至5ml，得0.2mg/ml標準葡萄糖溶液。準確分別吸取0.2mg/ml標準葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml分別置于試管中，各加入蒸餾水使總體積為2.0ml，再分別加5%苯酚試液1.0ml并搖勻，迅速加入濃硫酸5.0ml，搖勻后放置10min，置于沸水浴中加熱10min，取出流水冷卻至室溫，另以蒸餾水2.0ml加5%苯酚和硫酸作空白對照，于490nm波長處測吸光度。結果得到回歸方程Y=0.0686X-0.0003，r=0.999（Y為葡萄糖濃度，mg/ml；x為吸光度值）。多糖提取率按如下公式計算：

1.2.2長裙竹蓀多糖提取的工藝流程

1.2.2 1樣品處理

使用小剪刀將長裙竹蓀剪成0.5cm長短的小塊在65℃下烘干至恒重，密封備用。

1 2.2.2單因素實驗

分別針對料液比、提取時間、不同pH等因素對長裙竹蓀進行提取。其中料液比對長裙竹蓀多糖提取的影響分別考察（50：1）、（70：1）、（90：1）、（100：1）、（120：1）等5個水平；提取時間對長裙竹蓀多糖提取的影響分別考察0.5、1.0.1.5、2.0、2.5等5個水平；不同pH對長裙竹蓀多糖提取的影響分別考察pH=6、7、8、9、10等5個水平。

1）料液比

精密稱取5份1.0g處理后的長裙竹蓀，分別加入蒸餾水50ml（50：1）、70ml（70：1）、90（90：1）、100ml（100：1）、120ml（120：1），在85℃下熱回流提取1h，過濾得到5份溶液并定容至250ml。取樣品溶液0.2ml，加蒸餾水定容至2ml，加入苯酚溶液1ml，加入濃硫酸5ml，在80℃水浴中加熱10min，取出后置于冷水中冷卻，在波長490nm測定吸光度，計算含量（mg/g）。

2）不同提取時間

精密稱取5份1.0g處理后的長裙竹蓀，分別加入100ml蒸餾水，在85℃水浴下，分別熱回流提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，過濾得到的樣品溶液，取樣品溶液0.2ml加蒸餾水定容至2ml，加入苯酚溶液1ml，加入濃硫酸5ml，在80℃水浴中加熱10min，取出后置于冷水中冷卻，在波長490nm測定吸光度，計算含量（mg/g）。

3）不同pH值

精密稱取5份1.0g處理后的長裙竹蓀，精密稱取5份長裙竹蓀1.0g，剪碎，在85℃下，分別加入100ml，pH值為6、7、8、9、10的蒸餾水，提取2h后過濾，得到樣品溶液，取樣品溶液0.2ml，加蒸餾水定容至2ml，加入苯酚溶液1.ml，加入濃硫酸5ml，在80℃水浴中加熱10min，取出后置于冷水中冷卻，在波長490nm測定吸光度。測定吸光度，計算含量（mg/g）。

1.2.2.3提取工藝正交設計

在單因素實驗基礎之上對提取料液比，提取時間、提取pH進行L9（34）正交試驗，篩選最優(yōu)提取工藝。同時對篩選出來的最有提取工藝進行精密度、重復性、穩(wěn)定性等方法學進行考察。

2.結果

2.1提取料液比對長裙竹蓀多糖的影響

以不同料液比提取1次，考察其對提取率的影響，結果見圖1。隨著料液比升高，竹筍多糖提取率逐漸增大，料液比達到100：1時提取率最高，之后開始下降。由此選擇料液比100：1作為最佳料液比進一步篩選其他因素。

2.2提取時間對長裙竹蓀多糖的影響

以不同時間提取1次，考察其對提取率的影響，結果見圖2。隨著時問加長，竹筍多糖提取率逐漸增大，提取時間達到2h提取率最高，之后開始下降。由此選擇提取時間2h作為最佳提取時間進一步篩選其他因素。

2.3提取pH對長裙竹蓀多糖的影響

以不同pH提取1次，考察其對提取率的影響，結果見圖3。隨著pH升高，竹筍多糖提取率逐漸降低，提取pH為6.0時提取率最高。由此選擇提取pH=6.0作為最佳提取pH。

2.4正交試驗

根據(jù)正交試驗結果，從表2可知極差值中Rc最大為17.15，說明相比較而言pH對長裙竹蓀多糖提取率影響最大，其次是提取時間與料液比。最佳提取條件為：料液比（110：1）；提取液的PH值（5.0）；提取時間（2小時），采用此條件下提取，長裙竹蓀多糖提取率為（18.65±0.259）%。

2.5重復性與精密度實驗

按照篩選出的最優(yōu)提取工藝分別提取5分樣品長裙竹蓀多糖液，測定器吸光值。5份樣品的吸光度值無顯著性差異，RSD為1.512%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。按照篩選出的最優(yōu)工藝制備長裙竹蓀多糖樣品液1份，同時取樣5次，紫外分光光度計490nm處測定其吸光度檢測精密度，結果表明5個多糖樣品液吸光度RSD為1.405%，表明本方法精密度良好。

3.討論

本實驗利用熱回流技術探索了提取長裙竹蓀多糖的方法。通過正交設計對提取料液比、時間、pH等進行了優(yōu)化。結果表明pH對長裙竹蓀多糖提取具有顯著影響，最優(yōu)提取工藝為：料液比110.1、時間2小時.pH5.0。同時經(jīng)方法學考察本法有著良好精密度與穩(wěn)定性。為長裙竹蓀多糖在化妝品中的應用提供參考。