豬場(chǎng)及周邊環(huán)境中大腸埃希菌對(duì)幾種消毒劑及抗菌藥的耐藥性調(diào)查

楊秋娥，李　亮，廖曉萍，李幸萍，王明汝，方　茜，劉雅紅，孫　堅(jiān)(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642)

豬場(chǎng)及周邊環(huán)境中大腸埃希菌對(duì)幾種消毒劑及抗菌藥的耐藥性調(diào)查

楊秋娥，李亮，廖曉萍，李幸萍，王明汝，方茜，劉雅紅，孫堅(jiān)
(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642)

摘要:【目的】調(diào)查豬場(chǎng)及周邊環(huán)境中大腸埃希菌Escherichia coli對(duì)消毒劑和抗生素耐藥情況，分析消毒劑抗性與抗菌藥耐藥之間的關(guān)系.【方法】從廣東省某豬場(chǎng)采集130份樣品，包括養(yǎng)殖場(chǎng)各階段豬的糞便、豬場(chǎng)周邊環(huán)境(豬舍空氣、池塘水、周邊土壤樣品)以及豬場(chǎng)人員的糞便樣品.采用選擇性培養(yǎng)基分離鑒定大腸埃希菌，瓊脂稀釋法測(cè)定大腸埃希菌對(duì)4種消毒劑和10種抗菌藥的MIC值，PCR法檢測(cè)qacE、qacE△1、qacF、qacG、emrE、sugE(c)、sugE (p)、mdfA和ydgE/ydgF消毒劑抗性基因.【結(jié)果和結(jié)論】130份樣品中共分離到97株大腸埃希菌，分離率達(dá)74. 6%.受試菌株對(duì)4種消毒劑表現(xiàn)出不同程度的抗性，不同來源的菌株對(duì)季銨鹽類消毒劑苯扎氯銨和十六烷基三甲基溴化銨都表現(xiàn)出較高的抗性水平，而對(duì)雙胍類消毒劑三氯生和氯己定則較為敏感.87. 6% (85/97)的大腸埃希菌菌株表現(xiàn)為多重耐藥，68%～88%的菌株對(duì)磺胺甲惡唑/甲氧芐啶、多西環(huán)素、萘啶酸、頭孢噻肟和氟苯尼考等抗菌藥表現(xiàn)出耐藥.消毒劑抗性基因的檢出率不高(2. 1%～20. 6%)，其中檢出率最高的為qacE△1.大腸埃希菌對(duì)季銨鹽類消毒劑的抗藥性與抗菌藥耐藥性呈正相關(guān)，消毒劑抗性基因與一些特定的抗生素耐藥表型也存在一定關(guān)聯(lián).在磺胺甲惡唑/甲氧芐啶、萘啶酸、環(huán)丙沙星、頭孢西丁、阿米卡星和黏菌素耐藥菌株中，消毒劑抗性基因檢出率分別高于其敏感菌株的檢測(cè)率.抗生素－消毒劑聯(lián)合耐藥給周邊環(huán)境帶來了風(fēng)險(xiǎn)，因此養(yǎng)殖場(chǎng)消毒劑和抗生素應(yīng)規(guī)范使用，以減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生.

關(guān)鍵詞:大腸埃希菌;消毒劑耐藥;耐藥率;抗生素

楊秋娥，李亮，廖曉萍，等.豬場(chǎng)及周邊環(huán)境中大腸埃希菌對(duì)幾種消毒劑及抗菌藥的耐藥性調(diào)查［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36(6):15-22.

優(yōu)先出版時(shí)間:2015-10-19

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由于抗生素長期不合理的使用，導(dǎo)致養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境中耐藥菌株不斷出現(xiàn).耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生嚴(yán)重影響了感染性疾病的治療效果，增加了養(yǎng)殖場(chǎng)細(xì)菌感染發(fā)生率以及治療成本［1-2］.消毒劑的用途與抗生素不同，例如臨床上常用的苯扎溴銨、氯己定等季銨鹽類陽離子表面活性劑和雙胍類化合物等消毒劑，多用于皮膚黏膜的防腐和表面消毒，在預(yù)防和控制致病菌傳播或感染等方面起到關(guān)鍵作用.此外，消毒劑對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制與抗生素也不同，消毒劑可同時(shí)作用于細(xì)菌多個(gè)靶位點(diǎn)，如細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使?jié)B透性增加，內(nèi)容物漏出，干擾氧化磷酸化過程，抑制膜酶活性等.同時(shí)，它還可以作用于細(xì)胞內(nèi)成分，與生物大分子(蛋白質(zhì)、DNA、RNA)發(fā)生交聯(lián)、與巰基交互作用以及烷基化作用等，使蛋白質(zhì)變性、抑制酶的活性、破壞DNA等，因此消毒劑可表現(xiàn)出更寬的抗菌活性［3］.近年來，消毒劑在我國家畜、家禽、水產(chǎn)和食用真菌的養(yǎng)殖業(yè)中的使用越來越多，常用的消毒劑包括季胺鹽類化合物、酚類化合物、雙胍類、碘及其復(fù)合物、醛類、過氧化物和銀化合物.然而，越來越多的研究結(jié)果表明，同濫用抗生素的后果一樣，消毒劑使用的增加同樣也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥［4-5］.細(xì)菌對(duì)消毒劑耐藥是指對(duì)常用濃度消毒劑不再敏感的菌株出現(xiàn)，一般認(rèn)為，當(dāng)消毒劑對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)超過一定值，就認(rèn)為產(chǎn)生了耐藥［3］.

目前，7種質(zhì)粒介導(dǎo)的季銨鹽類消毒劑(Quaternary ammonium compounds，QACs)特異抗性基因在大腸埃希菌Escherichia coli中被發(fā)現(xiàn)，包括qacE、qacEΔ1、qacF、qacG、qacH、qacI和sugE(p) (質(zhì)粒型sugE).這些基因編碼小蛋白家族多藥外排泵(Small multiple resistance，SMR)，賦予細(xì)菌對(duì)QACs的抗藥性［5］，SMR家族基因可由質(zhì)?；蛘献咏閷?dǎo)傳播，對(duì)QACs的MIC較高的菌株通常是由于其獲得了攜帶這些消毒劑抗性基因的可移動(dòng)元件，如質(zhì)粒、I型整合子等［6］.研究表明，qacI、sugE(p)基因可共存于多重耐藥(Multidrug resistance，MDR)質(zhì)粒，如IncA/C 和IncHI2型質(zhì)粒中［7-8］，其可介導(dǎo)對(duì)消毒劑高水平耐藥，并在大腸埃希菌中廣泛傳播.另有5種染色體編碼基因sugE(c) (染色體型sugE)、emrE、ydgE/ydgF 和mdfA等也特異地介導(dǎo)對(duì)QACs的抗藥性，并可在大腸埃希菌中垂直傳播［9］.相對(duì)革蘭陽性細(xì)菌，革蘭陰性細(xì)菌對(duì)消毒劑表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗藥性［10］，如大腸埃希菌對(duì)苯扎氯銨(Benzalkonium chloride，BC)的MIC為50 mg·L－1，而葡萄球菌對(duì)BC的MIC只有0. 5 mg·L－1［11］;假單胞菌Pseudomonas sp.對(duì)BC的MIC達(dá)到了200 mg·L－1，而葡萄球菌對(duì)BC的MIC只有4～11 mg·L－1［12］.盡管國內(nèi)已經(jīng)開展了一些對(duì)動(dòng)物源大腸埃希菌中消毒劑抗藥性的調(diào)查［10，13］，但是極少針對(duì)整個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)生態(tài)環(huán)境，包括動(dòng)物－環(huán)境－人源大腸埃希菌中消毒劑抗藥性的研究，而且消毒劑的抗藥性是否與抗菌藥的耐藥性相關(guān)還不得而知.本研究通過分離不同階段的豬糞便、豬場(chǎng)周邊環(huán)境樣品和豬場(chǎng)工作人員糞便中大腸埃希菌，研究大腸埃希菌對(duì)常用消毒劑和抗菌藥耐藥情況，同時(shí)檢測(cè)消毒劑抗性基因，分析其與抗菌藥耐藥表型相關(guān)性，為消毒劑的規(guī)范合理使用提供科學(xué)依據(jù).

1　材料與方法

1.1培養(yǎng)基及試劑

TSA培養(yǎng)基，麥康凱培養(yǎng)基，伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基(EMB)，MH培養(yǎng)基和MHA培養(yǎng)基，均為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品.

DNA Marker DL500、dNTP和rTaqDNA聚合酶等為TaKaRa有限公司產(chǎn)品.消毒劑苯扎氯銨、十六烷基三甲基溴化銨(Cetyltrimethy ammonium bromide，CTAB)，三氯生(Triclosan，TCS)和氯己定(Chlorhexidine，CL)等均為普博欣試劑有限公司產(chǎn)品.

1.2引物的合成

消毒劑抗藥性基因的10對(duì)引物是依據(jù)GenBank公布的相關(guān)序列設(shè)計(jì)，由華大基因有限公司合成，如表1所示.

表1　PCR引物序列及條件Tab.1 Primers and PCR conditions used

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1樣品采集從廣東省某豬場(chǎng)采集了130份樣品，94份來自不同養(yǎng)殖階段豬的糞便，其中包括哺乳仔豬20份，保育豬20份，育肥豬20份，后備母豬14份，懷孕母豬20份; 14份空氣樣品; 8份豬場(chǎng)周邊的水樣品; 7份豬場(chǎng)周邊土壤樣品; 7份豬場(chǎng)人員糞便樣品.各類樣品采集方法如下:用無菌袋采集豬和豬場(chǎng)人員糞便;在豬場(chǎng)的生產(chǎn)區(qū)，包括哺乳仔豬區(qū)、保育區(qū)、育肥區(qū)和備懷母豬區(qū)等的通風(fēng)口放置TSA培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)24 h后取回作為空氣樣品;結(jié)合豬場(chǎng)糞便收集、排放路線采集土壤和水樣品(沖欄水收集于化糞池，化糞池水通過溝渠排入魚塘，魚塘水連接到周圍的河道，同時(shí)河道里的水被用來澆灌周圍蔬菜)，即水樣從沖欄水、化糞池水、溝渠水、魚塘水和河道水處收集，每處各取1 L;土壤樣本收集每個(gè)魚塘、河道的地泥或蔬菜地土壤，每個(gè)采樣點(diǎn)收集不同方位3份樣品混合，每個(gè)采樣點(diǎn)各取200 g.所有樣品用無菌袋封好后放置于帶冰袋的有蓋的泡沫箱中，密封好泡沫箱后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，－20℃條件保存，96 h內(nèi)處理.

1.3.2樣品處理和菌株的分離鑒定對(duì)于水樣品，在無菌條件下取20 μL接種于LB肉湯培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng);對(duì)于土壤和糞便樣品，先用無菌生理鹽水洗滌稀釋后，取20 μL接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng);空氣中的TSA培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱，37℃過夜培養(yǎng).每份樣品挑取1個(gè)具有大腸埃希菌典型形態(tài)的單菌落，接種劃線到EMB瓊脂平板上37℃培養(yǎng)16～24 h;選擇生長良好的紫黑色有金屬光澤的菌落通過生化鑒定，純化后保存于含有體積分?jǐn)?shù)為60%甘油的LB肉湯中，于－80℃條件保存?zhèn)溆?

1.3.3藥敏試驗(yàn)參照CLSI(2013版)指導(dǎo)原則和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)［14］，采用瓊脂二倍稀釋法，測(cè)定97株大腸埃希菌對(duì)4種消毒劑和10種常用抗菌藥物的敏感性.測(cè)定的消毒劑包括BC、CTAB、TCS和CL，測(cè)定的抗生素包括磺胺甲惡唑/甲氧芐啶(SXT)、萘啶酸(NAL)、環(huán)丙沙星(CIP)、喹乙醇(OLA)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢西丁(FOX)、阿米卡星(AMK)、多西環(huán)素(DOX)、氟苯尼考以及黏菌素(CS)，均購自中國藥品生物制品檢定所.用二倍稀釋法把各種藥物稀釋到所需濃度梯度，分別定量加入高壓滅菌過的MH瓊脂在平皿中混合均勻，冷卻凝固，制成含所需藥物濃度的瓊脂平板，把稀釋至含菌量約為1. 0×106CFU·mL－1的菌液用微量多點(diǎn)接種儀接種到MH瓊脂平板上，37℃倒置培養(yǎng)16～18 h后觀察結(jié)果，以完全不見細(xì)菌生長的最低藥物濃度為該藥物對(duì)細(xì)菌的MIC.10種抗生素MIC試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)則是根據(jù)CLSI規(guī)定折點(diǎn)值范圍判定結(jié)果［14］.

1.3.4消毒劑抗性基因檢測(cè)煮沸法制備模板，無菌接種環(huán)刮取大腸埃希菌菌落，置于1. 5 mL Eppendorf離心管里，加無菌水200 μL，吹打混勻，沸水煮10 min后，迅速冰浴2～3 min，10 000 r·min－1離心2 min，將上清液置于－20℃條件下儲(chǔ)存.PCR擴(kuò)增體系: rTap酶0. 125 μL，dNTP 2. 0 μL，10×buffer 2. 5 μL，上、下游引物各0. 5 μL，模板2. 0 μL，無菌去離子水17. 5 μL，總體積25. 125 μL.擴(kuò)增循環(huán)條件: 94℃預(yù)變性5 min; 95℃變性45 s，退火(退火溫度如表1所示) 30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15 mg·mL－1瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并保存.

1.4統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS19. 0軟件t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析.

2　結(jié)果與分析

2.1大腸埃希菌分離情況

130份樣品中共分離鑒定97株大腸埃希菌，分離率達(dá)74. 6%，詳見表2.不同來源的大腸埃希菌的分離率在60. 0%～92. 9%范圍，可見該豬場(chǎng)及豬場(chǎng)周邊環(huán)境中大腸埃希菌污染較為嚴(yán)重.

表2　大腸埃希菌分離情況Tab.2 Isolation of Escherichia coli

2.2大腸埃希菌對(duì)消毒劑和抗生素的耐藥情況

由表3可看出，不同來源大腸埃希菌對(duì)CTAB的MIC50和MIC90均達(dá)到128 mg·L－1以上;對(duì)BC的MIC50和MIC90分別為32和64 mg·L－1以上;大腸埃希菌對(duì)CL和TCS較敏感，MIC50和MIC90分別在0.25～4.00和0. 25～32. 00 mg·L－1之間，環(huán)境源大腸埃希菌對(duì)CL和TCS的MIC90分別達(dá)到16和32 mg·L－1，高于人源大腸埃希菌對(duì)應(yīng)的MIC90.

表3　不同來源大腸埃希菌對(duì)4種消毒劑的MIC50和MIC90Tab.3 MIC50and MIC90of four disinfectants against Escherichia coli isolated from different sources

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，97株大腸埃希菌對(duì)S/T的耐藥性最為嚴(yán)重，耐藥率達(dá)88%;其次是DOX和CTX，耐藥率分別為78%和72%;對(duì)其他抗生素如NAL、FFC、FOX、CIP和OLA，也有不同程度的耐藥.然而，大部分菌株對(duì)AMK和CS比較敏感，其耐藥率分別為11%和23% (圖1).另外，97株大腸埃希菌對(duì)消毒劑CTAB呈現(xiàn)較高的耐藥率，為76%，而對(duì)另外3種消毒劑BEB，CL和TCS的耐藥率相對(duì)較低(圖1).97株大腸埃希菌中絕大多數(shù)表現(xiàn)為多重耐藥(即對(duì)3類及3類以上藥物耐藥)，多重耐藥率達(dá)87. 6%.對(duì)10種抗菌藥物產(chǎn)生了63種耐藥譜，其中僅有6株耐1類抗生素，6株耐2類抗生素，85株耐3類及3類以上抗生素(表4).

圖1　97株大腸埃希菌對(duì)10種抗生素和4種消毒劑的耐藥率Fig.1　 Resistance rates to 10 antibiotics and 4 disinfectants in 97 Escherichia coli isolates

2.3消毒劑抗性基因的檢測(cè)結(jié)果

97株大腸埃希菌中，共檢出32株大腸埃希菌攜帶消毒劑抗性基因，檢出率為33. 0%，其中qacE△1 (n =20，20. 6%)和emrE(n = 17，17. 5%)基因檢出率最高，其次是ydgF(n =10，10. 3%)和qacF(n =5，5. 2%)基因; ydgE(n = 4，4. 1%)、sugE(p) (n = 2，2. 1%)和mdfA(n =1，1.0%)等基因檢測(cè)率最低; qacE 和qacG基因沒有檢測(cè)出.根據(jù)攜帶消毒劑抗性基因的個(gè)數(shù)不同，可將32株攜帶消毒劑抗性基因大腸埃希菌分為15種不同組合(表5).

表4　大腸埃希菌對(duì)抗生素耐藥譜Tab.4 Drug resistance profiles of Escherichia coli isolates

表4　大腸埃希菌對(duì)抗生素耐藥譜Tab.4 Drug resistance profiles of Escherichia coli isolates

1) SXT:磺胺甲惡唑/甲氧芐啶; NAL:萘啶酸; CIP:環(huán)丙沙星; OLA:喹乙醇; CTX:頭孢噻肟; FOX:頭孢西丁; AMK:阿米卡星; DOX:多西環(huán)素; FFC:氟苯尼考; CS:黏菌素.

耐藥譜1)菌株數(shù)　耐藥譜1)菌株數(shù)S/T　4　NAL-CIP-DOX-FOX-S/T　1 NAL　1　NAL-CIP-DOX-OLA-FFC　1 NAL-CIP　1　NAL-CS-DOX-S/T-FFC　1 NAL-FFC　1　NAL-CIP-DOX-S/T-OLA　4 S/T-FFC　1　NAL-CIP-S/T-OLA-FFC　2 FOX-OLA　1　NAL-CS-DOX-FOX-S/T　1 DOX-S/T　2　NAL-CTX-DOX-FOX-AMK　1 NAL-CIP-S/T　1　NAL-DOX-FOX-S/T-FFC　1 DOX-S/T-OLA　2　NAL-CIP-DOX-S/T-FFC　2 FOX-S/T-FFC　1　NAL-DOX-FOX-S/T-OLA　3 FOX-S/T-OLA　1　NAL-DOX-S/T-OLA-FFC　1 NAL-DOX-S/T　1　NAL-CIP-DOX-FOX-S/T-AMK　1 NAL-FOX-S/T　1　NAL-CIP-CS-FOX-S/T-FFC　1 CTX-DOX-FOX-SXT　1　NAL-CIP-CS-DOX-S/T-FFC　1 NAL-DOX-S/T-OLA　3　NAL-CIP-FOX-S/T-AMK-OLA　1 NAL-DOX-FOX-S/T　2　NAL-CIP-DOX-FOX-S/T-OLA　1 NAL-CS-DOX-S/T　1　NAL-DOX-FOX-S/T-OLA-FFC　3 DOX-S/T-OLA-FFC　3　NAL-CS-DOX-S/T-OLA-FFC　1 DOX-FOX-S/T-OLA　2　NAL-CIP-FOX-S/T-OLA-FFC　3 DOX-FOX-S/T-FFC　2　NAL-CIP-DOX-S/T-OLA-FFC　5 CS-FOX-OLA-FFC　1　NAL-CIP-CS-DOX-S/T-OLA-FFC　1 CS-DOX-S/T-OLA　1　NAL-CIP-CS-DOX-FOX-S/T-OLA　1 CS-DOX-OLA-FFC　1　NAL-CIP-FOX-AMK-OLA-FFC　1 CS-DOX-FOX-OLA　1　NAL-CIP-DOX-FOX-S/T-OLA-FFC　5 CIP-S/T-OLA-FFC　1　NAL-CIP-CS-DOX-FOX-S/T-AMK　1 CIP-DOX-FOX-S/T　3　NAL-CIP-CS-DOX-S/T-OLA-FFC　1 CTX-DOX-S/T-OLA-FFC　1　NAL-CIP-DOX-FOX-S/T-AMK-FFC　1 CIP-DOX-FOX-S/T-AMK　1　NAL-CTX-CIP-DOX-S/T-AMK-FFC　1 CS-DOX-FOX-S/T-OLA　1　NAL-CIP-CS-DOX-FOX-S/T-OLA-FFC　1 DOX-FOX-S/T-AMK-FFC　1　NAL-CTX-CIP-DOX-FOX-S/T-OLA-FFC　1 DOX-FOX-S/T-OLA-FFC　1　NAL-CTX-CIP-DOX-FOX-S/T-AMK-OLA-FFC　2 NAL-CIP-DOX-FOX-S/T-AMK-OLA-FFC　1

從菌株來源分析，23/68(60. 5%)株攜帶消毒劑抗性基因的菌株來自豬糞便樣品，其中分離自育肥豬(8/17，47. 1%)和保育豬(6/13，46. 2%)的大腸埃希菌數(shù)最多;其次是懷孕母豬(5/16，31. 3%)和后備母豬(3/10，30. 0%) ;哺乳仔豬最少(1/12，8. 3%).8/23(34. 8%)株攜帶消毒劑抗性基因的分離自豬場(chǎng)環(huán)境源，其中3/13(23. 1%)株來自空氣樣品; 2/5 (40. 0%)株來自土壤樣品; 3/5(60. 0%)株來自水樣品.豬場(chǎng)人員的糞便樣品中分離得到1/6(16. 7%)株攜帶ermE的大腸埃希菌.

表5　大腸埃希菌中消毒劑抗性基因分布Tab.5 Distribution of genes conferring resistances to disinfectant in Escherichia coli isolates

2.4大腸埃希菌對(duì)消毒劑抗藥性與抗菌藥耐藥性的關(guān)系

2.4.1消毒劑抗藥性表型與抗生素耐藥表型的關(guān)系通過比較發(fā)現(xiàn)，24/97(24. 7%)株大腸埃希菌對(duì)季銨鹽類消毒劑CTAB和BC表現(xiàn)較高水平的耐受，MIC≥128 mg·L－1(ATCC25922對(duì)應(yīng)的MIC為32和16 mg·L－1).這24株大腸埃希菌不僅表現(xiàn)出對(duì)季銨鹽類消毒劑耐受，同時(shí)對(duì)多種抗菌藥也表現(xiàn)較高水平的抗藥性，如CS耐藥率為95. 8%; S/T、DOX和FFC耐藥率均達(dá)到83. 3%;喹諾酮類抗生素耐藥率為62. 5%.該結(jié)果表明，大腸埃希菌對(duì)季銨鹽類消毒劑的抗藥性與抗菌藥耐藥性呈正相關(guān)，這與Buffet-Bataillon等［15］的研究結(jié)果一致.

2.4.2消毒劑抗性基因與抗生素耐藥表型的關(guān)系

大腸埃希菌對(duì)季銨鹽類消毒劑抗性基因和抗生素的耐藥性之間的關(guān)系，如圖2所示，在6種抗生素耐藥菌株中(SXT、NAL、CIP、FOX、AMK和CS)，消毒劑抗性基因檢出率分別高于其敏感菌株，而且CIP、FOX和CS耐藥菌株分別與其敏感菌株消毒劑抗性基因檢出率差異顯著(P＜0. 05).但是，在OLA、CTX、DOX 和FFC的耐藥菌株的檢測(cè)率分別低于其敏感菌株消毒劑抗性基因檢出率.結(jié)果表明，大腸埃希菌消毒劑抗性基因與一些特定的抗生素耐藥表型呈正相關(guān)，如SXT、NAL、CIP、FOX、AMK以及CS等.

圖2　抗生素耐藥與消毒劑抗性基因的關(guān)系Fig.2　 The relationship between antibiotics resistance and disifectant resistance genes

3　討論

針對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)及動(dòng)物性食品中大腸埃希菌污染的情況已有較多報(bào)道［13］，這些研究主要是圍繞豬體內(nèi)細(xì)菌抗生素的耐藥情況，而對(duì)豬場(chǎng)及周邊環(huán)境細(xì)菌污染及耐藥情況，尤其是消毒劑抗藥性的研究很少.本研究中97株大腸埃希菌分離于養(yǎng)殖場(chǎng)中各階段豬糞便樣品、空氣樣品、池塘水樣、周邊土壤以及工作人員糞便樣品，分離率為74. 6%，可見豬場(chǎng)及周邊環(huán)境中大腸埃希菌污染相當(dāng)嚴(yán)重.同時(shí)，分離于豬糞便樣品，周邊環(huán)境樣品(空氣、土壤、水樣)和豬場(chǎng)人員糞便樣品的大腸埃希菌，對(duì)QACs消毒劑CTAB和BC均表現(xiàn)較高的MIC，由此我們推測(cè)，大腸埃希菌可能是通過以下途徑傳播的:豬糞便排出后，流入水渠，污染了水源和土壤;水又被用于澆灌農(nóng)作物，從而導(dǎo)致豬場(chǎng)及周邊環(huán)境中大腸埃希菌污染嚴(yán)重.結(jié)果提示我們，消毒劑的濫用很可能會(huì)污染養(yǎng)殖環(huán)境，給臨床上細(xì)菌感染性疾病的治療帶來困難，因此在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)規(guī)范使用消毒劑，謹(jǐn)防耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生與傳播.

通過分析大腸埃希菌對(duì)消毒劑的MIC結(jié)果及耐藥基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，97株大腸埃希菌對(duì)季銨鹽類消毒劑CTAB和BC的MIC90普遍在128 mg·L－1以上，環(huán)境源大腸埃希菌對(duì)消毒劑BC和CL的MIC90普遍高于其他來源的大腸埃希菌.例如環(huán)境源大腸埃希菌對(duì)BC和CL的MIC90分別為256和16 mg·L－1，而保育豬糞源大腸埃希菌對(duì)BC和CL的MIC90為64和8 mg·L－1.在32株攜帶消毒劑抗性基因的大腸埃希菌中，23株(71. 8%)來自豬糞便樣品，其中分離自育肥豬和保育豬的菌株數(shù)最多，豬場(chǎng)環(huán)境源大腸埃希菌的消毒劑抗性基因檢出率也達(dá)到25. 0%(8/32).這可能是由于豬場(chǎng)在使用消毒劑后，殘留的部分被排出到環(huán)境中，形成一定的消毒劑選擇性壓力，并最終誘導(dǎo)環(huán)境中攜帶消毒劑抗性基因的細(xì)菌富集.令人擔(dān)憂的是，在人糞源大腸埃希菌中，檢測(cè)出1株(16. 7%)攜帶ermE基因，這些消毒劑抗性基因可能是通過污染環(huán)境或食物傳播給人，對(duì)人類健康構(gòu)成威脅［11］.

本研究發(fā)現(xiàn)，24. 7% (24/97)大腸埃希菌不僅對(duì)季銨鹽類消毒劑CTAB和BC表現(xiàn)較高水平的耐受，同時(shí)對(duì)黏菌素、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶，多西環(huán)素和氟苯尼考耐藥率達(dá)到83. 3%～95. 8%，表明大腸埃希菌對(duì)季銨鹽類消毒劑耐受與抗菌藥的抗性之間存在正相關(guān).經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，6種抗生素耐藥菌株中(SXT、NAL、CIP、FOX、AMK和CS)，消毒劑抗性基因檢出率分別高于其敏感菌株，而且CIP、FOX和CS耐藥菌株分別與其敏感菌株的消毒劑抗性基因檢出率差異顯著(P＜0. 05).可見，大腸埃希菌消毒劑抗性基因與一些抗生素耐藥表型存在密切關(guān)聯(lián)，如CIP、FOX、AMK和CS等.這類在消毒劑和抗生素共篩選(Co-selection)壓力下存活的細(xì)菌，可以稱之為“抗生素－消毒劑耐藥菌株”.細(xì)菌能同時(shí)獲得消毒劑抗藥性和抗生素耐藥性，其機(jī)制可能是通過交叉耐藥(Cross-resistance)實(shí)現(xiàn)，即不同的藥物對(duì)同一靶位作用或使用同一作用途徑;一般由單個(gè)外排泵介導(dǎo)，同時(shí)可以泵出QACs和其他抗菌物質(zhì)［16］，如葡萄球菌中qacC基因可賦予宿主對(duì)β-內(nèi)酰胺藥物的抗性［17］.第2種機(jī)制為共同耐藥(Co-resistance)，指賦予耐藥表型的基因存在于同一個(gè)可移動(dòng)元件上，如質(zhì)粒、I類整合子等.這些移動(dòng)元件可攜帶2個(gè)或更多的耐藥基因，并可以導(dǎo)致更為廣泛的水平傳播［18］.有研究發(fā)現(xiàn)，臨床分離的多重耐藥菌株，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等，其消毒劑抗性基因攜帶率非常高［19-20］.Soumet等［21］研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌長期暴露在QACs亞抑菌濃度下，可導(dǎo)致對(duì)抗生素耐藥菌株的篩選，給臨床治療帶來更大的挑戰(zhàn).本研究中，87%大腸埃希菌為多重耐藥菌株，對(duì)消毒劑同樣表現(xiàn)較高的抗藥性，與之前的報(bào)道一致.這類抗生素－消毒劑聯(lián)合耐藥菌株對(duì)抗生素或消毒劑的使用不再有效，一旦感染動(dòng)物或污染環(huán)境甚至傳播給人類，則可能引起公共衛(wèi)生安全問題，因此合理使用抗生素和消毒劑十分必要.動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的良好操作規(guī)范，低密度養(yǎng)殖和營養(yǎng)均衡，可以使動(dòng)物健康生長并減少對(duì)抗生素和消毒劑的依賴;同時(shí)污水應(yīng)通過生物降解、吸附、化學(xué)制劑及其他經(jīng)濟(jì)有效手段，去除耐藥菌株，從根本上減少耐藥菌株的傳播.

參考文獻(xiàn):

［1］HOLZEL C S，HARMS K S，BAUER J，et al.Diversity of antimicrobial resistance genes and class-1-integrons in phylogenetically related porcine and human Escherichia coli ［J］.Vet Microbiol，2012，160(3/4):403-412.

［2］XIONG W，SUN Y，ZHANG T，et al.Antibiotics，antibiotic resistance genes，and bacterial community composition in fresh water aquaculture environment in China［J］.Microb Ecol，2015，70(2):425-432.

［3］MCDONNELL G，RUSSELI A D.Antiseptics and disinfectants: Activity，action，and resistance［J］.Clin Microbiol Rev，1999，12(1):147-179.

［4］BJORLAND J，STEINUM T，KVITLE B，et al.Widespread distribution of disinfectant resistance genes among Staphylococci of bovine and caprine origin in Norway［J］.J Clin Microbiol，2005，43(9):4363-4368.

［5］BAY D C，ROMMENS K L，TURNER R J.Small multidrug resistance proteins: A multidrug transporter family that continues to grow［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1778(9):1814-1838.

［6］KANG H Y，JEONG Y S，OH J Y，et al.Characterization of antimicrobial resistance and class I integrons found in Escherichia coli isolates from humans and animals in Korea［J］.J Antimicrob Chemother，2005，55(5):639-644.

［7］WELCH T J，F(xiàn)RICKE W F，McDERMOTT P F，et al.Multiple antimicrobial resistance in plague: An emerging public health risk［J/OL］.PLoS One，2007，2 (3):e309.［2015-01-10］http: / /journals.plos.org/plosone/article? id =10.1371/journal.pone.0000309.

［8］WELCH T J，EVEHUIS J，WHITE D G，et al.IncA/C plasmid-mediated florfenicol resistance in the catfish pathogen Edwardsiella ictaluri［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53(2):845-846.

［9］BAY D C，TURNER R J.Diversity and evolution of the small multidrug resistance protein family［J］.BMC Evol Biol，2009，9: 140.

［10］阮燕平.革蘭氏陰性菌耐消毒劑基因的研究進(jìn)展［J］.中國消毒學(xué)雜志，2012，29(10):915-917.

［11］HAMER D H，GILL C J.From the farm to the kitchen table: The negative impact of antimicrobial use in animals on humans［J］.Nutr Rev，2002，60(8):261-264.

［12］GILBERT P，MCBAIN A J.Potential impact of increased use of biocides in consumer products on prevalence of antibiotic resistance［J］.Clin Microbiol Rev，2003，16(2):189-208.

［13］只帥，席美麗，劉攻關(guān)，等.陜西部分地區(qū)不同食源性大腸埃希菌耐藥性檢測(cè)［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2011，11 (1):196-201.

［14］Clinical and laboratory standards institute.Performance standards for antimi-crobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals: Documents VET01-A4E and VET01-S2E［S］.Wayne，PA，USA: CLSI，2013.

［15］BUFFET-BATAILLON S，BRANGER B，CORMIER M，et al.Effect of higher minimum inhibitory concentrations of quaternary ammonium compounds in clinical E.coli isolates on antibiotic susceptibilities and clinical outcomes ［J］.J Hosp Infect，2011，79(2):141-146.

［16］HUETA A，RAYGADA J L，MENDIRATTA K，et al.Multidrug efflux pump over expression in Staphylococcus aureus after single and multiple in vitro exposures to biocides and dyes［J］.Microbiol，2008，154(10):3144-3153.

［17］FUENTES D E，NAVARRO C A，TANTALEAN J C，et al.The product of the qacC gene of Staphylococcus epidermidis CH mediates resistance to beta-lactam antibiotics in gram-positive and gram-negative bacteria［J］.Res Microbiol，2005，156(4):472-477.

［18］SCHLUTER A，SZCZEPANOWSKI R，PUHLER A，et al.Genomics of IncP-1 antibiotic resistance plasmids isolated from waste water treatment plants provide evidence for a widely accessible drug resistance gene pool［J］.FEMS Microbiol Rev，2007，31(4):449-477.

［19］費(fèi)春楠，劉軍，沈凡，等.醫(yī)院內(nèi)感染病原菌對(duì)常見消毒劑耐藥性的研究［J］.環(huán)境與健康雜志，2007，24(12):1011-1012.

［20］林輝，鄭劍.銅綠假單胞菌對(duì)消毒劑抗藥性的研究進(jìn)展［J］.中國消毒學(xué)雜志，2007，24(3):269-271.

［21］SOUMET C，F(xiàn)OURREAU E，LEGRANDOIS P，et al.Resistance to phenicol compounds followingadaptation to quaternary ammonium compounds in Escherichia coli［J］.Vet Microbiol，2012，158 (1/2):147-152.

【責(zé)任編輯柴焰】

Prevalence of resistance to disinfectants and antibiotics in Escherichia coli isolated from the swine and farm environment

YANG Qiu'e，LI Liang，LIAO Xiaoping，LI Xingping，WANG Mingru，F(xiàn)ANG Xi，LIU Yahong，SUN Jian
(College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

Abstract:【Objective】The prevalence of disinfectant resistance genes and the relationship between resistance to disinfectants and antibiotics in Escherichia coli recovered from the swine and farm environment were investigated.【Method】A total of 130 samples collected from swine manure，air，pond water，soil and farm workers were screened for the presence of qacE，qacE△1，qacF，qacG，emrE，sugE(c)，sugE (p)，mdfA and ydgE/ydgF resistance genes.The susceptibilities of E.coli strains to four disinfectants and ten common antibiotics were determined using the agar dilution method.【Result and conclusion】Ninety-seven strains of E.coli were obtained from 130 samples with detection frequency of 74. 6%.All E.coli isolates showed reduced susceptibility to four disinfectants.The minimum inhibitory concentra-book=16,ebook=288tions (MICs) of benzalkonium chloride (BC) and cetyltrimethy ammonium bromide (CTAB) against E.coli were higher than those of triclosan (TCS) and chlorhexidine (CL).The percent of E.coli strains，which displayed multi-drug resistant phenotypes，was 87. 6% (85/97)，and the resistance rates of sulfamethoxazole/trimethoprim (S/T)，doxycycline(DOX)，nalidixic acid (NAL)，cefotaxime (CTX) and florfenicol (FFC) were high(68%－88%).However，the disinfectant resistance genes were less prevalent (2. 1%－20. 6%)，with the most prevalent of qacE△1 found in 97 E.coli strains.There was a positive correlation between antimicrobial resistance and high MICs of quaternary ammonium compounds.The close relationship between the detection rate of disinfectant resistance genes and six antimicrobials resistance in E.coli strains was found，which resisted S/T，NAL，ciprofloxacin (CIP)，cefoxitin (FOX)，AMK and CS，respectively.The co-resistance E.coli poses a challenge to environmental management.Therefore，regulation of using antibiotics and disinfectants is urgently needed in order to slow down the emergence of drug-resistant bacteria.

Key words:Escherichia coli; disinfectant resistance; resistance rate; antimicrobial

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金－廣東省政府聯(lián)合基金(U1201214) ;教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(IRT13063) ;國家自然科學(xué)基金青年基金(31402247)

作者簡(jiǎn)介:楊秋娥(1988—)，女，碩士研究生，E-mail: qiueyang2014@ 163.com;通信作者:孫堅(jiān)(1984—)，男，講師，博士，E-mail: jiansun@ scau.edu.cn

收稿日期:2015-01-20

文章編號(hào):1001-411X(2015) 06-0015-08

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):S852