基于骨組織工程的骨再生策略

陳澤駒，馮少龍，劉桂宏，劉宇，劉青華，蔣煜文

·綜述·

基于骨組織工程的骨再生策略

陳澤駒，馮少龍，劉桂宏，劉宇，劉青華，蔣煜文

519000 廣東，暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院（珠海市人民醫(yī)院）創(chuàng)傷骨科

骨組織能支撐肌肉，支持機(jī)體運(yùn)動(dòng)并保護(hù)重要的器官，并調(diào)節(jié)礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)和身體的內(nèi)分泌功能。雖然骨骼的自我愈合能力很強(qiáng)，但大面積的骨缺損阻礙了骨折的愈合[1]。創(chuàng)傷性損傷、骨腫瘤切除或先天性的缺陷都會(huì)導(dǎo)致骨不連或大面積骨缺損，并且與創(chuàng)傷嚴(yán)重程度、高齡、糖尿病等因素高度相關(guān)。骨不連的常見治療方法包括自體骨移植和同種異體骨移植，然而這些治療方法在骨的修復(fù)和再生中都存在不少局限。

自體骨移植是目前修復(fù)骨不連的常用方法，它從患者的髂嵴取骨并移植到骨折部位，具有良好的組織相容性和非免疫原性[2]。自體移植物中含有生長(zhǎng)因子（GF）、骨祖細(xì)胞和三維（3D）基質(zhì)，它們是骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)和骨整合的重要組成部分。然而，自體骨移植存在一定的缺點(diǎn)，比如出血、炎癥、感染和慢性疼痛，以及供體部位損傷和畸形、過(guò)敏、瘢痕等[3]。此外，自體骨移植的來(lái)源有限，不能處理大面積的骨缺損[4]。異體骨移植是治療骨不連的另一常見治療選擇，但也有缺乏供體、病毒性疾病傳播、細(xì)菌感染或免疫排斥等風(fēng)險(xiǎn)[1]。自體移植和同種異體移植的這些局限性和缺點(diǎn)推動(dòng)了骨組織工程骨再生方法的發(fā)展。

組織工程和再生醫(yī)學(xué)為損傷骨組織再生和愈合[5]提供了更為先進(jìn)的方法。本文綜述了基于骨組織工程的骨再生策略，強(qiáng)調(diào)了關(guān)鍵問(wèn)題和相應(yīng)的困難，同時(shí)梳理了骨組織工程的應(yīng)用和進(jìn)展。

1 骨再生與骨組織工程

1.1 骨組織工程與再生的生物材料

骨再生有三個(gè)基本特征：骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)和骨整合。骨誘導(dǎo)是指來(lái)自植床周邊宿主結(jié)締組織中的可誘導(dǎo)成骨前體細(xì)胞，在誘導(dǎo)因子的作用下產(chǎn)生骨原細(xì)胞，并經(jīng)成骨細(xì)胞形成新骨。因此，骨誘導(dǎo)物質(zhì)可以通過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞[6]的招募、增殖和分化來(lái)直接誘導(dǎo)成骨。而骨傳導(dǎo)是骨再生材料提供微環(huán)境并使原位成骨發(fā)生的能力。骨整合是指植入體與骨組織之間呈現(xiàn)的無(wú)纖維結(jié)締組織界面層的直接接觸。

生物材料需要具有生物相容性，與宿主的生物液體、組織和細(xì)胞能夠和諧存在，并且不會(huì)對(duì)局部或系統(tǒng)產(chǎn)生有害影響。其化學(xué)特征需要適合細(xì)胞黏附、增殖和分化。此外，它的孔隙大小、形狀和孔隙率可以促進(jìn)細(xì)胞的定植和血管化。

當(dāng)前有許多材料都運(yùn)用于骨再生策略，包括天然聚合物和合成聚合物[7]，如蛋白質(zhì)、多糖糖胺聚糖、聚乙醇酸（PGA），聚乳酸（PLA）、聚 ε-己內(nèi)酯（PCL）等、無(wú)機(jī)生物材料、金屬（如鈦金屬及其合金等）和陶瓷[如氧化鋁、氧化鋯、磷酸鈣陶瓷（CaPs）、磷酸鈣水泥（CPCs）等]，以及它們組合構(gòu)成的復(fù)合體。

聚合物是一類重要的骨組織工程材料。天然聚合物中有膠原、殼聚糖、藻酸、彈性蛋白和纖維素，它們都已運(yùn)用于再生和組織工程。其酶解和水解賦予了材料可吸收性[8]。合成聚合物則是一種具有更佳性能的材料。FDA 批準(zhǔn)使用的合成聚合物包括：聚乳酸（PLA）和聚乙醇酸（PGA），這兩種聚合物表現(xiàn)出非常好的力學(xué)性能；PCL 與人類間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）[9]具有很大的相容性，且降解速率較慢。高機(jī)械強(qiáng)度的聚合物有聚對(duì)苯二甲酸丁二酯（PBT）和聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET），它們都具有優(yōu)良的生物相容性、可生物降解性和抗沖擊性[10-11]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)了 PET 在過(guò)熱或長(zhǎng)期使用條件下可能會(huì)釋放鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）這種致癌物質(zhì)[12]，因此在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用中需要進(jìn)一步研究。

金屬材料機(jī)械強(qiáng)度較高，由鈦、鎂或不銹鋼等金屬制成的植入物已經(jīng)用于制作關(guān)節(jié)假體、鋼板和螺釘。近年來(lái)，研究者開發(fā)了不少金屬多孔支架來(lái)支持骨組織的再生。Van Bael 等[13]在氧化表層涂層中加入銀納米顆粒，開發(fā)鈦植入物，從而降低植入物相關(guān)感染的風(fēng)險(xiǎn)。但金屬支架的使用仍存在不少局限，包括不可降解性、離子釋放和感染風(fēng)險(xiǎn)等。其中，不可降解性是限制金屬作為支架材料的主要缺點(diǎn)。金屬支架在細(xì)胞黏附并形成新的骨組織后，并不會(huì)隨著時(shí)間的推移而降解。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)鎂合金多孔支架可以在體內(nèi)腐蝕降解[14]，從而解決這一問(wèn)題。

陶瓷是無(wú)機(jī)非金屬材料[15]。如磷酸鈣陶瓷（CaPs）和生物活性玻璃（BG）[16]，它們有優(yōu)良的力學(xué)性能，為新組織形成[2]提供了一個(gè)合適的界面。但陶瓷與皮質(zhì)骨相比韌性更低、楊氏模量更高，這使得它們不適合修復(fù)負(fù)重骨[17]。在骨組織工程中最常用的 CaPs 由羥基磷灰石（HA）、磷酸三鈣（TCP）組合而成，稱為雙相磷酸鈣（BCP）[18]。它們的成分與天然骨相似，具有良好的生物相容性、骨電導(dǎo)性，并利于骨整合[19]。

復(fù)合材料指由屬于相同或不同類別材料的兩種或兩種以上的基底制成的支架[20]。目前已開發(fā)的金屬-陶瓷復(fù)合材料可以同時(shí)發(fā)揮兩者的最佳力學(xué)性能[21-22]。羥基磷灰石和氧化鋁可以協(xié)助機(jī)體形成新骨[23]，通過(guò)與戊二醛、殼聚糖和明膠化學(xué)交聯(lián)形成相互連接的凝膠狀結(jié)構(gòu)，支持成骨前細(xì)胞和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[24]的黏附、浸潤(rùn)、增殖和功能的發(fā)揮。HA 和 TCP 組合而成的 BCP 已運(yùn)用于提高支架的降解性[25]。I 型膠原蛋白和生物磷灰石是生理骨組織的主要成分，所以模擬骨骼自然功能的最佳選擇是使用聚合物-陶瓷復(fù)合材料，比如納米羥基磷灰石/聚-ε-己內(nèi)酯[26]、殼聚糖/磷酸鈣[27]等。HA 已用于改善 PLA[28]等聚合物的力學(xué)性能以及骨細(xì)胞在這些表面上的附著和成熟[29]。然而，目前還沒有支架能夠在血管形成、可吸收性及骨再生方面完美地模擬骨的結(jié)構(gòu)特征。因此，大多數(shù)研究都集中于在支架中添加活性的生物分子和細(xì)胞，以再現(xiàn)在生理組織再生過(guò)程中發(fā)生的信號(hào)級(jí)聯(lián)。復(fù)合材料通過(guò)結(jié)合聚合物和陶瓷生物材料模擬自然組織，可以確保更好的強(qiáng)度、足夠的免疫反應(yīng)和生物降解性。雖然目前的研究從生物力學(xué)的角度顯示了令人欣喜的結(jié)果，但需要長(zhǎng)期的研究來(lái)促進(jìn)臨床轉(zhuǎn)化。

1.2 骨組織工程和再生中的支架成型策略

骨科臨床實(shí)踐需要解決的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是修復(fù)大面積骨缺損。當(dāng)前，沒有一種生物材料單獨(dú)具有理想的性能來(lái)有效地模擬骨組織[30]。因此，大部分研究都把重點(diǎn)放在組合材料的開發(fā)、分子和細(xì)胞的功能化以及組建新型支架。骨組織工程中的支架可以進(jìn)行功能化來(lái)提高它的性能，血管化支架、機(jī)械結(jié)構(gòu)化支架、梯度支架、仿生支架等都能夠有效提高支架內(nèi)在性能、促進(jìn)骨愈合再生。

血管化在骨組織再生中具有重要作用，許多研究都力求促進(jìn)血管生成。除了控制支架微結(jié)構(gòu)和孔隙率來(lái)支持新血管化，通過(guò)生物材料傳遞血管生成因子也是一種促進(jìn)血管生成的策略。具有代表性的血管生成因子包括金屬離子和生長(zhǎng)因子[31]。Quinlan 等[32]證實(shí)，鈷能夠誘導(dǎo)血管生成和促進(jìn)成骨。Li 等[33]發(fā)現(xiàn)硅多孔支架可增強(qiáng)成骨作用。另有學(xué)者已將硅這種成骨細(xì)胞礦化的重要元素用于骨再生目的，在膠原蛋白和羥基磷灰石復(fù)合材料中加入硅酸鋅可增強(qiáng)體內(nèi)骨血管生成，調(diào)節(jié)單核細(xì)胞，創(chuàng)造良好的成骨微環(huán)境[34]。此外，生長(zhǎng)因子對(duì)骨組織的再生有重要作用，它在損傷部位提供信號(hào)，使骨祖細(xì)胞和炎癥細(xì)胞遷移并啟動(dòng)愈合過(guò)程[35]。因此，支架除了模擬骨的機(jī)械結(jié)構(gòu)外，還應(yīng)有血管生成因子等生物活性分子，引導(dǎo)支架血管化，從而發(fā)揮出更強(qiáng)的成骨再生作用。

支架的機(jī)械強(qiáng)度主要由孔隙率控制，調(diào)節(jié)這項(xiàng)參數(shù)[36]來(lái)獲得優(yōu)良的平衡是重中之重。Torstrick 等[37]創(chuàng)建了表面多孔聚醚醚酮（PEEK）支架，與平滑的 PEEK 相比，這種表面多孔 PEEK（PEEK-sp）結(jié)構(gòu)具有高抗拉強(qiáng)度、抗疲勞性和更好的整合性。然而，尚不清楚孔隙結(jié)構(gòu)的孔徑、孔度或孔隙層厚度對(duì) PEEK 植入體生物力學(xué)性能的影響。另外，3D 打印技術(shù)可以通過(guò)自主設(shè)計(jì)來(lái)調(diào)控支架的孔隙大小，從而改良支架材料的內(nèi)在性能。若支架孔隙率過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致其力學(xué)性能下降；反之，孔隙率過(guò)低則不利于新骨生長(zhǎng)，使植入體內(nèi)的支架無(wú)法達(dá)到預(yù)期效果[38]。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出孔隙率為 60% 的骨組織工程支架的宏、微觀孔隙結(jié)構(gòu)與力學(xué)強(qiáng)度等綜合性能表現(xiàn)最優(yōu)[39]，可使支架更好地發(fā)揮支撐細(xì)胞和生長(zhǎng)因子的作用，提高成骨效率，促進(jìn)骨缺損修復(fù)。在現(xiàn)有的制造技術(shù)中，3D 生物打印技術(shù)正在快速發(fā)展，在微規(guī)模、高通量和細(xì)胞沉積方面有著巨大的優(yōu)勢(shì)[40]，是非常有發(fā)展前景的新技術(shù)。

梯度支架能夠重建復(fù)雜的軟骨-骨界面，代表了骨軟骨缺損治療的一個(gè)進(jìn)展，也是治療骨軟骨損傷的良好候選材料。綿羊體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，這種復(fù)合材料安全、易于使用，是促進(jìn)骨軟骨再生[41]過(guò)程的合適支架。隨后的馬匹研究也顯示骨軟骨缺損填充良好，無(wú)任何炎癥反應(yīng)[42]。在另一臨床研究中，采用梯度支架治療膝關(guān)節(jié)軟骨或骨軟骨病變?nèi)睋p，平均缺損大小1.5 ～ 6 cm2，在臨床評(píng)分和 MRI 評(píng)估中，均觀察到病變部位顯著的骨再生改善[43-44]。

仿生支架運(yùn)用于治療年輕或疾病早期患者的研究也獲得了積極的結(jié)果[45]。骨關(guān)節(jié)炎是最普遍的關(guān)節(jié)疾病，目前還沒有根治的治療方法，在這類人群上測(cè)試運(yùn)用仿生支架是為了逆轉(zhuǎn)不利環(huán)境，啟動(dòng)組織再生，從而減緩或防止疾病進(jìn)展。但目前需要進(jìn)一步的研究來(lái)更好地證明這種治療的實(shí)際有效性。Berruto 等[46]利用仿生支架治療膝關(guān)節(jié)骨軟骨病變，也取得了良好的療效。這種新方法能夠誘導(dǎo)原位再生，恢復(fù)軟骨或軟骨下骨，降低軟骨表面修復(fù)的成本和技術(shù)挑戰(zhàn)，并可運(yùn)用于較為復(fù)雜的相關(guān)病例。

許多已運(yùn)用于支架生產(chǎn)的傳統(tǒng)技術(shù)方法顯示出優(yōu)良的物理化學(xué)性能，并具有低成本的社會(huì)效益特點(diǎn)。而近年來(lái)所發(fā)展的先進(jìn)制造技術(shù)（如 3D 打?。?、超臨界流體技術(shù)和微流體技術(shù)可以使缺陷組織再生復(fù)雜結(jié)構(gòu)，提高孔隙率、結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能以及細(xì)胞的黏附。

修復(fù)受損骨組織需要采用合適的支架成型策略，用開創(chuàng)性的方法、設(shè)計(jì)和技術(shù)來(lái)充分治療和替換受損組織，并重建組織功能。這些策略有非常大的潛力來(lái)緩解骨移植手術(shù)的高成本和負(fù)面作用，并成為再生和修復(fù)受損骨組織的替代方法，提高社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。

2 骨再生的細(xì)胞成分

骨再生中有不少細(xì)胞可用于構(gòu)建骨結(jié)構(gòu)，包括成骨細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞（ESC）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）。成骨細(xì)胞是一種自體細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞，但它們的數(shù)量有限，增殖潛能較低。ESC 是來(lái)自囊胚內(nèi)團(tuán)的多能細(xì)胞，適合再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用，但由于畸胎瘤發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)、免疫不相和以及倫理問(wèn)題，其應(yīng)用仍存在爭(zhēng)議。iPSC 能克服上述對(duì) ESC 的擔(dān)憂，同時(shí)也顯示出了不錯(cuò)的分化潛力。而骨組織的巨大再生潛力無(wú)疑在于間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）可分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，并進(jìn)行軟骨內(nèi)成骨[47]，因此比 ESC、iPSC 和成骨細(xì)胞更適合于骨組織工程[48]。BMSC 除了可塑性外，其趨向性可以使它們遷移并回到受傷的部位，以響應(yīng)特定的信號(hào)[49]，是最有前途的異體治療細(xì)胞。有研究證明，脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞比 BMSC 可以發(fā)揮更多的免疫調(diào)節(jié)作用[34]；另一方面，它表現(xiàn)出更好的免疫逃逸[50]，說(shuō)明異體免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)最小[34]。

一些研究通過(guò)將 MSC 應(yīng)用于細(xì)胞治療和組織工程策略[51-52]來(lái)增強(qiáng)骨的再生?；?MSC 的治療包括骨髓移植和體外培養(yǎng)[53]擴(kuò)增治療。BMSC 治療已在多個(gè)臨床應(yīng)用中進(jìn)行了評(píng)估，包括骨折愈合、骨不愈合、各種頜骨缺損和預(yù)防骨壞死，揭示了其安全性和潛在療效[53]。然而，BMSC 治療存在一些局限性，特別是移植后生存時(shí)間短、最佳劑量和給藥途徑尚不清楚[54]等。

在 2015 年，有學(xué)者開發(fā)出一種衍生自人類胚胎的干細(xì)胞（hESC），通過(guò)誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)層樣細(xì)胞[55]，然后再進(jìn)一步分化為胚胎來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（T-MSC）。與成體 MSC相比，T-MSC 不受供體獲得性和差異性的限制，也不存在 MSC 因體外擴(kuò)增而喪失治療效果的風(fēng)險(xiǎn)。在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物試驗(yàn)中證實(shí)了 T-MSC 治療骨關(guān)節(jié)炎的有效性[55]。這使 T-MSC 在未來(lái)的骨再生細(xì)胞研究中具有不錯(cuò)的發(fā)展前景。

因此，到目前為止沒有一種基于 MSC 的產(chǎn)品成為骨再生的標(biāo)準(zhǔn)。在 MSC 的應(yīng)用中仍存在一些挑戰(zhàn)，例如質(zhì)量控制、細(xì)胞的組織來(lái)源等，其轉(zhuǎn)化應(yīng)用依然面臨著在制造和分析過(guò)程方面與標(biāo)準(zhǔn)化方面的相關(guān)問(wèn)題。

3 骨再生的生長(zhǎng)和分化分子

涉及骨組織再生研究最多的分子是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）[56]、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）。BMP 在間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化、有絲分裂和成骨分化以及促進(jìn)血管生成[57]的過(guò)程中發(fā)揮作用。重組 BMP-2 改善了 Mg/HA 支架對(duì)骨形成的影響，促進(jìn)了 Mg[58]的成骨和血管生成作用。盡管在聚合物中添加 BMP-2 不足以支持骨修復(fù)[59]，但當(dāng) BMP-2 與 HA 結(jié)合時(shí)，可促進(jìn)礦化骨形成[60]。此外，BMP-9 已運(yùn)用于復(fù)合支架的功能化，表現(xiàn)出了在體外促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和增強(qiáng)體內(nèi)骨形成的能力。VEGF 可促進(jìn)血管生成和骨的再生[61]；PDGF 是一種能夠誘導(dǎo)血管生成的有絲分裂生成原，它也有能力改善骨再生，增強(qiáng)周圍組織的血管化。Kirby 等[62]在 PCL 支架內(nèi)開發(fā)了一種基于 PLGA 的傳遞系統(tǒng)，它包含了 VEGF、PDGF 和 BMP-2，且可以使這些因子轉(zhuǎn)化成 PLGA 微粒。這些生長(zhǎng)和分化分子在骨再生過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用。

4 小結(jié)

目前已經(jīng)有許多關(guān)于骨再生策略的研究，但最佳的治療方法仍未有定論[63]?；诠墙M織工程的骨再生策略，嘗試提供能夠分化為成骨細(xì)胞的細(xì)胞、生長(zhǎng)和分化因子以及支持細(xì)胞附著、遷移和增殖的可降解支架來(lái)模擬骨愈合的自然過(guò)程。雖然自體移植仍然是目前骨修復(fù)的常用方法，但骨組織工程的快速進(jìn)展使骨再生技術(shù)不斷向臨床實(shí)踐的方向推動(dòng)。這些新技術(shù)為解決骨愈合不良問(wèn)題提供了一個(gè)非常有前景的解決方案，幫助臨床醫(yī)師應(yīng)對(duì)骨不連或大面積骨缺損給患者帶來(lái)的負(fù)面影響，并切實(shí)提高患者的生活質(zhì)量，減輕家庭和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

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蔣煜文，Email：jywjyw71@163.com

2021-10-29