干細(xì)胞治療耳聾研究進(jìn)展

劉日淵趙立東叢濤楊仕明解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科解放軍耳鼻喉科研究所(北京100853)

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干細(xì)胞治療耳聾研究進(jìn)展

劉日淵趙立東叢濤楊仕明
解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科解放軍耳鼻喉科研究所(北京100853)

【摘要】干細(xì)胞治療耳聾是近些年耳科的研究熱點(diǎn)之一，本文通過對干細(xì)胞耳聾治療相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，從干細(xì)胞用于內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的替代或修復(fù)的基礎(chǔ)、干細(xì)胞植入的方式、干細(xì)胞移植安全性方面，對干細(xì)胞治療耳聾的可行性進(jìn)行論述，認(rèn)為干細(xì)胞的內(nèi)耳移植治療已具備一定的基礎(chǔ)，在移植前需對細(xì)胞的分化進(jìn)行更精準(zhǔn)的控制，并且可以與傳統(tǒng)的治療方式（如人工耳蝸植入術(shù)）結(jié)合使用。

【關(guān)鍵詞】干細(xì)胞；耳聾；移植

This work was supported by:Major State Basic Research Development Program of China (973 Program)（2012CB967900）; National Natural Science Foundation of China（81271082）; Military Key Program（BWS14J045）.Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

感音神經(jīng)性耳聾是內(nèi)耳、耳蝸神經(jīng)、腦干聽覺通路及聽覺中樞病變導(dǎo)致的聽力下降的統(tǒng)稱。根據(jù)不同的感音神經(jīng)性耳聾的類型，可以選擇不同的治療方法，如突發(fā)性耳聾可以選擇藥物治療，遺留一定程度聽力損失的可以分別選擇助聽器、振動聲橋、骨導(dǎo)助聽器、人工耳蝸植入手術(shù)等，但這些方法的效果仍然各有其局限性。且上述治療方法各有不同適用條件，僅能盡力去補(bǔ)償殘余聽力，不能作為根治方法。所以，學(xué)者們?nèi)匀辉诓粩嗵剿髂軌蚴够颊叩穆犃ΡM可能恢復(fù)并接近正常人聽力的治療方式，即生物治療，如干細(xì)胞治療、分子治療和基因治療等手段[1]。本文就干細(xì)胞治療耳聾作綜述。

1　干細(xì)胞用于內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的替代或修復(fù)的基礎(chǔ)

內(nèi)耳包括耳蝸和前庭，耳蝸是感受聲音的器官，其Corti器的毛細(xì)胞感受壓力后產(chǎn)生動作電位，傳遞至通過Habenular孔的神經(jīng)，到螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞，再繼續(xù)向上傳遞最終到聽覺皮層進(jìn)行處理。每個環(huán)節(jié)受損都會影響聽力，而當(dāng)前研究的熱點(diǎn)主要針對毛細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞的替代與修復(fù)。

干細(xì)胞替代治療是指生物原有正常結(jié)構(gòu)損傷或改變后，利用干細(xì)胞多能性，定向誘導(dǎo)分化出與原來形態(tài)功能相同的結(jié)構(gòu)的一種治療，這種治療方式恰恰可以彌補(bǔ)內(nèi)耳毛細(xì)胞的不可再生。首先，需要解決能否向神經(jīng)細(xì)胞或是毛細(xì)胞誘導(dǎo)的問題。Kazuo[2]、Qin[3]等先后將胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成與毛細(xì)胞類似的細(xì)胞，表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志物myosinⅦA，從形態(tài)上可見細(xì)胞生長靜纖毛樣的突起；He還通過使用EGF和bFGF調(diào)控細(xì)胞生長，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化，表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)志物nestin蛋白。Li[4]通過對鼠的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)，使其分化為毛細(xì)胞前體細(xì)胞，該細(xì)胞不僅表達(dá)nestin蛋白，還表達(dá)Pax2，BMP7和Jagged-1等聽泡前期發(fā)育的特征性表達(dá)物。對前體細(xì)胞進(jìn)一步誘導(dǎo)，Pax2和BMP7表達(dá)下降，開始表達(dá)成熟感覺上皮的標(biāo)志Math1、Brn3.1和Jagged-1，以及毛細(xì)胞標(biāo)志物myosinⅦA、espin、parvalbumin3和α9 acetylcholine receptor等等。進(jìn)一步將前體細(xì)胞移植到雞胚的聽泡中，在聽泡上皮的穿刺部位，見部分前體細(xì)胞遷移至其中并進(jìn)一步分化成熟，在移植后14天表達(dá)epsin。Koehler等[5]在體外通過調(diào)控BMP （Bone Morphogenetic Protein）、TGFβ和FGF（Fibro?blast Growth Factor），使小鼠胚胎干細(xì)胞團(tuán)塊發(fā)育成聽板樣的皮層，釋放出攜帶前體細(xì)胞的囊泡，分化成帶有動靜纖毛的毛細(xì)胞，進(jìn)一步證明該囊泡的結(jié)構(gòu)以及生化功能都與發(fā)育中的前庭終末器官非常相似。除了對內(nèi)耳毛細(xì)胞的替代研究，內(nèi)耳神經(jīng)的替代治療也成為可能。Shi等人[6]在體外將人類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)成表達(dá)Pax2和nestin的神經(jīng)前體細(xì)胞，通過移除生長因子FGF-2后，可發(fā)現(xiàn)少量神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞。通過添加BMP4能提高神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)量：在體外與去神經(jīng)的感覺上皮接觸后，能表達(dá)神經(jīng)突觸的標(biāo)記物。Chen[7]進(jìn)一步驗(yàn)證了定向分化為神經(jīng)前體細(xì)胞后的電生理功能，能檢測出單動作電位，將其移植到聽神經(jīng)病模型中，不僅可以觀察到細(xì)胞遷移、分化，還能對損失的聽力產(chǎn)生修復(fù)作用。

雖然暫時沒有研究可證明類毛細(xì)胞細(xì)胞的生理學(xué)特征，但這些研究的結(jié)果至少表明，不同類型的干細(xì)胞可以開始向毛細(xì)胞或者神經(jīng)細(xì)胞的方向誘導(dǎo)分化，為替代治療的施行奠定基礎(chǔ)。

除了利用干細(xì)胞進(jìn)行替代治療，還可利用干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，達(dá)到修復(fù)的目的。Kamiya等[8]在線粒體毒素造成耳蝸纖維細(xì)胞的損傷模型上發(fā)現(xiàn)，移植間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)動物的聽力恢復(fù)情況較對照組好，免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)移植后干細(xì)胞的連接蛋白表達(dá)陽性，提示可能修復(fù)鉀離子循環(huán)通路。另一可行方式是利用基因修飾的干細(xì)胞作為載體，產(chǎn)生促進(jìn)內(nèi)耳修復(fù)的因子。在BDNF無義突變的鼠模型身上，NT-3 (Neurotrophin-3)啟動子調(diào)控的BDNF（Brain-Derived Neurotrophic Factor）使前庭神經(jīng)元向耳蝸底回發(fā)出大量突起[9]，雖然這些前庭神經(jīng)纖維最后并沒有進(jìn)入Corti器連接毛細(xì)胞，但提示了這些神經(jīng)生長因子對突觸生長的趨化作用。另外，已有研究證明BDNF-間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的BDNF可以有效阻止阿爾茨海默病的病變進(jìn)展[10]。BDNF通過增加抗氧化酶谷胱甘肽還原酶活性和超氧化物歧化酶活性減輕氧化應(yīng)激，可提高干細(xì)胞存活率[11]。所以，基因工程的干細(xì)胞分泌特定的因子也可促進(jìn)內(nèi)耳的修復(fù)。

2　干細(xì)胞植入的方式

干細(xì)胞移植的方式有全身移植和局部移植。全身移植包括靜脈注射[12]，肌肉注射。局部移植包括蛛網(wǎng)膜下腔穿刺移植[13]等等，其中對于內(nèi)耳可選的注射路徑有：圓窗[14-15]、半規(guī)管[8]、中階、蝸軸[16]、耳蝸外側(cè)壁[17]等。圓窗入路注射移植和外半規(guī)管入路注射移植可以歸結(jié)為一類，都通過外淋巴液路徑，借助外淋巴液的流動促使細(xì)胞遷移。其中圓窗入路與臨床操作較接近，在動物身上操作也比較簡易。

以Cortis器為目標(biāo)，干細(xì)胞的移植需要克服內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的物理屏障。從中階移植（內(nèi)淋巴徑路）的干細(xì)胞如果要進(jìn)入Cortis器，需要通過蓋膜或者毛細(xì)胞和支持細(xì)胞形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。毛細(xì)胞損傷可能出現(xiàn)一個潛在的腔隙，但是其周圍的支持細(xì)胞會擴(kuò)大管腔面填塞缺口，從而限制或阻止向內(nèi)淋巴液移植的干細(xì)胞進(jìn)入Cortis器。此外，內(nèi)淋巴液中的高鉀環(huán)境也可能損傷移植的細(xì)胞。對于鼓階等外淋巴徑路移植的干細(xì)胞，必須通過由各種膠原形成的基底膜等結(jié)構(gòu)或由上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞形成的前庭膜。以螺旋神經(jīng)節(jié)部位為移植目標(biāo)要通過骨螺旋屏障，骨壁上的齒孔可以提供足夠大的空間使細(xì)胞遷移至Rosen?thal’s canal[18]，另外蝸軸穿刺移植細(xì)胞可直達(dá)目標(biāo)部位，但操作困難且易引起損傷。

最后，若需要重建功能，例如毛細(xì)胞，則還須與螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元形成功能性突觸鏈接。對于以螺旋神經(jīng)節(jié)為目標(biāo)的移植，除了需要通過蝸軸的骨質(zhì)，還需要移植的細(xì)胞與毛細(xì)胞和腦干聽覺的目標(biāo)區(qū)域形成突觸鏈接。

通過探索實(shí)踐，對于內(nèi)耳方向的移植有了進(jìn)展。Corrales等人[16]使用Ouabain將沙鼠造成耳聾模型，并把小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)成的神經(jīng)前體細(xì)胞移植到蝸軸，發(fā)現(xiàn)移植物發(fā)出突起，通過Rosenthal's canal，經(jīng)過骨螺旋板，延伸至受損的Cortis器。Mark A.Parker[15]通過鼓階打孔將干細(xì)胞移植到噪聲性耳聾的模型中，并且能觀察到向Rosental管和Cortis器的遷移，Zhao 等[19]進(jìn)一步觀察到移植細(xì)胞遷移至中階，抵達(dá)Cortis器，并且表達(dá)myosinⅦA。李等[20]在鼓階打孔移植術(shù)后通過ABR測試證明該移植方式對聽力影響不大。Kamiya[8]通過后半規(guī)管注射間充質(zhì)干細(xì)胞，在壺腹嵴和鼓階可以觀察到遷移的干細(xì)胞。Tamura T等[21]通過外半規(guī)管注射技術(shù)[22]注射順鉑等藥物造成損傷，再通過圓窗將濃度達(dá)105個細(xì)胞每微升濃度的細(xì)胞干細(xì)胞移植到蝸軸。上述研究證明一些移植的細(xì)胞向相關(guān)部位遷移，但其具體遷移機(jī)制，有待進(jìn)一步的研究。張[17]在Hildebrand[23]的研究基礎(chǔ)上，利用耳蝸外側(cè)壁的螺旋韌帶和血管紋移植干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以沿著基底膜遷移到受損的螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域并且能表達(dá)Tubulin。歸納當(dāng)前的研究，干細(xì)胞而抵達(dá)目標(biāo)位置后，可觀察到遷移細(xì)胞向某一類型的細(xì)胞分化的趨勢，如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、類毛細(xì)胞等。目前評估特定細(xì)胞類型的分化主要依賴細(xì)胞種類的特異性標(biāo)志物，但這些細(xì)胞是否具有相應(yīng)的功能還有待研究。

還有一種假設(shè)，可以利用干細(xì)胞針對性損傷部位釋放的因子產(chǎn)生遷移，例如趨化因子Stromal Cell-De?rived Factor-1 (SDF-1)。放射或者炎癥損傷可促進(jìn)肝臟膽管上皮釋放SDF-1，吸引人類或鼠類的前體細(xì)胞，抵達(dá)損傷部位[24]。在耳蝸可否利用這種趨化性，需進(jìn)一步研究。

3　干細(xì)胞移植安全性

干細(xì)胞移植相關(guān)的安全問題主要是細(xì)胞毒性和成瘤性。在體觀察細(xì)胞毒性可通過體重、進(jìn)食量、進(jìn)水量的變化，以及血液生化檢查、尿常規(guī)等間接檢測，動物死亡后可行病理檢查觀察病變部位；成瘤性的檢測可通過間接觀察動物體重、取材后將移植處和相應(yīng)臟器進(jìn)行形態(tài)對比等手段。對于成體干細(xì)胞，尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞的研究比較多。Ra等人[12]曾用免疫缺陷小鼠檢查脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞毒性及成瘤性：使用三種濃度2×106/kg、2×107/kg和2×108/kg尾靜脈注射。細(xì)胞毒性觀察時長13周，成瘤性觀察時長26周，實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，均無明顯異常。其進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)是將患者自體的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞回輸，無異常反應(yīng)。佟[25]等人將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入裸鼠中觀察分析，認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在15代以內(nèi)植入裸鼠體內(nèi)無成瘤性，其風(fēng)險隨體外培養(yǎng)代數(shù)增加而增加。而對于胚胎干細(xì)胞，自分離出來，就發(fā)現(xiàn)和畸胎癌細(xì)胞具有很多相似性，比如多能性標(biāo)志的表達(dá)和畸胎瘤的形成能力。后來Takahashi[26]等將OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入成纖維細(xì)胞，使之重編程為類似"胚胎干細(xì)胞"形態(tài)的多能干細(xì)胞，即"誘導(dǎo)多能干細(xì)胞"。但Yamanaka[27]等后來的研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過重編程基因改造的121只實(shí)驗(yàn)鼠中有20%發(fā)生了腫瘤病變。綜上，間充質(zhì)干細(xì)胞較胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞安全。

按照干細(xì)胞的來源以及供、受體的遺傳背景進(jìn)行分類，干細(xì)胞移植可以分為：（1）自體移植，這種同基因、自身-自身的移植方式不會產(chǎn)生排斥反應(yīng)。（2）同基因移植，所有基因位點(diǎn)均相同的移植，一般不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。（3）同種異體移植，是指種內(nèi)遺傳背景不同個體間的移植，其強(qiáng)烈、快速的排斥反應(yīng)由主要組織相容性抗原（Major Histocompatibility antigen,MHC抗原）引起，而緩慢、溫和的反應(yīng)則由次要組織相容性復(fù)合抗源（Minor Histocompatibility antigen，mH抗原）引起。（4）異種移植，指不同種屬個體間的移植，其排斥反應(yīng)的可能性最大、最嚴(yán)重。當(dāng)前的研究手段如免疫組織化學(xué)，常借用不同種屬的抗體差異對移植后的干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。其優(yōu)點(diǎn)在于提高組化染色的特異性，但更容易引起排斥反應(yīng)。與其他類型干細(xì)胞相比，間充質(zhì)干細(xì)胞相對安全，是因?yàn)樗芤种艭D4+的T細(xì)胞增殖、阻止樹突狀細(xì)胞的成熟、促進(jìn)T調(diào)控細(xì)胞的生成、產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子如prostaglandinE2(PGE2) transforming growth factor-1(TGF-1) interleukin-10 (IL-10) hepatocyte growth factor(HGF)等[28]。雖然主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility complex,MHC）中的NK細(xì)胞對異種移植的間充質(zhì)干細(xì)胞也具有殺傷作用，但通過基因修飾使間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)HLA-E/β2 microglobulin和HLA-G molecules，可以降低NK細(xì)胞的殺傷作用[29]。Li統(tǒng)計94篇關(guān)于干細(xì)胞跨物種移植的文獻(xiàn)，總結(jié)得出：人類間充質(zhì)干細(xì)胞異種移植后至少在7個物種中起效，同時源于其他物種（如豬、大鼠、豚鼠）的干細(xì)胞也可以跨越物種界限作用[30]。所以，就目前基礎(chǔ)試驗(yàn)的異種移植研究來說，間充質(zhì)干細(xì)胞是較好的選擇。

4　總結(jié)與展望

干細(xì)胞向毛細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化、干細(xì)胞內(nèi)耳移植的方式的探索、干細(xì)胞移植的安全性研究為干細(xì)胞的體內(nèi)移植奠定了基礎(chǔ)。

在移植之前，應(yīng)對細(xì)胞的分化方向的控制有更好的研究。移植細(xì)胞的分化階段、移植時間點(diǎn)和方式的選擇都需要進(jìn)一步探索。例如，毛細(xì)胞前體細(xì)胞在什么階段移植更利于與周圍的細(xì)胞和神經(jīng)纖維都形成有效的突觸？干細(xì)胞移植到蝸軸后，如何使其在施旺細(xì)胞的包繞下生長？基因工程干細(xì)胞該以什么方式移植才能與干細(xì)胞產(chǎn)生最大的協(xié)同作用？所以，前體細(xì)胞移植以及配合基因工程干細(xì)胞的移植都將是未來的研究方向。

傳統(tǒng)內(nèi)耳移植方式如圓窗入路、蝸軸移植都會對內(nèi)耳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的損傷，不利于臨床殘余聽力的保護(hù)。未來可探索對內(nèi)耳損傷降到最小的移植方式：腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔移植入路[31]。從解剖角度看，內(nèi)耳的外淋巴液與腦脊液相通，所以，可嘗試通過蛛網(wǎng)膜下腔入路將移植的干細(xì)胞送抵內(nèi)聽道。但是，干細(xì)胞是否可以通過屏障進(jìn)入內(nèi)耳或是通過分泌因子影響內(nèi)耳，需繼續(xù)研究。

當(dāng)前臨床上有耳蝸神經(jīng)發(fā)育不良或未發(fā)育的患者，人工耳蝸植入的效果較差甚至無效[32]。結(jié)合電刺激對干細(xì)胞影響的研究結(jié)果[33]，干細(xì)胞移植修復(fù)內(nèi)耳與傳統(tǒng)的治療方式如人工耳蝸植入術(shù)結(jié)合也將會是解決這一類臨床問題的研究熱點(diǎn)。

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·聽覺研究新模型專輯·

Research and Development of Stem Cell Therapy for Deafness

LIU Riyuan ,ZHAO Lidong ,CONG Tao ,YANG Shiming
Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,People’s Liberation Army General Hospital,Institute of Otolaryngology of the People’s Liberation Army,Beijing,100853
Corresponding author:YANG ShimingEmail:yangsm301@263.net

【Abstract】In recent years,stem cell therapy for hearing loss has become a hot topic in the field of otology.This paper contains a review of the literatures on stem cell therapies for hearing loss,discusses on its feasibility from the perspectives of the basis for replacing or repairing inner ear structures,stem cells transplantation approaches and its safety.and concludes that transplanting stem cells into the inner ear is feasible,although more precise control over cell differentiation is required before actual transplantation,and can be used together with other traditional therapies,such as cochlear implants.

【Keywords】Stem Cell；Hearing Loss；Transplantation

收稿日期：（2015-11-27）

通訊作者：楊仕明，Email:yangsm301@263.net

作者簡介：劉日淵，博士，醫(yī)師，研究方向:耳科學(xué)

基金項(xiàng)目：國家“973”計劃重大科學(xué)研究計劃干細(xì)胞項(xiàng)目（2012CB967900）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81271082）；軍隊(duì)重點(diǎn)課題（BWS14J045）

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.002

【中圖分類號】R764.43

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1672-2922（2016）01-6-4