脲原體檢測的方法學研究進展

全可新 綜述 周運恒 審校武警上海市總隊醫(yī)院檢驗科（上海 201103）

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脲原體檢測的方法學研究進展

全可新 綜述 周運恒 審校
武警上海市總隊醫(yī)院檢驗科（上海 201103）

脲原體（Ureaplasma spp.）是目前發(fā)現(xiàn)能在無生命培養(yǎng)基上生長繁殖的最小微生物，對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求較高，一般是以牛心浸液作基礎，添加10%～20%動物血清及10%新鮮酵母浸液等，生長需要一定的pH值和溫濕度等［1］。在2002年之前，一直認為脲原體只有一個種，解脲脲原體，或溶脲脲原體/解脲支原體，之后根據(jù)表型和基因型特征分為兩大生物群共14個血清型［2］。目前，國內(nèi)仍有很多文獻默認解脲脲原體為脲原體的唯一個種。脲原體屬于條件致病病原體，可黏附在泌尿生殖道的粘膜及上皮細胞，是引起性傳播疾病的常見病原體，還可以引起宮頸炎、盆腔炎、不孕不育、不良妊娠、前列腺炎、附睪炎等，致病性最強的是孕婦和新生兒［3-7］。流行病學調(diào)查提示，成年女性泌尿生殖道脲原體檢出率為40%～80%，男性為20%～58%［8］。其檢出率差別較大，可能與受檢人群和檢測方法等因素有關(guān)。目前，臨床上檢測脲原體的主要方法有液體培養(yǎng)法、固體培養(yǎng)法、免疫學方法和分子生物學方法等，各種方法均有一定的優(yōu)缺點，現(xiàn)綜述如下。

一、液體培養(yǎng)法

目前國內(nèi)臨床實驗室采用的主要檢測方法是液體培養(yǎng)法。該法操作簡單、僅靠肉眼結(jié)果無需特殊的儀器設備，商業(yè)化的支原體培養(yǎng)、鑒定、計數(shù)及藥敏一體化試劑盒可以對脲原體進行半定量的檢測和對四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類抗生素進行定性藥敏檢測。其主要原理是脲原體可以分解尿素產(chǎn)NH3，根據(jù)培養(yǎng)基內(nèi)的酚紅指示劑顏色變化來判斷是否有脲原體生長。嚴格地說這種做法是錯誤的，只能算是脲原體分離培養(yǎng)的第一步。但液體培養(yǎng)法可以半定量計數(shù)，凡≥104顏色變化計數(shù)單位（color change units，CCU）/mL鑒定孔試劑變色為支原體陽性，≤104CCU/mL為攜帶者或無致病意義。

目前國內(nèi)生產(chǎn)脲原體試劑盒的廠家眾多，質(zhì)量也參差不齊，檢測的靈敏度和特異性各有差異，而且缺乏質(zhì)控品和統(tǒng)一的標準，因此無法對商品化的試劑進行統(tǒng)一評價［9］。該法已經(jīng)在臨床上沿用20年之久，存在雜菌干擾而致的假陽性、假陰性和容易污染使結(jié)果難以判斷等缺點。尤其是女性由于生理結(jié)構(gòu)的原因，棲居較多分解尿素的陰道菌群和宮頸菌群，如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯、銅綠單胞菌和變形桿菌等。另外標本中某些酵母菌和葡萄球菌的污染以及少量堿性標本也是液體培養(yǎng)法假陽性增加的原因［10］。據(jù)曹愛國等研究報道液體培養(yǎng)基的假陽性率在20%左右［11］，也有報道用再培養(yǎng)法可以降低假陽性率［12］。

二、固體培養(yǎng)法

固體培養(yǎng)法可以通過顯微鏡觀察支原體特有的如“海膽型”或“油煎蛋樣”菌落，可以同時鑒別多種支原體，靈敏度和準確性較高，不容易污染，是微生物診斷的金標準［13， 14］。但由于操作麻煩、培養(yǎng)時間長、成本較高以及有效期短等原因，再加上液體和固體法之間的陽性率也有一定的爭議，而且支原體形態(tài)和菌落較難辨認以及存在異質(zhì)性等問題，目前國內(nèi)外臨床上固體培養(yǎng)法應用甚少。

傳統(tǒng)的支原體分離培養(yǎng)過程應有兩部分，肉湯增菌和濾液轉(zhuǎn)種，觀察其菌落形態(tài)，然后進行Diense染色和生化反應最終報告［15］。美國2010年第10版的《Manual of Clinical Microbiology》和中國2007年第三版的《全國臨床檢驗操作規(guī)程》都要求支原體的分離培養(yǎng)都包括肉湯增菌和轉(zhuǎn)種固體平板［16，17］。但這種間接轉(zhuǎn)種法需要將培養(yǎng)陽性的標本轉(zhuǎn)種到固體瓊脂上，耗時更長，操作更加繁瑣，陽性率偏低，而且轉(zhuǎn)種的時間選擇不當也會對結(jié)果造成影響，比如支原體含量高的標本增殖高峰在6～12 h，而支原體含量低的標本，增殖的高峰在12～24 h，增菌時間過長轉(zhuǎn)種會導致假陰性培養(yǎng)結(jié)果，如果轉(zhuǎn)種時間過短，小于10 h，可能沒有在支原體的對數(shù)生長期，也會導致陽性率降低［18］。

目前市場上主要用的是支原體選擇性固體瓊脂培養(yǎng)法，各種泌尿生殖道標本均可以直接接種，48～72 h觀察結(jié)果，鏡下觀察背景很清晰，利用劃痕能很快找到瓊脂層表面并在劃痕附近找到支原體菌落，有利于菌種分離、純化、保存以做進一步研究，還可通過菌落形成單位（colony forming units，CFU）推斷出標本中支原體的真實含量，顯示出比液體培養(yǎng)基更為準確、定量的優(yōu)點。固體-液體培養(yǎng)法聯(lián)合檢測具有更高的敏感性和特異性，最近吳磊等［19］報道固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)同時接種樣本，明顯縮短了固體培養(yǎng)的檢測周期，超過85%的支原體在24 h以內(nèi)觀察到菌落，而48 h以內(nèi)固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)的陽性率幾乎沒有差別。

三、免疫學方法

免疫學方法可通過直接檢測特異性抗原或抗體來判斷是否感染脲原體，可對脲原體的感染做出早期、快速的診斷。其操作簡單，快速，無需特殊設備，結(jié)果容易判斷，在臨床上可作為脲原體感染的輔助診斷指標。常用的是金標法，可一次檢測大量標本，對脲原體感染的快速診斷及流行病學的研究調(diào)查具有較大的實用價值［20］。人體感染脲原體后，能產(chǎn)生特異性IgM類和IgG類抗體。IgM類抗體在感染1周后出現(xiàn)，3～4周達高峰，當患者出現(xiàn)臨床癥狀而就診時，IgM抗體水平一般比較高，因此可作為急性期感染的診斷指標。IgG抗體比IgM出現(xiàn)晚，需連續(xù)監(jiān)測觀察，在恢復期血清抗體效價比急性期血清效價增高4倍以上，才有診斷意義［21］。另一方面，由于健康人群中脲原體檢出率也很高，所以用抗體滴度很難解釋脲原體的感染，血清中抗體含量比較低也會出現(xiàn)假陰性，另外結(jié)果容易受到溶血、脂血的影響，導致免疫學檢測法的特異性不高，也未標準化，所以目前臨床上未能廣泛應用。在脲原體的分型方法學上，基于抗脲原體血清型單克隆抗體的血清學分型研究發(fā)展最早，最初采用生長抑制試驗或代謝抑制試驗判斷菌株血清型別，但由于抗血清制備煩瑣，難得到商品化的各種抗血清，且不同抗血清型的單克隆抗體之間有不同程度的交叉反應，缺乏可重復操作性，在臨床上也無法應用［22］。

四、分子生物學檢測

分子生物學檢測主要是根據(jù)脲原體的尿素酶基因、多帶抗原基因和16S rRNA-23S rRNA基因進行擴增檢測，應用較多的是聚合酶鏈反應技術(shù)（Polymerase Chain Reaction， PCR），以及在此基礎上的其他PCR技術(shù)。例如，陸春等于2004年用聚合酶鏈反應-單鏈構(gòu)象的多態(tài)性技術(shù)（PCR-SSCP）鑒定脲原體生物群和基因型［23］。Vancutsem于2011年用熒光實時定量PCR進行分群［24］。Xiao于2010年建立了多重實時熒光定量PCR技術(shù)，可以對脲原體的兩群14個型同時進行鑒定［25］。近期謝鑫友教授采用多位點序列分型（multilocus sequence typing， MLST）對脲原體進行分群和分型，建立脲原體的MLST數(shù)據(jù)庫，揭示脲原體致病性和主要毒力株的MLST型，發(fā)現(xiàn)主要致病性克隆，為預防阻斷流行株的傳播和個體化治療提供依據(jù)［26，27］。

分子生物學方法簡便、快捷、靈敏度高、特異性高、重復性好、可以定量測定，目前在臨床上廣泛應用，但需要嚴格、規(guī)范的實驗環(huán)境和特殊的儀器設備，并且不能進行藥敏試驗，在基層單位難以開展。另外，PCR方法靈敏度極高，在整個操作過程中PCR產(chǎn)物的污染會產(chǎn)生假陽性；PCR對死細胞同樣能進行擴增，能夠檢測出無復制活性的基因片段而導致假陽性。目前主要用于致病性和分群等方面的研究，研究表明并非所有的脲原體生物型都致病，其致病性可能與生物群或血清型別、宿主免疫力、性伴數(shù)、感染濃度、感染時間和機體微環(huán)境等多種因素有關(guān)［28，29］。

結(jié)　論

隨著脲原體致病性的深入研究，其檢測方法也在不斷的更新和規(guī)范，目前臨床上使用的各種方法各有優(yōu)勢和不足。液體培養(yǎng)法由于操作簡便、價格低廉、不需特殊設備、可以觀察藥敏結(jié)果等原因在國內(nèi)尤其是基層醫(yī)院仍會長期使用。為了提高特異性和準確性，最好用液體培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法一步法聯(lián)合使用，既可對混合支原體進行定性和定量檢測，又可進行定性藥敏試驗。分子生物學檢測方法可以快速準確地對脲原體進行分群和分型鑒定，為進一步研究其分子流行病學、致病機制和耐藥機制提供依據(jù)。分子生物學和培養(yǎng)法互相補充，可以快速分離、培養(yǎng)和鑒定脲原體，能夠準確衡量是否需要治療或是否治愈的熒光定量PCR定量技術(shù)將是未來檢測脲原體的研究方向。

致謝：本文由上海市自然科學基金（13ZR1449700）基金項目資助

關(guān)鍵詞脲原體屬；分子生物學

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（2015-11-30收稿）

doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2016.03.019

中圖分類號R 446.5