流式細(xì)胞儀三色熒光標(biāo)記技術(shù)在白血病免疫分型中的應(yīng)用

羅代平

（河南省濮陽市油田總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 濮陽 457001）

白血病患者臨床并不少見，免疫分型檢測對診斷、治療及判斷預(yù)后均具有重要臨床意義。近年，國際上較為認(rèn)同的方式為應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行免疫分型，但仍沒有統(tǒng)一的抗體標(biāo)準(zhǔn)，多采取商家提供的三色熒光標(biāo)記抗體，具有一定局限性[1-2]。本研究旨在探討采取自行設(shè)計(jì)的三色熒光標(biāo)記抗體使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行免疫分型，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本科室收治的白血病患者120例入選本研究，均經(jīng)患者及家屬知情同意，且符合倫理委員會基本要求。其中，男79例，女41例；年齡20～65 歲,平均（37.6±9.9）歲；均為初治患者。法、美、英分型系統(tǒng)（French-American-British classification systems,FAB）分析：急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）74例；急性非淋巴細(xì)胞白血病（acute non-lymphocytic leukemia,ANLL）46例。

1.2 材料

本研究使用的抗體標(biāo)記熒光素為異硫氰酸熒光素（FITC）/藻紅蛋白（PE）/多甲藻葉綠素蛋白（PerCP）。單克隆抗體購自Becton Dickson Pharmingen公司。

1.3 方法

抽取120例患者外周血，均按常規(guī)方法分離為單個(gè)核細(xì)胞（mononuclear cells,MNC），其中，用單色熒光標(biāo)記技術(shù)檢測60例，三色熒光標(biāo)記技術(shù)檢測60例。

1.3.1 單色熒光標(biāo)記技術(shù) 使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）將MNC濃度調(diào)整為1×109/L,共11管，每管200 μl。各管分別加入以下單抗體20 μl:IgG1-PE、CD3-PE、CD7-PE、CD5-PE、CD13- PE、CD14-PE、CD19-PE、CD22-PE、CD33-PE、CD34-PE、Anti-HLA-DR-PE。

1.3.2 三色熒光標(biāo)記技術(shù) 標(biāo)本準(zhǔn)備同上述，分別加入6種三色熒光抗體組合：①IgG1-FITC+IgG1-PE+CD45-Cy5；② CD10-FITC+CD19-PE+CD45-Cy5；③CD5-FITC+CD22-PE+CD45-Cy5；④CD14-FITC+CD34-PE+CD45-Cy5；⑤CD3-FITC+CD38-PE+CD45-Cy5；⑥CD7-FITC+CD13-PE+CD45-Cy5（均購自美國Pharmingen公司）。選擇抗體T系特異性抗體CD3、CD5和CD7；B系CD10、CD19和CD22；髓系特異性抗體CD13、CD14、CD34和CD38。以上標(biāo)本均經(jīng)流式細(xì)胞儀分析。

2 結(jié)果

2.1 單色熒光標(biāo)記技術(shù)檢測結(jié)果分析

60例標(biāo)本經(jīng)單色熒光標(biāo)記技術(shù)檢測，T細(xì)胞免疫表型急性淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）27例，急性B細(xì)胞型淋巴細(xì)胞性白血?。˙-ALL）11例，急性非淋巴細(xì)胞白血?。ˋNLL）22例；細(xì)胞分群問題致診斷不明確11例（18.3%）；初始診斷與最終診斷不符3例（5.0%），其中，2例為單純髓系白血病，1例為單純淋系白血病。

2.2 三色熒光標(biāo)記技術(shù)檢測結(jié)果分析

根據(jù)CD45/SSC二維分布圖，計(jì)算淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞及幼稚細(xì)胞各群細(xì)胞比例，使用各抗體組合可把90%的白血病分為ALL和ANLL，并能對B-ALL、T-ALL、AML-M1/M2和 AML-M3做出正確診斷。

3 討論

白血病臨床并不少見，有異質(zhì)性大、分型診斷復(fù)雜的特點(diǎn)，導(dǎo)致臨床診斷難度較大[3-4]。白血病對患者影響巨大，嚴(yán)重威脅生命安全，不同分型診斷、治療及預(yù)后差異較大，因此，正確的診斷對治療具有關(guān)鍵作用。相關(guān)研究表明，三色熒光標(biāo)記抗體組合對診斷白血病具有重要意義，采取CD45/SSC設(shè)門法，經(jīng)多參數(shù)分析，可對不同類型不同分型的急性白血病進(jìn)行明確診斷，尤其是AML-M4/M5診斷率較高。以往，臨床診斷多采取CD14是否增高而進(jìn)行判斷，研究發(fā)現(xiàn)此類方法漏診較高。此可能與CD14不見于幼稚細(xì)胞，故對幼稚細(xì)胞診斷漏診率較低有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)幼稚細(xì)胞均表達(dá)CD34、CD117及HLA-DR，且多伴有CD13、CD33陽性表達(dá)[5]，本研究所采取三色熒光標(biāo)記法進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測可增加診斷正確率，三色熒光標(biāo)記可應(yīng)用較少的抗體組合對白血病血液標(biāo)本進(jìn)行多參數(shù)分析，對白血病細(xì)胞進(jìn)行正確免疫分型，盡可能為臨床中分型提供可靠依據(jù)，具有重要臨床價(jià) 值。

[1]劉艷榮,于弘,常艷.探討流式細(xì)胞儀檢測抗原的方法及其在白血病免疫分型中的意義[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2002,21(10):17-21.

[2]鄭列琳,劉征輝,陸廷偉.105例成人急性白血病形態(tài)學(xué)與免疫學(xué)分型的比較研究[J].中華血液學(xué)雜志,1996,17(4):206-207.

[3]劉艷榮,于弘,常艷,等.四色熒光標(biāo)記抗體在白血病免疫分型中的應(yīng)用及意義[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2002,21(10):423-427.

[4]Ichinohasama R,Decoteau JF,Myers J,et al.Three-color flow cytometry in the diagnosis ofmalignant lymphoma based on the comparative cell morphology of lymphoma cells and reactive lymphocytes[J].Leukemia,1997,11(11):1891-1903.

[5]胡永軍,金恂,張曉飛.流式細(xì)胞免疫表型分析在惡性淋巴瘤診斷中的應(yīng)用研究[J].交通醫(yī)學(xué),2011,25(5):443-446.