秦皇島褐潮期超微型浮游生物豐度及多樣性研究?

馬　玉, 汪　岷,2??, 夏　駿, 宮　政, 宋　雪, 劉　倩, 李　巖, 姜　勇, 邵紅兵，張耀元

(1.中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與基因資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266003;2.中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所,山東 青島 266003)

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秦皇島褐潮期超微型浮游生物豐度及多樣性研究?

馬玉1, 汪岷1,2??, 夏駿1, 宮政1, 宋雪1, 劉倩1, 李巖1, 姜勇1, 邵紅兵1，張耀元1

(1.中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與基因資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266003;2.中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所,山東 青島 266003)

摘要:秦皇島作為中國北方重要水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，年年爆發(fā)褐潮，對當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境造成巨大影響。針對微微型真核浮游生物、浮游病毒和浮游細(xì)菌三大類群，進(jìn)行了褐潮前中2個(gè)時(shí)期豐度和群落結(jié)構(gòu)及其主要影響因素的分析。本研究利用流式細(xì)胞儀技術(shù)對褐潮前期和褐潮中期秦皇島近岸海域微微型真核浮游生物、浮游細(xì)菌和浮游病毒的豐度分布特征進(jìn)行了研究；利用病毒宏基因組技術(shù)、18S rDNA V9區(qū)和16S rDNA V4～V5高通量測序技術(shù)對超微型浮游生物各個(gè)類群進(jìn)行多樣性研究。研究發(fā)現(xiàn)，褐潮中期微微型真核浮游生物豐度平均值為27.50×103個(gè)/mL，浮游細(xì)菌豐度平均值為1.97×105個(gè)/mL，浮游病毒豐度平均值為9.65×105VLP/mL。褐潮中期藻類DNA病毒含量提高(20.30%)；不等鞭毛蟲門為微微型真核浮游植物主要優(yōu)勢類群；變形菌門為浮游細(xì)菌主要優(yōu)勢類群。海水生態(tài)系統(tǒng)中超微型浮游生物的多樣性及豐度對褐潮的發(fā)生具有較高敏感性，未來，針對海洋超微型浮游生物的研究，對進(jìn)一步了解褐潮機(jī)制和尋求褐潮消解方法提供了新的角度和思路。

關(guān)鍵詞:浮游病毒； 微微型真核浮游生物； 浮游細(xì)菌； 豐度； 多樣性

引用格式：馬玉, 汪岷, 夏駿, 等. 秦皇島褐潮期超微型浮游生物豐度及多樣性研究[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 46(6): 142-150.

MA Yu, WANG Min, XIA Jun, et al. Studies on abundance and diversity of microplankton during brown tide around Qinhuangdao area[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(6): 142-150.

秦皇島市位于河北省東部，瀕臨渤海，境內(nèi)有洋河、戴河、新開河等河流經(jīng)此入海，同時(shí)也是中國著名的水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)，扇貝養(yǎng)殖尤為聞名。秦皇島扇貝養(yǎng)殖區(qū)作為中國北方重要的扇貝養(yǎng)殖區(qū)之一，自1990年代至今，養(yǎng)殖面積已經(jīng)超過4萬km2。

超微型浮游生物包括浮游病毒、微微型真核浮游生物和浮游細(xì)菌等，是海洋中粒徑小于5 μm的浮游生物的總稱[1-2]。浮游病毒作為海洋中數(shù)量和物種最豐富的類群，具有控制宿主種群大小和遺傳結(jié)構(gòu)、參與影響物質(zhì)循環(huán)的重要生態(tài)功能，而微微型真核藻類以及浮游細(xì)菌作為浮游病毒的宿主，其多樣性和豐度也往往與病毒表現(xiàn)出一定的相關(guān)性[3]。微微型真核浮游生物(粒徑<5 μm)在海洋真光層中數(shù)量眾多[4]，具有極強(qiáng)的光合作用能力，一直以來都是海洋物質(zhì)循環(huán)和能量流動的主要推動力量之一[5]。褐潮是一種水體水華爆發(fā)引起的海水顏色變?yōu)榧t褐色的現(xiàn)象[6]， 1985年首現(xiàn)于美國東海岸，并于近年來在世界各地逐漸擴(kuò)展[7-11]。據(jù)國家海洋局統(tǒng)計(jì)公布(http://www.soa.gov.cn/)，秦皇島海域的主要褐潮藻為抑食金球藻，其濃度最高可達(dá)106個(gè)/mL[4]，對養(yǎng)殖水體中的微微型真核生物和浮游細(xì)菌群落造成了巨大影響。超微型浮游生物作為海洋微食物環(huán)中的重要組成部分，與海洋物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換過程有著密切聯(lián)系，對海洋生態(tài)環(huán)境、能量流動及海洋生物群落結(jié)構(gòu)都起著極為重要的作用[12-13]。超微型浮游生物的時(shí)空分布和群落組成結(jié)構(gòu)對于當(dāng)?shù)睾Ｓ蛩w質(zhì)量和水體生態(tài)環(huán)境檢測具有重要的指示和檢測作用[14-16]。目前為止，針對秦皇島海域褐潮期間生物群落的研究主要針對微型浮游生物，超微型浮游生物的相關(guān)研究仍較缺乏[30]。

本文針對秦皇島海域褐潮期間(2012年4月，褐潮前期；2013年6月，褐潮中期)超微型浮游生物的分布、群落組成結(jié)構(gòu)及影響因素進(jìn)行了調(diào)查研究。本研究擬通過研究和分析該海域超微型浮游生物的時(shí)間變化，在流式細(xì)胞儀技術(shù)和高通量測序的基礎(chǔ)上，針對微微型真核浮游生物、浮游病毒和浮游細(xì)菌三大類群，進(jìn)行了褐潮前中2個(gè)時(shí)期豐度和群落結(jié)構(gòu)及其主要影響因素的分析，以期為褐潮期生物多樣性變化和影響，和合理開發(fā)利用當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)提供基礎(chǔ)資料，為海洋經(jīng)濟(jì)生態(tài)可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1站位設(shè)定

秦皇島市位于河北省，境內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展使其近海海域富營養(yǎng)化嚴(yán)重，年年爆發(fā)褐潮(http://www.soa.gov.cn/)。綜合考慮當(dāng)?shù)厮奶攸c(diǎn)及養(yǎng)殖區(qū)域分布狀況，在遵循代表性的基礎(chǔ)上，于2012年4月(褐潮前期)和2013年6月(褐潮期)選取了S2、S6、F2、F6 4個(gè)站點(diǎn)進(jìn)行水樣采集，各站點(diǎn)分布見圖1。

2樣品采集及分析方法

2.1 樣品采集

使用Niskin采水器采集表層海水。取3mL海水用多聚甲醛進(jìn)行固定(終濃度1%)，用于超微型真核浮游生物的分析研究；取5mL海水用戊二醛進(jìn)行固定(終濃度0.5%)，用于浮游病毒及浮游細(xì)菌的分析研究。以上樣品均經(jīng)液氮速凍，-80℃保存，用于豐度研究。

使用Niskin采水器采集表層海水，每站采水30L，4個(gè)站位共120L。使用篩絹過濾除去水中大型藻及雜質(zhì)，經(jīng)3、0.22μm濾膜過濾，保留過濾液。過濾液經(jīng)過中型、小型切向流(切向流超濾系統(tǒng)，Millipore)濃縮至10mL，液氮速凍，-80℃保存，用于病毒多樣性研究。每站分別取1L海水，使用篩絹過濾除去水中大型藻和雜質(zhì)，經(jīng)3、0.22μm濾膜(混合纖維素酯濾膜，Millipore)過濾，保留0.22μm濾膜，液氮速凍，-80℃保存，用于微微型真核生物和浮游細(xì)菌的多樣性研究。

2.2 分析方法

2.2.1 超微型浮游生物豐度檢測樣品從-80℃冰箱中取出，37℃水浴解凍。取1mL微微型真核浮游生物樣品，加入10mL內(nèi)標(biāo)熒光微球，混勻；分別取495μL病毒、浮游細(xì)菌樣品，加入5μL SYBR Green-I染色劑(Molecular Probes，終濃度10-4)，避光80℃水浴染色15min，加入1μm內(nèi)標(biāo)熒光微球。上述處理后樣品均使用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter FC500-MPL；FSC：115.0，SSC：209.0)分別測定其豐度。

2.2.2 超微型浮游生物多樣性檢測

2.2.2.1 超微型浮游生物DNA提取微微型真核浮游生物、浮游細(xì)菌的DNA提取采用傳統(tǒng)酚氯仿抽提法。病毒濃縮液中加入氯化鈉和PEG8000于4℃環(huán)境中避光沉淀24h后，經(jīng)超速冷凍離心機(jī)離心后去除上清液，加入SM buffer及氯化鉀溶液吹溶懸浮沉淀，冰浴30min后冷凍離心，保留上清液，然后采用傳統(tǒng)酚氯仿法進(jìn)行抽提。

2.2.2.2 微微型真核生物多樣性檢測微微型真核生物DNA使用引物1380F/1510R[5]進(jìn)行18S rDNA PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)QIAquick試劑盒純化后進(jìn)行末端加A實(shí)驗(yàn)；使用引物Primer1/Primer2[5]進(jìn)行18S rDNA V9區(qū)的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后送至測序公司進(jìn)行Illumina Hiseq高通量測序。

2.2.2.3 浮游病毒多樣性檢測浮游病毒DNA送至測序公司進(jìn)行拼接測序，首先針對DNA樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測，質(zhì)量合格的DNA樣品依據(jù)Illumia標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行建庫測序。測序完成后，利用SOAPdenovo(version 1.06)[17-19]對測序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝，得到contig數(shù)據(jù)后，使用MetaGenMark[20]預(yù)測得到ORF(Open Reading Frame，開放閱讀框)序列。將得到的contigs和ORFs序列分別進(jìn)行Blastx、Blastp[21-22]與Camera病毒數(shù)據(jù)庫[23]比對(e值<1×e-10)，得到物種信息。

2.2.2.4 浮游細(xì)菌多樣性檢測浮游細(xì)菌基因組送至測序公司使用Illumina Miseq對16S rDNA V4～V5區(qū)進(jìn)行高通量測序。

2.2.3 環(huán)境因子分析測定秦皇島市近岸養(yǎng)殖區(qū)水體鹽度、營養(yǎng)鹽等數(shù)據(jù)由本課題化學(xué)組提供數(shù)據(jù)，非養(yǎng)殖區(qū)水體鹽度、營養(yǎng)鹽等數(shù)據(jù)由船載SBE19-CTD測得。

2.2.4 數(shù)據(jù)分析用SPSS軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本均值的差異性檢驗(yàn)。

3結(jié)果

3.1 褐潮期環(huán)境因子變化

對比可得，褐潮期SiO2、PO4-P和NO3-N含量提高。其中，SiO2和NO3-N提高最多，均提高3倍以上，PO4-P僅有微小提升。NH4-N含量降低，從2.869 μmol/L落至1.958 μmol/L。NO2-N含量水平微降，但變化不大(見表1)。

3.2 超微型浮游生物褐潮前中期豐度變化

3.2.1 微微型真核浮游生物褐潮前中期豐度變化褐潮中期微微型真核浮游生物豐度高于褐潮前期，褐潮前期豐度為0.80×103～3.97×103個(gè)/mL之間，平均值為2.00×103個(gè)/mL；褐潮中期豐度為4.80×103～60.48×103個(gè)/mL之間，平均值為27.50×103個(gè)/mL。微微型真核浮游生物豐度峰值出現(xiàn)在褐潮中期，且高于褐潮前期(見圖2)。

3.2.2 浮游病毒褐潮前中期豐度變化褐潮中期浮游病毒豐度略高于褐潮前期(見圖3)。褐潮前期豐度為6.65×105～8.59×105VLP/mL之間，平均值為7.98×105VLP/mL；褐潮中期豐度為6.10×105～11.48×105VLP/mL之間，平均值為9.65×105VLP/mL。

3.2.3 浮游細(xì)菌褐潮前后豐度變化褐潮中期浮游細(xì)菌豐度高于褐潮前期，褐潮前期豐度為0.80×105～1.92×105個(gè)/mL之間，平均值為1.26×105個(gè)/mL；褐潮中期豐度為1.46×105～2.44×105個(gè)/mL之間，平均值為1.97×105個(gè)/mL。浮游細(xì)菌豐度峰值出現(xiàn)在褐潮中期，且高于其他季節(jié)(見圖4)。

3.3超微型浮游生物褐潮前中期多樣性分析

3.3.1 超微型真核浮游生物多樣性分析SAR超類群主要包括囊泡蟲類、不等鞭毛類和有孔蟲。分析可得，褐潮前中期秦皇島近海水域微微型真核浮游生物多樣性變化不大，SAR超類群為主要組成部分(見圖5)。褐潮前期SAR超類群多樣性高于褐潮中期，分別為931和683種。SAR超類群多樣性以囊泡蟲類為主，褐潮前期788種，褐潮中期594種。其中，囊泡蟲類在褐潮前中皆為優(yōu)勢類群，褐潮發(fā)生期，纖毛蟲門、雙鞭毛蟲門、頂復(fù)門物種多樣性均高于褐潮前期(見圖6)。

3.3.2 浮游病毒多樣性分析

3.3.2.1 宏基因組測序結(jié)果對4個(gè)站位2個(gè)季節(jié)的浮游病毒樣品進(jìn)行宏基因組測序，在利用SOAPdenovo(version 1.06)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝拼接后，使用公司內(nèi)部程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化統(tǒng)計(jì)，組裝結(jié)果如表2所示。將組裝好的contigs使用MetaGeneMark(MGM，http://exon.gatech.edu/GeneMark/metagenome/Prediction)進(jìn)行開放閱讀框(ORF，open reading frame)預(yù)測，然后進(jìn)行Blastx和Blastp程序與camera病毒數(shù)據(jù)庫比對(e值<1×e-10), 最后獲得病毒的ORFs為2 618和2 774個(gè)。

3.3.2.2 浮游病毒多樣性褐潮對秦皇島近岸水體病毒多樣性影響十分顯著(見圖7)。分析已知病毒多樣性數(shù)可得，褐潮前期共有1 529種已知病毒，褐潮中期共有2 616種已知病毒。

褐潮前期，浮游病毒以有尾噬菌體目(Caudovirales)為主要組成部分，占比67.69%，有尾噬菌體以肌尾噬菌體科(Myoviridae)為主(25.77%)；藻類DNA病毒(Phycodnaviridae)占比1.57%。褐潮中期，浮游病毒以有尾噬菌體目(Caudovirales)占比下降至47.44%，有尾噬菌體以肌尾噬菌體科(Myoviridae)為主(24.47%)；藻類DNA病毒(Phycodnaviridae)占比大幅提高，達(dá)20.30%。

Note: ①Sample names; ②Contig; ③Length; ④Max length

3.3.3 浮游細(xì)菌多樣性分析對養(yǎng)殖區(qū)褐潮期浮游細(xì)菌的16S rDNA V4～V5區(qū)測序結(jié)果進(jìn)行分析。得到S2、S6、C2、C6、F2、F6樣品OTUs的個(gè)數(shù)分別是749和927。BLAST比對之后發(fā)現(xiàn)，所得OTU主要為藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)8個(gè)門類。其中，褐潮前期主要為5個(gè)類群，分別為放線菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻門、疣微菌門和變形菌門；褐潮中期只要為8個(gè)類群，分別為放線菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻門、疣微菌門、厚壁菌門、黏膠球形菌門、浮霉菌門和變形菌門(見圖8)。其中，變形菌門在褐潮前后均為最優(yōu)勢類群(見圖9)。

4討論

4.1 超微型浮游生物褐潮前中期豐度變化

微微型真核浮游生物包括微微型浮游植物和微微型浮游動物。其中，微微型浮游植物多樣性豐富，是海洋初級生產(chǎn)力的主要組成部分，存在多種褐潮藻類[16,24]。本次研究檢測發(fā)現(xiàn)，微微型真核浮游生物在褐潮中期的豐度高于褐潮前期，這與國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果相吻合[26]。推測其是由于大量微型浮游植物被貝類攝食，微微型浮游植物獲得更大生存空間導(dǎo)致的；同時(shí)由于養(yǎng)殖活動投放大量營養(yǎng)物質(zhì)，水體富營養(yǎng)化嚴(yán)重，又促進(jìn)了微微型真核生物的生長。伴隨褐潮發(fā)生，SiO2、PO4-P和NO3-N濃度增加，NH4-N濃度降低，可能是微微型真核浮游藻類繁殖導(dǎo)致大量營養(yǎng)鹽消耗造成的。

浮游病毒包括細(xì)菌病毒和藻類病毒，是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對海洋物質(zhì)循環(huán)和能量流動及生物群落調(diào)控都具有重要意義[27]。本次研究發(fā)現(xiàn)，褐潮中期浮游病毒豐度高于褐潮前期。褐潮前期，微微型真核浮游生物和浮游細(xì)菌由于水體富營養(yǎng)化開始大量繁殖，帶動了以其為宿主的浮游病毒的大量增殖，在褐潮中期達(dá)到峰值。浮游病毒作為海洋生態(tài)環(huán)境的重要指示物種，對其宿主及水體環(huán)境的變化具有較高敏感性，豐度隨著宿主豐度升高而升高。

作為海洋生態(tài)系統(tǒng)的分解者和二次生產(chǎn)者，浮游細(xì)菌在海洋生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)、能量流動以及微食物環(huán)中扮演了十分重要的角色。褐潮中期，由于當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖活動的開展使得水體中有機(jī)物及營養(yǎng)鹽濃度大量提高，為浮游細(xì)菌的生長繁殖提供了更有力的生態(tài)環(huán)境，浮游細(xì)菌豐度高于褐潮前期，與國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果吻合[28-29]。

4.2 超微型浮游生物褐潮前后物種群落結(jié)構(gòu)變化

4.2.1 微微型真核生物褐潮前后物種群落結(jié)構(gòu)變化秦皇島近海海域褐潮爆發(fā)始于2010年，最初在山海關(guān)養(yǎng)殖區(qū)海域被觀察到，隨后逐步擴(kuò)大覆蓋沿海各地。本文將真核浮游生物歸類為4大類群：SAR超類群、變形蟲、后鞭毛生物和泛植物；其中，SAR超類群主要包括囊泡蟲類、不等鞭毛類和有孔蟲，后鞭毛生物主要包括菌種總界和動物總界，泛植物則主要包括綠藻、紅棗、灰胞藻等[15]。前人研究發(fā)現(xiàn)，秦皇島養(yǎng)殖區(qū)褐潮藻的優(yōu)勢種為抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)[25]，屬于不等鞭毛蟲門，曾在美國東海岸大量爆發(fā)并導(dǎo)致其養(yǎng)殖業(yè)絕跡，對扇貝有嚴(yán)重抑食的作用，嚴(yán)重危害秦皇島水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的生存。微微型真核生物的群落多樣性伴隨褐潮頻繁爆發(fā)而降低，使得褐潮中期微微型真核生物的多樣性低于褐潮前期[30]。經(jīng)多樣性檢測發(fā)現(xiàn)，褐潮中期秦皇島近海海域不等鞭毛蟲門多樣性高于褐潮前期，且在褐潮發(fā)生期檢測到抑食金球藻的存在，與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果相吻合。目前，抑食金球藻僅在秦皇島海域被發(fā)現(xiàn)，推測其是隨輪船壓艙水而來的外來物種[31-33]。其它各類微微型真核藻類在秦皇島近海海域中分布較少，受褐潮影響較小，因此褐潮前后物種組成變化不大。此外，SAR超類群中囊泡蟲類中的纖毛蟲門在褐潮前中物種多樣性均較高。褐潮期水體嚴(yán)重富營養(yǎng)化，纖毛蟲作為微食物環(huán)的重要組成部分，其存在可以加速水體內(nèi)有機(jī)磷的物質(zhì)循環(huán)，促進(jìn)藻類等的生長等[34-35]；纖毛蟲門在褐潮中大量存在，側(cè)面驗(yàn)證了其在水體物質(zhì)循環(huán)中的作用。

4.2.2 浮游病毒褐潮前后物種群落結(jié)構(gòu)變化由于病毒缺乏穩(wěn)定的保守序列作為通用標(biāo)記基因進(jìn)行分析，一般的測序方法很難完整測量環(huán)境中病毒的序列，因此病毒宏基因組學(xué)作為一種對環(huán)境病毒群落基因組進(jìn)行測序和分析的方法，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛得到了接受[36-38]。由于目前國際上對海洋病毒研究的相對匱乏，大部分海洋病毒的序列都是未知的，病毒的多樣性樣品并沒有得到充分的采集[36]。由于病毒宏基因組學(xué)直接針對環(huán)境病毒群落基因進(jìn)行測序分析的特性，很好的保證了環(huán)境中未識別病毒序列的保存于測量，進(jìn)而保證了數(shù)據(jù)的可信度。由于病毒多樣性庫數(shù)據(jù)的缺乏，本文使用宏基因組技術(shù)對褐潮期浮游病毒多樣性進(jìn)行研究，其中存有大量未知病毒種，這也說明了海洋病毒多樣性工作的待完善與大量的未知浮游病毒的存在[39-40]。

分析發(fā)現(xiàn)，褐潮中期浮游病毒的多樣性高于褐潮前期。褐潮爆發(fā)時(shí)，微微型真核浮游生物和浮游細(xì)菌由于優(yōu)勢種的大量增殖導(dǎo)致其物種多樣性降低，對浮游病毒的抵抗能力減弱，導(dǎo)致褐潮中期浮游病毒多樣性增加。褐潮前期，噬菌體為浮游病毒的主要組成部分。這是由于褐潮前期秦皇島近海水體中浮游細(xì)菌含量較高，變形菌門和擬桿菌門占浮游細(xì)菌總量高達(dá)95%以上，為肌尾噬菌體科病毒的侵染、增殖提供了有利環(huán)境。伴隨褐潮發(fā)生，以抑食金球藻為代表的微微型浮游植物急速增殖，擠壓了浮游細(xì)菌的生存空間，成為近岸水體中超微型浮游生物的主要類群。超微型真核浮游植物的大量增加為噬藻體的增殖提供了基礎(chǔ)，藻類DNA病毒的含量大幅提升，成為最優(yōu)勢病毒類群，從側(cè)面指示和驗(yàn)證了褐潮期水體生物群落的更迭。

4.2.3 浮游細(xì)菌褐潮前后物種群落結(jié)構(gòu)變化對比褐潮前期和褐潮中期的群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，褐潮中期浮游細(xì)菌的群落多樣性最高。對比環(huán)境數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，褐潮中期秦皇島近海的有機(jī)物濃度顯著高于褐潮前期(P<0.01)。伴隨褐潮爆發(fā)，大量褐潮藻的繁殖和病毒導(dǎo)致的消亡裂解產(chǎn)生大量有機(jī)物，帶動了浮游細(xì)菌的大量增殖，浮游細(xì)菌物種多樣性升高。本文在秦皇島近海檢測到8個(gè)門類的浮游細(xì)菌，與目前國內(nèi)相關(guān)研究相符合[41-44]，其中變形菌門為海洋浮游細(xì)菌的絕對優(yōu)勢類群。經(jīng)檢測，秦皇島近海海域變形菌門中第一優(yōu)勢群是γ-變形菌綱，其次為α-變形菌綱，與其他海域結(jié)果相類似[41]。γ-變形菌綱是一種富營養(yǎng)海域的優(yōu)勢菌，可以利用不同類型、不同濃度的碳源迅速繁殖[41-44]。褐潮中期變形菌門的物種多樣性較褐潮前期略高，是由于養(yǎng)殖活動導(dǎo)致的有機(jī)物濃度上升為變形菌門的生長繁殖提供大量的碳源，利于變形菌門的大量繁殖，因此變形菌門的相對豐度升高。細(xì)菌多樣性伴隨著氮鹽和磷酸鹽濃度的上升而增加，說明褐潮期浮游細(xì)菌參與了物質(zhì)循環(huán)和能量流動。伴隨褐潮發(fā)生，大量褐潮藻在增殖的同時(shí)其本身也會大量消亡，水體中有機(jī)物含量激增，大量的異養(yǎng)細(xì)菌參與物質(zhì)循環(huán)和能量流動。變形菌門中的γ-變形菌綱和α-變形菌綱細(xì)菌具有較強(qiáng)的碳源利用能力，符合褐潮發(fā)生時(shí)的環(huán)境需要，因此成為了褐潮期養(yǎng)殖區(qū)海域細(xì)菌群落的優(yōu)勢類群。綜上可知，浮游細(xì)菌在褐潮期通過對有機(jī)物的分解與二次利用，對褐潮生態(tài)環(huán)境進(jìn)行了代償與修復(fù)。

綜上可知，海水生態(tài)系統(tǒng)中超微型浮游生物的多樣性及豐度對褐潮的發(fā)生具有較高敏感性。本文選取了兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，對比了歷經(jīng)褐潮后水體中超微型浮游生物群落的變化，針對海洋超微型浮游生物的研究，對進(jìn)一步了解褐潮機(jī)制和尋求褐潮消解方法提供了新的角度和思路。未來，將在此基礎(chǔ)上持續(xù)對褐潮進(jìn)行跟蹤采樣，以期獲得更加詳實(shí)豐富的數(shù)據(jù)。

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責(zé)任編輯高蓓

Studies on Abundance and Diversity of Microplankton During Brown Tide Around Qinhuangdao Area

MA Yu1, WANG Min1, XIA Jun1, GONG Zheng1, SONG Xue1,LIU Qian1, LI Yan1, JIANG Yong1, SHAO Hong-Bing1， Zhang Yao-Yuan1

(1.The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2.Institute of Evolution and Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Abstract:Microplankton, which is under 5μm and including picoeukaryotes, marine bacteria, and virioplankton, plays an important role in marine ecosystem and is thought to be a robust indicator for bio-assessment. Qinhuangdao is one of the biggest scallop cultivation area in northern China with brown tide blooming every year, and local environment has been significantly affected by the aquaculture activities. In Qinhuangdao scallop cultivation area (QSCA), investigation on microplankton is still scant, especially information about their temporal variation and distribution along brown tides still need pay more attentions. To better understand the environmental influences of brown tide, microplankton communities were investigated in two time spots (June and April) in QSCA. In present study, the abundance of microplankton has been revealed by flow cytometry technique and the results show that the microplankton abundance varied along the blooming and was higher during tide than that of before tide, which was 27.50×103cell/mL for picoeukaryotes, 1.97×105cell/mL for marine becteria, and 9.65×105VLP/mL for virioplankton on average, which exhibits the obvious response of microplankton to the brown tide. Meanwhile, the diversity of microplankton has been studied by metagenomics (for virioplankton) and by high-through sequencing technology (18S rDNA V9 for picoeukaryotes; 16S rDNA V4～V5 for bacteria). During the study period, the species from Myoviridae are the main contributors to the virioplankton all the time. Percentage of speceies from Caudovirales decreased a lot (67.69% before the tide, 47.44% during the tide), while those of Phycodnaviridae rose up clearly (1.57% before the tide, 20.30% during the tide). Four super groups were indentified from picoeukaryotes, which is SAR, Plantae, Amoebozoa, and Opisthokonta. In both samples, SAR (including alveolates, heterokonta, and ciliates, etc.) were the dominate super group of picoeukaryotes but their genetic diversity decrease clearly along the brown tide (931 species before the tide, 683 species during the tide), however the diversity of Heterokonta was increased andAureococcusanophagefferenswas detected. Besides, ciliates, as an important element of microbial food loop, showed a huge abundance in the study area along the brown tide. During the research, the diversity of marine bacteria increase dramatically and the Proteobacteria was the dominant component, in which γ proteobacteria and α proteobacteria contributed most. These results suggest that there was a clear temporal distribution pattern in the microplankton community in QSCA. And, present study only supply a basic and detailed data with two time spots and fixed area. For better understanding the variation of microplankton community along brown tide in aquaculture area, further studies on extend time period and lager scales are welcome and necessary to verify our findings.

Key words:virioplankton; picoeukaryotes; marine bacteria; abundance; diversity

基金項(xiàng)目：? 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31500339; 41076088); 中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2015M570612)；中國海洋大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(201562018)；國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)基金項(xiàng)目(201205031)資助

收稿日期：2016-01-11；

修訂日期：2016-02-16

作者簡介：馬玉(1991-)，女，碩士生。E-mail：994458084@qq.com ??通訊作者： E-mail：mingwang@ouc.edu.cn

中圖法分類號:Q14

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號：1672-5174(2016)06-142-09

DOI:10.16441/j.cnki.hdxb.20150426

Supported by the National Nature Science Foundation of China(31500339; 41076088); China Postdoctoral Science Foundation(2015M570612)；Fundamental Research Funds for the Central Universities of Ocean University of China(201562018)；Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean (201205031)