多發(fā)性硬化及EAE動物模型相關(guān)信號通路研究進展

孫哲　郭力　孔鵬

多發(fā)性硬化及EAE動物模型相關(guān)信號通路研究進展

孫哲郭力孔鵬

050000河北省石家莊市河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 神經(jīng)病學河北省重點實驗室

摘要:多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特點的慢性炎性自身免疫性疾病。CD4+T淋巴細胞介導的對自身髓鞘抗原產(chǎn)生的免疫應答為其可能的發(fā)病機制。目前公認小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)為研究MS的動物模型。目前關(guān)于MS的治療尚缺乏有效方法，近年研究發(fā)現(xiàn)多種信號通路在MS/EAE中發(fā)揮調(diào)控作用，通過研究MS/EAE中的相關(guān)信號通路及相關(guān)通路靶點藥物的干預效果，將對MS的治療起到啟示性作用。本文就有關(guān)MS/EAE相關(guān)信號通路的研究進展做一綜述。

關(guān)鍵詞:多發(fā)性硬化；腦脊髓炎，自身免疫性，實驗性；MAP激酶信號系統(tǒng)；信號傳導

CD4+T淋巴細胞介導的對自身髓鞘抗原產(chǎn)生的免疫應答為多發(fā)性硬化(MS)及小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的可能發(fā)病機制，其中輔助性T細胞(helper T cells，Th)1和Th17尤為重要。Th1細胞分泌干擾素γ(gamma interferon，IFN-γ)，Th17細胞分泌白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)，這些細胞和炎性反應因子滲入中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS), 破壞血-腦脊液屏障，導致大量的免疫細胞被募集到CNS。這些激活的免疫細胞產(chǎn)生大量的IL-12、 IL-6、IL-17、IL-21和IL-23等炎性反應因子，破壞神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞，造成局部脫髓鞘和軸索損傷[1]。MS/EAE的發(fā)病與一些信號通路密切相關(guān)，其中絲裂元活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路、蛋白酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAKs/STATs)通路與細胞分化密切相關(guān)；NF-E2相關(guān)因子/抗氧化反應原件(NF-E2-related factor 2/anti-oxidant response element，Nrf2/ARE)通路與減少氧化應激有關(guān)；Toll樣受體/核因子κB(toll like receptors/nucleus-κB，TLRs/NF-κB)和腺苷酸活化激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)通路調(diào)節(jié)一系列炎性反應因子的表達；Rho/Rho激酶(Rho/Rho associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK)通路可以抑制軸突再生，增加血-腦脊液屏障通透性；自噬相關(guān)通路通過調(diào)節(jié)細胞自噬影響病情嚴重程度。以相關(guān)信號通路為靶點治療對緩解MS/EAE病情有重要意義。

1MAPK通路

MAPK級聯(lián)反應是細胞內(nèi)的重要信號傳導系統(tǒng)，可引起特異基因表達的開啟或關(guān)閉。該信號通路主要包括p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，c-JNK)和細胞外信號調(diào)節(jié)酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)。其中p38 MAPK通路在Th17細胞分泌IL-17過程中起到重要作用；JNK通路介導腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)誘導成人少突膠質(zhì)細胞死亡，影響初始T細胞向Th1細胞分化；ERK通路在誘導型調(diào)節(jié)性T細胞(induced regulatory T cells，iTregs)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

1.1p38 MAPK信號通路 p38 MAPK被上游MAPK激酶(MAPK kinases，MKKs)3和MKK6激活，在巨噬細胞和樹突細胞中通過反轉(zhuǎn)錄后機制和轉(zhuǎn)錄機制調(diào)節(jié)炎性反應因子(如TNF-α、IL-6等)[2]。另外，p38 MAPK 信號通路在調(diào)控Th17分化為IL-17的過程中起重要作用。p38存在四種同分異構(gòu)體：p38α、p38β、p38γ、p38 δ，一項微陣列研究表明，MAPK14(編碼p38α)的表達在MS的CNS損傷部位提高了5倍[3]。另外，有研究結(jié)果顯示在小鼠EAE模型炎性反應細胞和CNS膠質(zhì)細胞中p38 MAPK磷酸化水平增加[1]；而應用p38 MAPK抑制劑的小鼠和基因敲除p38α的小鼠Th17細胞功能受損，EAE嚴重程度降低[4-5]。相反，在增加p38 MAPK活性的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，T細胞連續(xù)特異性表達MKK6，促進了IL-17的分泌和加重了EAE的嚴重程度[4]。綜上，p38 MAPK信號通路在MS/EAE 的致病中發(fā)揮了重要作用。

目前已發(fā)現(xiàn)一類吡咯咪唑類復合物可以結(jié)合于p38 的Thr175 位點, 可與ATP競爭性結(jié)合p38蛋白, 從而特異性抑制p38 MAPK途徑。

1.2JNK信號通路 經(jīng)炎性反應因子刺激后，JNK激酶(JNK kinase，JNKK)1/MKK4或JNKK2/MKK7 介導JNK上Thr183和Tyr185磷酸化，使JNK完全活化為磷酸化的JNK(phosphor-JNK，p-JNK)并具有酶催化活性[6]。陳瑜等[7]研究發(fā)現(xiàn)，EAE小鼠與正常小鼠相比，腦組織中p-JNK表達量明顯增加，并且髓鞘脫失越嚴重，p-JNK表達量越大。這可能與JNK激活介導的TNF誘導少突膠質(zhì)細胞死亡有關(guān)[8]。另外，使用JNK抑制劑可以阻礙初始T細胞向Th1細胞的分化，表明c-JNK 調(diào)節(jié)前體細胞向Th1 和Th2 效應細胞的分化過程。

Joh等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在雄性癌癥小鼠腹膜巨噬細胞體外培養(yǎng)中，常春藤苷可通過抑制JNK通路減少NO、TNF-α和COX-2的表達。

1.3RAS/ERK通路 iTregs和Th17均為CD4+的輔助性T細胞，iTreg對炎性反應有抑制作用，而Th17則可以促進炎性反應。ERK在iTreg的發(fā)育過程中發(fā)揮主要作用。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)刺激下的CD4+T細胞可明顯增加ERK的活性，加入ERK抑制劑可明顯減弱EAE小鼠體內(nèi)TGF-β抗原標記的CD4+T細胞Foxp3 的表達，但對Th17的分化影響不明顯。這也解釋了為何ERK敲除小鼠EAE易感性更高[10]。更多的研究發(fā)現(xiàn)RAS阻斷劑可以增加小鼠脾細胞來源的iTreg數(shù)量及增強其功能[11]。

2JAK/STAT通路

JAKs是 STATs信號轉(zhuǎn)導通路上游激酶，當其活化后誘導胞漿中單體STATs分子磷酸化，形成STATs二聚體，并轉(zhuǎn)移到核內(nèi)調(diào)控基因表達。此通路在CD4+T細胞分化過程中起重要作用。IL-12引起的Th1細胞分化是由JAK2和STAT4介導；IL-4引起的Th2細胞分化由JAK1/3和STAT6介導；JAK2/STAT3通過調(diào)節(jié)維A酸相關(guān)孤兒素受體γt(retinoid acid related orphan receptor γt，RORγt)和IL-23R轉(zhuǎn)錄因子的表達，影響Th17細胞的分化；JAK1/2和STAT1調(diào)控IFN-γ對巨噬細胞的作用；另外，JAK1/2和STAT3與IL-6家族信號相關(guān)[12]。全基因組相關(guān)研究表明，基因編碼的JAK/STAT通路中的成分在MS患者中顯著表達[13]。在EAE 發(fā)病過程中，STAT1、STAT3和STAT4被大量激活[12]。

抑制因子(suppressors of cytokine signaling，SOCS)蛋白家族是近來發(fā)現(xiàn)的一類可反饋性阻斷細胞因子信號轉(zhuǎn)導過程的負性調(diào)節(jié)因子，對JAK/STAT 途徑具有負反饋調(diào)節(jié)作用。Frisullo等[14]研究發(fā)現(xiàn) MS的復發(fā)與SOCS3的降低和STAT3激活增加有關(guān)。與普通EAE小鼠相比，具有轉(zhuǎn)基因表達SOCS3樹突細胞的EAE小鼠疾病嚴重程度下降，并且Th1和Th17細胞的分化受限，Th2細胞分化增加[15]。有研究表明辛伐他汀可直接以MS患者的樹突狀細胞為靶點，誘導SOCS1和SOCS3的表達, 減少STAT1和STAT3的活化，從而減少樹突狀細胞表達IL-1、IL-23、TGF-β、IL-21和IL-12水平，為Th1和Th17的分化提供了抑制性內(nèi)環(huán)境[16]。這一發(fā)現(xiàn)為治療MS提供了新思路。

3Nrf2/ARE 通路

氧化應激在神經(jīng)脫髓鞘疾病中扮演至關(guān)重要的角色，Nrf2/ARE通路因其減輕氧化應激的作用而備受關(guān)注。

Nrf2是細胞抗氧化應激中調(diào)節(jié)各種抗氧化應激酶表達的關(guān)鍵因子，由 Neh1～Neh6 結(jié)構(gòu)閾組成，其中 Neh1 上含有特有的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(basic leucine zipper，bZIP)，可與抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合；Neh2 可與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap-1)高度緊密結(jié)合[17]。氧化應激等可導致Nrf2與Keap-1解離和釋放，Nrf2與Keap-1解離后轉(zhuǎn)位進入細胞核，進而和ARE結(jié)合，啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄。

Nrf2誘導的下游靶基因HO-1是重要的抗炎酶，其抗炎機制被認為是增加一氧化碳水平和抑制巨噬細胞的活性[18]。Nrf2激活劑可使Nrf2/ARE通路激活，增加HO-1、NQO-1等抗氧化酶或抗氧化物的表達。應用萊菔硫烷對EAE小鼠進行干預發(fā)現(xiàn)，其可增強Nrf2的活性，增加HO-1和NQO-1的表達，并且腦內(nèi)氧化應激的衡量指標丙二醛水平有所下降[19]。

以Nrf2為靶點的藥物有望用于MS等多種疾病的治療，其中富馬酸二甲酯已進入Ⅲ期臨床研究。

4AMPK信號通路

在MS中，周圍免疫細胞穿過血-腦脊液屏障進入CNS，形成炎性微環(huán)境。AMPK可調(diào)節(jié)炎性反應因子基因的表達。Meares等[20]研究發(fā)現(xiàn)AMPK的激活可減少INF-γ誘導的細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。INF-γ通過STAT1的激活來調(diào)控基因表達，敲除AMPK可導致STAT1的基礎表達明顯增加，INF-γ誘導的炎性因子也會增加，包括TNF-α、CXC趨化因子配體10(CXC chemokine ligand 10，CXCL10)和CC趨化因子配體2(CC chemokine ligand 2，CCL2)。相反，AMPK的激活可阻礙INF-γ誘導的STAT1的表達。表明AMPK通過調(diào)控INF-γ/STAT1軸影響病情。EAE小鼠在發(fā)病初期及發(fā)病高峰時，AMPK信號通路活動下調(diào)，CNS內(nèi)INF-γ及CCL2表達增加。AMPK興奮劑AICAR或二甲雙胍可減輕EAE病情，表明AMPK在EAE中為保護性因素。另有研究表明AMPK可以通過抑制STAT3的磷酸化調(diào)控IL-6的表達[21]。

5TLRs/NF-κB通路

TLRs是機體啟動天然免疫的關(guān)鍵,并在天然免疫與獲得性免疫之間架起橋梁。研究TLRs在MS和EAE中的作用,對尋找MS治療的新靶點有著重要意義。

TLRs一旦被病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecule patterns，PAMPs)激活,即可觸發(fā)細胞信號級聯(lián)，最終激活NF-κB的信號途徑從而激活細胞，啟動一系列免疫炎性反應。NF-κB可介導IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ等各種細胞因子的分泌，與自身免疫性脫髓鞘疾病和其他神經(jīng)變性疾病的發(fā)生有密切聯(lián)系。TLR2和TLR4可誘導IL-1、IL-6和IL-12的產(chǎn)生，這些細胞因子促使初始T細胞向Th1和Th17分化，并分別分泌INF-γ和IL-17。IL-17/INF-γ誘導淋巴細胞通過血-腦脊液屏障，造成CNS損傷。在MS患者的腦組織和腦脊液中可發(fā)現(xiàn)多種TLR2配體[22]。

在TLRs信號傳導途徑中,髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)的激活是其關(guān)鍵。van Loo等[23]研究發(fā)現(xiàn)，完全抑制MyD88依賴途徑中NF-κB的上游激活物NF-κB必需調(diào)控因子(NF-κB essential modulator，NEMO)可改善EAE小鼠CNS炎性反應和組織病理損傷。抑制NF-κB可阻止促炎性細胞因子、趨化因子以及血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)的表達。

6Rho/ROCK通路

Rho在介導抑制軸突再生、增加血-腦脊液屏障通透性過程中起重要作用。Rho是ROCK最直接的上游刺激信號，肌球蛋白及內(nèi)收蛋白等是ROCK主要的下游靶分子，ROCK激活可促進肌絲收縮。

ROCK信號通路激活后，可調(diào)節(jié)細胞骨架的重組，為細胞遷移提供動力，促進內(nèi)皮細胞骨架蛋白收縮, 使血-腦脊液屏障通透性增加。T淋巴細胞穿過血-腦脊液屏障，攻擊髓鞘造成脫髓鞘改變。炎性細胞通過血-腦脊液屏障遷移到中樞神經(jīng)組織的過程是CNS 炎性脫髓鞘病發(fā)生的關(guān)鍵始動因素[24]。這表明Rho/ROCK信號通路推動了EAE的疾病進展。ZHANG等[25]研究發(fā)現(xiàn)，反應性巨噬細胞和 T細胞是RhoA的重要細胞來源，RhoA調(diào)控巨噬細胞和 T細胞在EAE中的功能。由此推測RhoA以及ROCK表達上調(diào)在EAE發(fā)病過程中起重要作用。

7自噬相關(guān)通路

研究證明，自噬與自身免疫性脫髓鞘有關(guān)，特別是自噬相關(guān)基因5(autophagy related gene 5，Atg5)可調(diào)節(jié)T細胞的存活和分化。Atg5在MS患者腦組織中過度表達，并且外周血中Atg5水平與臨床病情嚴重程度呈正相關(guān)。另外研究發(fā)現(xiàn)EAE小鼠T細胞中Atg5 mRNA水平增高[26]。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素蛋白受體(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin receptor，PI3K/Akt/mTOR)是調(diào)節(jié)自噬的重要通路。PI3K是Akt/mTOR信號通路的上游分子，可以分為兩種類型，I型PI3K活化時通過激活Akt/mTOR信號通路負性調(diào)節(jié)自體吞噬，Ⅲ型PI3K活化時激活Beclin-1，啟動自噬進程。當細胞受生長因子等刺激后，PI3K活化，進而磷酸化其底物3,4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)使其轉(zhuǎn)化為3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)與同源性底物蛋白質(zhì)結(jié)合后使Akt磷酸化，Akt磷酸化激活后，使結(jié)節(jié)性硬化復合物2(tuberous sclerosis complex 2，TSC2)磷酸化，繼而阻止TSC1/2 復合物形成，激活mTOR復合物1(mTORC1)，mTORC1激活后通過磷酸化Atg13，導致其不能與Atg1 結(jié)合，從而阻斷自噬[27]。

雷帕霉素通過抑制mTORC1而激活自噬，并且雷帕霉素可以緩解EAE/MS病情。而在MS患者中自噬相關(guān)基因Atg5高表達，表明自噬活躍。有關(guān)自噬在MS中的具體機制及雷帕霉素影響MS的詳細機制仍需進一步闡明。

綜上所述，MS的發(fā)病機制復雜，多種信號通路參與其中，并形成了相互交叉的復雜信號通路網(wǎng)絡。這些信號通路可為MS的治療提供新的靶點，具有重要的研究意義。是否還有未發(fā)現(xiàn)的信號通路，多種通路之間的相互關(guān)系是什么及多靶點的治療效果如何，這些問題尚未明確，仍需進行大量基礎和臨床研究。

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(本文編輯：時秋寬)

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.01.015

通訊作者：郭力，Email：guoli6@163.com

中圖分類號：R744.5+1

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2963 (2016)01-0058-05

(收稿日期：2015-07-02)