干擾素-γ增強(qiáng)RAW264.7巨噬細(xì)胞對(duì)阿薩希毛孢子菌殺傷作用的機(jī)制研究

聶建巍，楊蓉婭，叢 林，王文嶺，夏志寬，李海濤

近年來(lái)，由于免疫抑制劑以及廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，器官移植、腫瘤的放療、化療以及侵入性治療的增加，播散性毛孢子菌病的報(bào)道越來(lái)越多[1-3]。隨著唑類和兩性霉素B等抗真菌藥物的大量應(yīng)用，又使真菌耐藥的問(wèn)題日趨嚴(yán)重，給抗真菌治療帶來(lái)新的挑戰(zhàn)[4]。中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)在抵御病原體的入侵中起著重要的防御作用。其中，單核-巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是機(jī)體抗感染的主要防線。深部真菌感染與機(jī)體免疫防御和免疫狀態(tài)之間有著密切的關(guān)系，而細(xì)胞因子在深部真菌感染發(fā)展過(guò)程中，起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，因此，免疫調(diào)節(jié)治療近年來(lái)也逐漸成為深部真菌感染治療的熱點(diǎn)問(wèn)題。干擾素-γ （IFN-γ）是輔助性T細(xì)胞（Th1細(xì)胞）分泌的一種細(xì)胞因子，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞及分子水平探討IFN-γ對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞（Macrophage，Mφ）體外抗阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）活性的影響，以此來(lái)闡述IFN-γ在抗T.asahii感染中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與菌株

小鼠單核/巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞株由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心提供。T. asahii株為北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍皮膚病診治中心-80℃保存的T. asahii臨床分離株（編號(hào)：BZP07005），經(jīng)API 20CAUX系統(tǒng)生化鑒定及DNA序列分析鑒定證實(shí)(AS2.2174)[5]。

1.2 主要試劑

小鼠重組 IFN-γ（PeproTech，1×107U/mg），快速瑞氏-吉姆薩染液（南京建成科技有限公司），胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物工程材料有限公司），胰酶細(xì)胞消化液（0.25%Trypsin-EDTA Solution）（碧云天生物技術(shù)有限公司），Trixon-100（sigma公司），細(xì)胞培養(yǎng)基采用DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司），NO檢測(cè)試劑盒，超氧化物檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 T.asahii傳代、培養(yǎng) 將-80℃保存的T. asahii臨床分離株轉(zhuǎn)種于固體沙氏培養(yǎng)基，傳代3次純培養(yǎng)，挑取一接種環(huán)的T.asahii臨床株接種于液體YPD培養(yǎng)基中，37℃、150r/min搖床培養(yǎng)8h，6000rpm離心，5min收集孢子，PBS(pH7.0)洗滌3次，然后用DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整到1×106個(gè) /ml。

1.3.2 Mφ的分離、培養(yǎng) RAW264.7巨噬細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基和10%FBS培養(yǎng)3天后，棄培養(yǎng)液，以胰酶-EDTA消化，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，傳代2次后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，1000r/min離心5min后，棄上清，用PBS洗2遍，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，快速瑞氏-吉姆薩染液染色證實(shí)為巨噬細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù)＞95%，計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml。

1.3.3 待測(cè)上清液的制備 96孔板，分為實(shí)驗(yàn)組及巨噬細(xì)胞對(duì)照組。每孔加巨噬細(xì)胞懸液100μl，3h后用預(yù)熱的PBS洗2遍，繼續(xù)向?qū)嶒?yàn)組每孔中加入終濃度分別為10、100、1000U/ml的IFN-γ，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，棄舊液，用培養(yǎng)基洗2遍，每孔加T.asahii細(xì)胞懸液100μl，培養(yǎng)4h，取上清100μl，轉(zhuǎn)移到另一96孔板，然后置于-80℃冰箱待檢。

1.3.4 不同濃度INF-γ作用后巨噬細(xì)胞抗T.asahii活性測(cè)定 將上述96孔板剩余的上清液體系中每孔加入2%的TritonX-100 100μl，10min后混勻，從每孔吸出10μl懸液，稀釋100倍后取200μl加到15ml、50℃左右的沙氏培養(yǎng)基中，搖勻，待凝后倒置培養(yǎng)48h，觀察每個(gè)平皿的菌落數(shù)，計(jì)算每毫升CFU及T.asahii生長(zhǎng)抑制率?？瞻讓?duì)照組不加Mφ及IFN-γ，其余同上[6]。

每毫升T.asahii菌落形成單位(CFU/ml)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)(100)×5；T.asahii生長(zhǎng)抑制率=（空白對(duì)照組平均CFU/ml-實(shí)驗(yàn)組平均CFU/ml）/空白對(duì)照組平均CFU/ml×100%

1.3.5 上清液中亞硝酸根離子（NO2-）的檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)參照Ding[7]方法，-80℃冰箱取出待測(cè)上清液，恢復(fù)至室溫，用含10%FBS的RPMI1640 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品1mol/L NaNO2溶液，使其濃度分別為0、1、2、5、10、20、40、60、100μmol/L，每孔依次加 GriessⅠ試劑50μl，GriessⅡ試劑50μl，室溫放置10min，在全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀上550nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸收度值。以濃度值(C)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果：A=0.052+0.016C，r2=0.999。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線， 由A值求得相應(yīng)的C值，結(jié)果以μMNO2-/106MΦ表示。

1.3.6 上清液中超氧陰離子（O2-）的檢測(cè) 上清液中每孔依次加入終濃度為（10、100、1000U/ml）的IFN-γ，共同孵育18h，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌一次。每孔依次加入超氧化物檢測(cè)緩沖液200μl、WST-1溶液10μl，將產(chǎn)生的超氧化物還原成橙色的有色物，Catalase溶液2μl清除過(guò)氧化氫等過(guò)氧化物對(duì)WST-1顯色的干擾，37℃孵育3min，再加入內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）、菌液共同在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育90min后檢測(cè)超氧化物陰離子O2-。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以X ± S表示，采用SPSS 16.0軟件作整體F 檢驗(yàn)提示方差齊，用單因素方差分析（ANOVA）中的Bonferroni法進(jìn)行各組均數(shù)間的兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度IFN-γ對(duì)RAW264.7細(xì)胞抗T.asahii活性的影響（表1）

各實(shí)驗(yàn)組與Mφ對(duì)照組比較P＜0.01，結(jié)果表明：隨著lFN-γ濃度的增加，T.asahii生長(zhǎng)抑制率增加，其效應(yīng)為劑量依賴性。

表1 Mφ在不同濃度IFN-γ中抗T.asahii的活性

2.2 上清液中亞硝酸根離子(NO2-)檢測(cè)結(jié)果(表2)

lFN-γ的濃度分別為 10、100、1000U/ml時(shí)，測(cè)得上清液中NO2-的濃度，分別為89.16±3.32、108.07±3.81、126.44±3.52，與空白對(duì)照組（74.47±1.48）相比組間具有顯著性差異(P＜0.01)。

2.3 上清液中超氧陰離子(O2-)的檢測(cè)結(jié)果(表2)

lFN-γ的濃度分別為10、100、1000U/ml時(shí)，測(cè)得上清液中的O2-分別為0.317±0.006、0. 424±0.006、0.518±0.006，與空白對(duì)照組（0. 222±0.008）相比均具有顯著性差異 (P＜0.01)。

表2 不同濃度IFN-γ對(duì)巨噬細(xì)胞抗T.asahii產(chǎn)生NO及O2-的影響

3 討論

巨噬細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞在抵抗感染中起著關(guān)鍵作用，它通過(guò)調(diào)理素（特異性抗體、補(bǔ)體、甘露聚糖結(jié)合蛋白）和非調(diào)理素（甘露聚糖受體、葡聚糖受體等）依賴的機(jī)制吞噬病原體，并產(chǎn)生多種效應(yīng)分子殺傷病原體。若巨噬細(xì)胞不能利用這些機(jī)制將病原體吞噬、殺傷，就會(huì)使病原體逃逸，造成慢性感染[8]。

IFN-γ生物學(xué)活性廣泛，在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，臨床上用來(lái)抗病毒、抗腫瘤、治療過(guò)敏性皮炎(AD)、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)[9]、抗肝纖維化[10]等。有研究表明宿主免疫細(xì)胞在病原體感染過(guò)程中被激活，IFN-γ通過(guò)激活Mφ，活化的巨噬細(xì)胞在NADPH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）氧化酶的催化作用下將分子氧還原成O2-，在鐵離子的催化下，形成羥自由基，后者與鹵化物反應(yīng)形成活性氧介質(zhì)（reactive oxygen intermediate，ROI）進(jìn)一步氧化病原體胞膜上的氨基酸，從而殺傷病原體[11]。還有研究表明，Mφ內(nèi)的誘生型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）可利用精氨酸、分子氧及NADPH作為底物催化產(chǎn)生一氧化氮（NO），NO的存在形式不穩(wěn)定，其合成后很快被氧化成NO2-，通常以亞硝酸根的形式存在于細(xì)胞外液。NO及其衍生物統(tǒng)稱為活性氮介質(zhì)（reactive nitrogen intermediates，RNI），對(duì)多種病原體具有殺傷作用[12]?？傊?，IFN-γ能激活巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其胞內(nèi)殺菌酶活性增強(qiáng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生O2-和NO等強(qiáng)烈殺菌物質(zhì)，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原體的抵抗力[13-15]。

以往的研究提示IFN-γ可增強(qiáng)對(duì)煙曲霉、白念珠菌等病原真菌的殺傷作用[16]，Lyman等[17]的研究顯示，IFN-γ預(yù)孵育可明顯增強(qiáng)單核細(xì)胞殺傷T.asahii的活性，我們的結(jié)果證實(shí)了IFN-γ可明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抵抗T.asahii感染的活性。本實(shí)驗(yàn)參照Ding[7]方法，用Griess反映測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO2-以反映NO的濃度變化。IFN-γ在( 1～ 1000U/ml)不同濃度組產(chǎn)生NO 的濃度隨著IFN-γ濃度的升高而升高，兩者呈劑量依賴的關(guān)系。T.asahii與1000U/ml的IFN-γ共孵育后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的產(chǎn)生明顯增多，Mφ表現(xiàn)出高效的殺傷T.asahii的活性。本實(shí)驗(yàn)研究提示：隨著IFN-γ濃度的升高，T.asahii的生長(zhǎng)抑制率增加。IFN-γ增強(qiáng)Mφ殺傷T.asahii的作用機(jī)制與NO和O2-產(chǎn)生增多有關(guān)。

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